謝雪梅 任 仟 羅鴻博 馬鳳霞 （中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所，實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，細(xì)胞生態(tài)海河實(shí)驗(yàn)室，天津300020）

近年來，越來越多的研究證明中性粒細(xì)胞具有異質(zhì)性，全面、深入地解析細(xì)胞的異質(zhì)性需要了解群體中每個(gè)細(xì)胞基因表達(dá)的詳細(xì)信息［1-3］。但是，傳統(tǒng)的批量測序會(huì)同時(shí)處理成千上萬個(gè)細(xì)胞，得到群體基因表達(dá)的平均值。單細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可以揭示每個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)，通過找到細(xì)胞的特異高表達(dá)基因，進(jìn)一步挖掘已知細(xì)胞類型的異質(zhì)性甚至發(fā)現(xiàn)全新的細(xì)胞類型［4-5］。而且，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析的過程可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行無監(jiān)督分群，這種新型的減少人為因素干擾的分群方法可以用統(tǒng)一及嚴(yán)格的原則定義不同的免疫細(xì)胞類型和不同免疫應(yīng)答下的細(xì)胞狀態(tài)［6］。因此，從單細(xì)胞水平研究中性粒細(xì)胞生理及病理?xiàng)l件下的異質(zhì)性，揭示各發(fā)育階段、各器官中性粒細(xì)胞亞群及其演變關(guān)系，將推動(dòng)整個(gè)中性粒細(xì)胞領(lǐng)域的發(fā)展，甚至發(fā)現(xiàn)新的中性粒細(xì)胞亞型。近年來，中性粒細(xì)胞異質(zhì)性的研究取得了顯著進(jìn)展，本綜述將總結(jié)中性粒細(xì)胞異質(zhì)性的進(jìn)展并重點(diǎn)闡述在單細(xì)胞水平解析中性粒細(xì)胞異質(zhì)性的研究，最后討論中性粒細(xì)胞產(chǎn)生異質(zhì)性的可能機(jī)制。

1 中性粒細(xì)胞發(fā)育、成熟、衰老及死亡

中性粒細(xì)胞來源于骨髓中的造血干祖細(xì)胞，一個(gè)正常成人骨髓每天產(chǎn)生1×1011～2×1011個(gè)中性粒細(xì)胞，而一只成年小鼠骨髓每天產(chǎn)生1×107個(gè)中性粒細(xì)胞［7］。中性粒細(xì)胞的成熟經(jīng)歷了從原始粒細(xì)胞、早幼粒細(xì)胞、中幼粒細(xì)胞、晚幼粒細(xì)胞、桿狀核和分葉核細(xì)胞的過程。原始粒細(xì)胞、早幼粒細(xì)胞、中幼粒細(xì)胞均可以通過有絲分裂而增殖，晚幼粒細(xì)胞、桿狀核和分葉核細(xì)胞不能進(jìn)行有絲分裂［8］。

在中性粒細(xì)胞的不同發(fā)育階段，有不同的顆粒出現(xiàn)，這些顆粒中含有特定的蛋白來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［9-10］。原始粒細(xì)胞無顆粒形成，早幼粒細(xì)胞出現(xiàn)嗜天青顆粒（初級(jí)顆粒）。中幼粒和晚幼粒細(xì)胞出現(xiàn)特異顆粒（二級(jí)顆粒），而明膠酶顆粒（三級(jí)顆粒）在晚幼粒細(xì)胞向桿狀核轉(zhuǎn)變過程中形成，分泌微泡僅存在于分頁核細(xì)胞中。嗜天青顆粒含有豐富的髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）和一系列抗菌肽。另外，嗜天青顆粒包含絲氨酸蛋白酶如蛋白酶3（proteinase 3，PR3），組織蛋白酶、彈性蛋白酶（neu?trophil elastase，NE）等，以上蛋白酶除了能夠水解細(xì)胞外基質(zhì)成分，還具有殺菌功能［11］。更有意思的是，發(fā)現(xiàn)蛋白PR3 和NE 通過剪切caspase 3 和焦亡的執(zhí)行蛋白Gasdermin D 在中性粒細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要的作用［12-13］。乳鐵蛋白是特異顆粒的主要成分，通過結(jié)合鐵離子，能破壞細(xì)菌壁從而具有直接的殺菌活性。特異顆粒的另一成分是中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（neutrophil gelatinase as?sociated lipocalin，NGAL），與乳鐵蛋白具有協(xié)同抗菌作用。明膠酶顆粒的主要成分有明膠酶和精氨酸酶。關(guān)于中性粒細(xì)胞顆粒蛋白的形成，目前研究者們公認(rèn)的解釋是“生物合成的時(shí)間決定（targeting by timing of biosynthesis）”假說［14］。該假說認(rèn)為同一顆粒中的不同顆粒蛋白同時(shí)開始合成，同時(shí)合成結(jié)束，即同一發(fā)育階段產(chǎn)生的顆粒蛋白會(huì)儲(chǔ)存在相同的顆粒里。

