劉思平 賈蓓 肖忠坤 宋蘭林

高通量測(cè)序技術(shù)(high-throughput sequencing)又稱“下一代測(cè)序”(next-generation sequencing technology,NGS)技術(shù)，能一次并行對(duì)幾十到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定。NGS技術(shù)發(fā)展迅猛，使得測(cè)序成本快速下降，同時(shí)具有全面、快速和準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，因此，它在臨床上迅速得到廣泛應(yīng)用。在婦產(chǎn)與遺傳學(xué)科中，高通量測(cè)序不僅優(yōu)于傳統(tǒng)的產(chǎn)前篩查手段而獲得快速推廣，而且在自然流產(chǎn)、不孕不育甚至婦科腫瘤的檢測(cè)方面發(fā)揮著日益重要的作用。

一、產(chǎn)前遺傳篩查與產(chǎn)前診斷

染色體非整倍體會(huì)造成流產(chǎn)或新生兒智力低下、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩等臨床癥狀，主要包括21三體綜合征(T21)、18三體綜合征(T18)和13三體綜合征(T13)。產(chǎn)前遺傳篩查是預(yù)防三體患兒出生的重要手段。傳統(tǒng)產(chǎn)前篩查僅約80%總檢出率和5%的假陽(yáng)性。無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)(non-invasive prenatal testing， NIPT)是伴隨NGS技術(shù)的發(fā)展而在臨床上廣泛應(yīng)用的新技術(shù)。該技術(shù)利用大規(guī)模平行測(cè)序測(cè)定孕婦外周血中游離的胎兒DNA片段，經(jīng)過生物信息學(xué)分析來判斷每條染色體的所占比例是否偏離正常參考區(qū)間，以此來準(zhǔn)確判定胎兒染色體非整倍體的情況，具有無創(chuàng)、安全、快速和準(zhǔn)確等特點(diǎn)。

Gil等[1]采用Meta分析，結(jié)果顯示NIPT的T21、T18和T13檢出率分別為96.3%、0.13%和91.0%，假陽(yáng)性率分別為0.13%、90.3%和0.23%。Chitty等[2]對(duì)698 500例孕婦進(jìn)行T21分析，結(jié)果顯示NIPT較傳統(tǒng)遺傳篩查可減少3 368例高風(fēng)險(xiǎn)孕婦(≥1/150)的侵入性診斷，避免17例因侵入性診斷導(dǎo)致的流產(chǎn)。除了針對(duì)T21、T18、T13的篩查外，NIPT已經(jīng)在其他染色體數(shù)目異常、染色體微缺失/微重復(fù)綜合征及單基因病檢測(cè)方面表現(xiàn)出巨大潛力。今年7月，美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)發(fā)表聲明：對(duì)于大多數(shù)女性，NIPT可以取代傳統(tǒng)T21、T18和T13篩查，而且還可以用來篩查性染色體非整倍體和某些染色體拷貝數(shù)變異[3]。

染色體微缺失/微重復(fù)是除染色體非整倍體外的另一大類新生兒出生缺陷疾病。此類患兒多數(shù)能正常存活，但出生后表現(xiàn)出不同程度的身體和智力異常。目前，該類疾病已發(fā)現(xiàn)近300種，總發(fā