成熟的中性粒細(xì)胞從骨髓內(nèi)被釋放至外周血受基質(zhì)來源的細(xì)胞因子（stromal derived factor-1，SDF-1）及其受體CXCR4調(diào)節(jié)，骨髓成熟中性粒細(xì)胞中低表達(dá)CXCR4，從而被動(dòng)員到外周血。而衰老的中性粒細(xì)胞上調(diào)表達(dá)CXCR4［15］。目前研究者們認(rèn)為衰老的中性粒細(xì)胞是一個(gè)具有特定表型的中性粒細(xì)胞亞群，它們下調(diào)表達(dá)L-選擇素，細(xì)胞體積變小及分葉核增多，整合素激活增加、形成胞外陷阱（neutrophil extracellular trap，NET）的能力增強(qiáng)［16］。有意思的是，中性粒細(xì)胞的衰老受晝夜節(jié)律的影響，早上8：30（zeitgeber time 13，ZT13）機(jī)體外周血的衰老中性粒細(xì)胞數(shù)量最少，中午12：30（ZT5）外周血中衰老中性粒細(xì)胞數(shù)量最多［17］。研究人員還發(fā)現(xiàn)微生物可以通過Toll樣受體和MyD88介導(dǎo)的信號(hào)途徑誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞衰老，清除微生物能夠顯著減少循環(huán)中衰老的中性粒細(xì)胞數(shù)量，并能夠改善感染引起的器官損傷［18］。循環(huán)中衰老的中性粒細(xì)胞最終被募集到骨髓從而被骨髓巨噬細(xì)胞清除，細(xì)胞衰老可能是中性粒細(xì)胞異質(zhì)性形成的原因之一。

中性粒細(xì)胞最顯著的特征是壽命短，一般認(rèn)為中性粒細(xì)胞在血液循環(huán)中的壽命只有7～20 h，但是，最近的一項(xiàng)研究表明人的中性粒細(xì)胞在體內(nèi)可以存活5.4 d［19］。長期以來研究者普遍認(rèn)為中性粒細(xì)胞自發(fā)死亡的方式是凋亡，最近發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞的自發(fā)死亡方式還有裂解性死亡，而且受Gasdermin家族蛋白的調(diào)控［13］。中性粒細(xì)胞死亡方式和速率的不同也可能是中性粒細(xì)胞異質(zhì)性形成的原因，而且，通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，本課題組發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞自發(fā)死亡過程中可以產(chǎn)生不同的亞群，這些亞群特異高表達(dá)的基因可富集到不同的死亡信號(hào)通路。

2 生理狀態(tài)下中性粒細(xì)胞的異質(zhì)性

生理狀態(tài)下，除了骨髓、外周血、脾臟和肺，其他組織的中性粒細(xì)胞數(shù)量較少。骨髓儲(chǔ)存了大量的成熟中性粒細(xì)胞，這些細(xì)胞在組織損傷或急性炎癥時(shí)被大量動(dòng)員至外周血，進(jìn)而到達(dá)外周組織發(fā)揮作用。KIM等［20］采用流式分析在骨髓中發(fā)現(xiàn)了一群中性粒前體細(xì)胞，這群細(xì)胞的表型為lin-c-Kit+CD11b+Ly6GloLy6BintCD115-Gfi1+，被命名為NeuP，具有增殖潛能，在體內(nèi)、體外均能分化為成熟的中性粒細(xì)胞并能發(fā)揮殺菌功能。在小鼠的肺臟，大部分中性粒細(xì)胞位于肺毛細(xì)血管的邊緣，微生物感染時(shí)它們能快速被趨化至感染部位［21］。在小鼠脾臟中，不成熟的中性粒細(xì)胞是不能游動(dòng)的，而成熟的中性粒細(xì)胞在紅髓發(fā)揮偵察兵的作用。更有意思的是，在人脾臟的邊緣區(qū)，中性粒細(xì)胞獲得了能刺激B 細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白的特征，被稱為輔助B 細(xì)胞的中性粒細(xì)胞［22］。以上研究說明組織中的中性粒細(xì)胞具有免疫哨兵的作用并獲得了組織特異的特征，骨髓、外周血、脾臟和肺臟的中性粒細(xì)胞之間的異同點(diǎn)和相互關(guān)系還是未知。

本課題組對(duì)小鼠生理狀態(tài)下的骨髓、外周血和脾臟的中性粒細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞RNA 測序，并結(jié)合生物信息學(xué)方法建立了生理狀態(tài)下中性粒細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜［23］。按照發(fā)育成熟的順序，骨髓中的中性粒細(xì)胞可以分為5 群，包括3 個(gè)處于分裂階段的亞群（G0、G1、G2）和2 個(gè)分裂后的較成熟亞群（G3、G4）。還分析了外周血及脾臟中的中性粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)外周器官中主要存在3個(gè)具有不同轉(zhuǎn)錄組特征的成熟中性粒細(xì)胞亞群，G5a、G5b和G5c，其中，G5b高表達(dá)IFN 刺激相關(guān)基因（interferon stimulated gene，ISG），而且在脾臟中有獨(dú)特的空間分布，提示該亞群可能具有不同于其他亞群的宿主防御功能。除了小鼠，本課題組還證明生理狀態(tài)下人外周血也包含3個(gè)亞群，以及人G5b也高表達(dá)ISG。

傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為中性粒細(xì)胞顆粒蛋白的分布由合成的時(shí)間決定，但是該觀點(diǎn)逐漸受到質(zhì)疑。本課題組發(fā)現(xiàn)抗菌肽CAP-18的基因Camp主要表達(dá)于二級(jí)顆粒形成的G2 和G3 群，同時(shí)，基因Camp也表達(dá)于主要包含三級(jí)顆粒的G4 群?；騆cn2是二級(jí)顆粒蛋白NGAL 的基因，也在G4細(xì)胞群高表達(dá)。明膠酶被認(rèn)為僅僅存在于二級(jí)顆粒，但是，在單細(xì)胞水平明膠酶的基因Mmp8在G4 細(xì)胞群高表達(dá)，幾乎不表達(dá)于G2 細(xì)胞群。根據(jù)上述顆粒蛋白基因在亞群之間表達(dá)的差異，本課題提出了顆粒蛋白產(chǎn)生的“分選假說”（sorting mechanism）。雖然蛋白是細(xì)胞生命活動(dòng)的執(zhí)行者，最近研究表明在中性粒細(xì)胞發(fā)育過程中，高達(dá)70%的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)趨勢一致［24］。

有一些研究在單細(xì)胞水平分析中性粒細(xì)胞及其前體細(xì)胞的異質(zhì)性，這些研究側(cè)重點(diǎn)不同，但是從不同角度解析了中性粒細(xì)胞的異質(zhì)性。2016 年，OLSSON等［25］對(duì)造血干細(xì)胞（LSK），共同髓系祖細(xì)胞（CMP）粒-單核祖細(xì)胞（GMP）和CD34+LK（linageckit+）細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序，把Olsson的測序數(shù)據(jù)與本課題組數(shù)據(jù)進(jìn)行了比對(duì)，證明LSK 和CMP的基因表達(dá)模式與G0 群一致，GMP 包含G1 群，而CD34+LK 細(xì)胞包含大約20%的G2 群細(xì)胞。2018 年GILADI 等［26］對(duì)骨髓中性粒細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，他們定義了兩個(gè)中性粒細(xì)胞組stageⅠ和stageⅡ，把Giladi 的測序數(shù)據(jù)與本研究組的數(shù)據(jù)進(jìn)行了比對(duì)，相關(guān)性分析揭示stageⅠ中性粒細(xì)胞主要是G2～G4 群，而stageⅡ中性粒細(xì)胞是G4 和G5 群的混合。2018 年，利用質(zhì)譜流式和細(xì)胞增殖活性分析并結(jié)合生物信息學(xué)分析，EVRARD 等［27］發(fā)現(xiàn)骨髓內(nèi)存在 3種中性粒細(xì)胞亞群：preNeu、immNeu和mNeu。preNeu 低表達(dá)c-Kit，具有增殖活性，表達(dá)一級(jí)和二級(jí)顆粒蛋白。immNeu 低表達(dá)CXCR2，不具有增殖活性，高表達(dá)二級(jí)顆粒蛋白。mNeu 高表達(dá)CXCR2并高表達(dá)三級(jí)顆粒蛋白。這3種中性粒細(xì)胞亞群與本課題組發(fā)現(xiàn)的G1/G2、G3、G4 中性粒細(xì)胞相對(duì)應(yīng)。同年，借助質(zhì)譜流式和單細(xì)胞RNA 測序，ZHU 等［28］在小鼠和人的骨髓鑒定了一種具有增殖活性的單能中性粒祖細(xì)胞，這種祖細(xì)胞又可以進(jìn)一步分為兩個(gè)細(xì)胞群，早期ckit+Gfi1lowCebpahiLy6Glow祖細(xì)胞群具有干細(xì)胞的特征而晚期ckit+Gfi1lowCebpalowLy6G+祖細(xì)胞群與EVRARD 等［27］發(fā)現(xiàn)的preNeu 非常相似。2020 年，KWOK 等［29］通過結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)GMP 具有異質(zhì)性并揭示GMP 包含一種單能中性粒前體細(xì)胞并將其命名為proNeu。proNeu 根據(jù)表型又可以分為proNeu1 亞群（CD34hiCD106-CD11blo）和proNeu2亞群（CD34loCD106+CD11bhi），基于分化等級(jí)的分析，進(jìn)一步確定了pro?Neu1 可以分化為proNeu2，ProNeu2 可以分化為pre?Neu 和immNeu，而且proNeu 與本研究組定義的G1群具有很好的相關(guān)性。整合以上對(duì)中性粒細(xì)胞多組學(xué)的研究，按照發(fā)育成熟的順序，骨髓中發(fā)育階段的中性粒細(xì)胞可以分為proNeu、preNeu、immNeu和mNeu。

3 急性炎癥時(shí)中性粒細(xì)胞的異質(zhì)性

急性炎癥時(shí)，骨髓中的中性粒細(xì)胞被大量動(dòng)員至外周組織，外周組織中增加的中性粒細(xì)胞是否具有組織特異性有待深入研究。受因子G-CSF動(dòng)員的人外周血含有CD66b+CD10+成熟中性粒細(xì)胞和CD66b+CD10-不成熟中性粒細(xì)胞，成熟的細(xì)胞抑制T 細(xì)胞的增殖和IFN-γ 的產(chǎn)生，相反，不成熟的細(xì)胞促進(jìn)T 細(xì)胞的增殖和IFN-γ 的產(chǎn)生［30］。與G-CSF 類似，低劑量LPS 注射后3 h，人外周血循環(huán)的中性粒細(xì)胞出現(xiàn)3種形態(tài)和表型不同的亞群，分別為桿狀核（CD16dim/CD62Lbright）、多分葉核（CD16bright/CD62Ldim）、正常分葉核（CD16bright/CD62Lbright），其中CD16bright/CD62Ldim亞群抑制淋巴細(xì)胞激活［31］。2018 年LE?LIEFELD 等［32］發(fā)現(xiàn)，在急性細(xì)菌感染時(shí)，人外周血有一群CD16bright/CD62Ldim的多頁核中性粒細(xì)胞吞噬細(xì)菌的能力明顯低于其他細(xì)胞，相反，CD16dim的桿狀核中性粒細(xì)胞吞噬較多的細(xì)菌，以上發(fā)現(xiàn)表明急性感染時(shí)人外周血存在抗菌能力不同的中性粒細(xì)胞亞群。

2004 年一篇研究發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)的中性粒細(xì)胞可以分為3 種亞群，PMN-N、PMN-Ⅰ和PMN-Ⅱ，PMN-Ⅰ存在于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）抵抗的小鼠，而PMN-Ⅱ存在于MRSA 敏感的小鼠，PMN-N 存在于無細(xì)菌感染的小鼠中［33］。它們具有不同的表型：PMN-Ⅰ為CD49d+CD11b-，PMN-Ⅱ?yàn)镃D49d-CD11b+，PMN-N 為CD49d-CD11b-。它們分泌的細(xì)胞因子也不同，PMN-Ⅰ主要分泌IL-12/CCL3，PMN-Ⅱ主要分泌IL-10/CCL2，而PMN-N 不分泌細(xì)胞因子。2016 年Blood 上的一篇研究證明LPS誘導(dǎo)的腹膜炎小鼠，循環(huán)及腹腔中性粒細(xì)胞ICAM表達(dá)增加，ICAM 陽性的中性粒細(xì)胞遷移能力不變，吞噬能力增強(qiáng)［34］。

為了更深入地研究急性感染對(duì)中性粒細(xì)胞亞群的影響，本研究組分離了急性腹膜炎小鼠的骨髓、外周血、脾臟及腹腔灌洗液的中性粒細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA 測序和分析。發(fā)現(xiàn)在炎癥狀態(tài)下的中性粒細(xì)胞亞群的核心轉(zhuǎn)錄組特征沒有改變，無新的亞群產(chǎn)生，也沒有已有亞群的消失，但各群體的數(shù)目比例、功能特征、轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和群體轉(zhuǎn)化路徑等發(fā)生了明顯變化。急性腹膜炎時(shí)，PMNb 亞群大量擴(kuò)增，在感染的小鼠脾臟，所有中性粒細(xì)胞一致地分布于紅髓，而PMNb 細(xì)胞主要定位于被膜下區(qū)域，進(jìn)一步證明PMNb 亞群是獨(dú)特的。有意思的是，經(jīng)RNA 速度分析（RNA Velocity），炎癥時(shí)immNeu到PMNa 的轉(zhuǎn)變受到抑制，immNeu 主要分化為成熟的中性粒細(xì)胞。急性感染誘發(fā)中性粒細(xì)胞數(shù)量增加主要是因?yàn)楦绑w的proNeu 分裂增加而不是接近成熟的preNeu，而preNeu 負(fù)責(zé)穩(wěn)態(tài)時(shí)大部分細(xì)胞的增殖?？赡艿慕忉屖?，穩(wěn)態(tài)時(shí)preNeu 的增殖比例已經(jīng)非常高，更前體的proNeu 分裂增加將是促進(jìn)急性粒細(xì)胞產(chǎn)生的更有效的方式。急性炎癥也能明顯縮短分裂后的成熟期使骨髓的中性粒細(xì)胞快速成熟。EVRARD 等［27］也發(fā)現(xiàn)敗血癥時(shí)，preNeu 在骨髓和脾臟中擴(kuò)增并可以被動(dòng)員至血液等外周組織。KWOK 等［29］發(fā)現(xiàn)proNeu1，而非proNeu2，在敗血癥誘導(dǎo)的急性髓系造血時(shí)特異性擴(kuò)增。

4 腫瘤狀態(tài)下中性粒細(xì)胞的異質(zhì)性

越來越多研究表明中性粒細(xì)胞在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用，這些細(xì)胞被稱為腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞（tumor associated neutrophils，TAN）。根據(jù)TAN的表型和功能不同，可以分為抗腫瘤的N1和促腫瘤的N2 亞群［35-36］。IFN-β 和TGF-β 能分別促進(jìn)TAN 極化為Nl 和N2 型。SAGIV 等［37］在腫瘤小鼠和患者的外周血中鑒定出3種不同的循環(huán)中性粒細(xì)胞群：①高密度成熟的、形態(tài)較小的抗腫瘤中性粒細(xì)胞；②低密度成熟的、形態(tài)大的抗腫瘤中性粒細(xì)胞；③低密度未成熟的、細(xì)胞較大的骨髓來源的髓系抑制細(xì)胞（G-MDSC）。低密度中性粒細(xì)胞（low density neutrophils，LDN）包括不成熟的MDSC 和在TGF-β 作用下從高密度中性粒細(xì)胞（high density neutrophils，HDN）轉(zhuǎn)化而來的成熟的細(xì)胞。與HDN相比，LDN 具有弱的遷移、吞噬和活性氧產(chǎn)生能力，強(qiáng)的免疫抑制能力。其中，G-MDSC 是具有免疫抑制功能的未成熟中性粒細(xì)胞，小鼠G-MDSC 的表型是CD11b+Ly6GhiLy6Clo，人G-MDSC 的表型是CD14-CD11b+CD15+（或CD66b+）［38-40］。

研究者對(duì)不同的腫瘤中性粒細(xì)胞做了轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果表明，TAN、G-MDSC 和幼稚中性粒細(xì)胞具備不同的基因表達(dá)譜，與TANs 相比，G-MDSCs 和幼稚的中性粒細(xì)胞非常接近［41］。TANs 顯著下調(diào)與細(xì)胞毒性有關(guān)的基因，相反，許多與免疫相關(guān)的基因和信號(hào)通路，均在G-MDSC中上調(diào)，并在TAN中進(jìn)一步上調(diào)。2019年，利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，ZILIO?NIS 等［42］繪制了小鼠和人肺腫瘤中浸潤髓系細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組圖譜，發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞在人類肺腫瘤中有5 種亞型（hN1～5），而在小鼠肺腫瘤中形成6 種亞群（mN1～6），其中小鼠的3 種亞群（mN4～6）高表達(dá)SiglecF，它們?cè)谀[瘤中高度富集并具有促進(jìn)腫瘤的特性。還發(fā)現(xiàn)hN1 和mN1 主要表達(dá)經(jīng)典的中性粒細(xì)胞標(biāo)志如MMP8、MMP9、S100A8、S100A9，而hN5 和mN5 主要表達(dá)細(xì)胞因子CCL3、CSF1。有趣的是，還發(fā)現(xiàn)hN2 和mN2 是特殊的亞群，它們雖然數(shù)量很少，但是高表達(dá)ISG 如IFIT1、IRF7、RSAD2。

此外，由原發(fā)腫瘤產(chǎn)生的細(xì)胞因子如IL-1β，粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）或粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）可以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞生成促進(jìn)未成熟中性粒細(xì)胞從骨髓釋放到外周血和腫瘤部位［43］。不成熟中性粒細(xì)胞在腫瘤小鼠的脾臟也會(huì)擴(kuò)增，因此，與炎癥類似，癌癥會(huì)觸發(fā)一種“急性”粒細(xì)胞造血，促進(jìn)中性粒細(xì)胞異質(zhì)性的產(chǎn)生［44］。

5 中性粒細(xì)胞異質(zhì)性形成的機(jī)制

在發(fā)育、成熟過程中，不同的發(fā)育階段中性粒細(xì)胞亞群的產(chǎn)生，中性粒細(xì)胞自身的特征如快速衰老、生存期短和跨內(nèi)皮遷移等均能導(dǎo)致中性粒細(xì)胞異質(zhì)性的產(chǎn)生，微環(huán)境和疾病也能改變中性粒細(xì)胞的功能和行為。雖然目前大家認(rèn)為中性粒細(xì)胞是存在異質(zhì)性的，主要的爭議是中性粒細(xì)胞的不同表型是否代表真正的中性粒細(xì)胞亞群，或者僅僅是不同的細(xì)胞狀態(tài)?，F(xiàn)在越來越多的證據(jù)證明，中性粒細(xì)胞的亞群和表型的變化是通過轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳組共同調(diào)節(jié)的。

成熟中性粒細(xì)胞具有獨(dú)特的分葉核形狀，每個(gè)分葉由線性的DNA 鏈接起來，這種致密的結(jié)構(gòu)方便粒細(xì)胞的遷移以及吞噬，并且有利于NETs 的形成［46］。研究表明致密的核結(jié)構(gòu)也限制了中性粒細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活動(dòng)，與其他髓系細(xì)胞相比，成熟中性粒細(xì)胞RNA 的含量較低。以往研究者們認(rèn)為，由于轉(zhuǎn)錄活動(dòng)的不活躍，中性粒細(xì)胞的異質(zhì)性不高。但現(xiàn)階段研究結(jié)果表明，中性粒細(xì)胞基因表達(dá)的重塑發(fā)生在其整個(gè)發(fā)育的過程中［47］。在中性粒細(xì)胞的成熟過程中，數(shù)百個(gè)與生物合成和增殖過程相關(guān)的基因會(huì)下調(diào)，而與顆粒合成、抗菌免疫應(yīng)答等基因會(huì)上調(diào)。值得注意的是，與骨髓未成熟細(xì)胞相比，與抗病毒防御相關(guān)的基因在循環(huán)中性粒細(xì)胞會(huì)特異上調(diào)，表明即使終末分化的中性粒細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄活動(dòng)也是活躍的。再者，表觀遺傳組的變化，比如基因調(diào)控元件、組蛋白和核小體的標(biāo)記也發(fā)生在中性粒細(xì)胞的發(fā)育過程中［48］。人的中性粒細(xì)胞除了轉(zhuǎn)錄組的差異，基因甲基化也存在差異，表明表觀遺傳參與中性粒細(xì)胞基因的表達(dá)調(diào)控［49］。所以，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序、蛋白質(zhì)學(xué)、基因組學(xué)、開放染色質(zhì)學(xué)的多組學(xué)研究的興起，可以更好、更全面地研究中性粒細(xì)胞的發(fā)育和異質(zhì)性等特點(diǎn)。

6 總結(jié)

本綜述總結(jié)了單細(xì)胞水平解析中性粒細(xì)胞異質(zhì)性的研究進(jìn)展，同時(shí)，發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞死亡過程中也存在異質(zhì)性，即死亡的方式和速率不同，本課題組正在利用單細(xì)胞測序研究人和小鼠中性粒細(xì)胞不同死亡階段的轉(zhuǎn)錄組特征并分析不同的中性粒細(xì)胞亞群受哪些死亡相關(guān)基因或信號(hào)途徑的控制，而且將利用感染或無菌性炎癥模型研究死亡方式和速率不同的細(xì)胞亞群對(duì)機(jī)體炎癥程度和防御能力的影響。

由于中性粒細(xì)胞參與很多疾病的病理過程，包括急性、慢性的病原體感染、腫瘤微環(huán)境的構(gòu)建和自身免疫性疾病等，并且會(huì)參與疾病治療如放療和化療后的康復(fù)。所以，越來越多的研究者開始關(guān)注中性粒細(xì)胞的異質(zhì)性。利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序探尋疾病狀態(tài)下中性粒細(xì)胞異質(zhì)性的改變將是研究熱點(diǎn)，因?yàn)槠鋵⒂兄诹私饧膊〔±磉^程和尋找更特異的作用靶點(diǎn)，為疾病的治療提供新思路。但是轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)不能完全解釋細(xì)胞功能，因?yàn)榧?xì)胞功能主要由蛋白決定。所以，結(jié)合單細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組、表觀組和成像技術(shù)將會(huì)是未來的趨勢，能更精確和全面地解析中性粒細(xì)胞的異質(zhì)性。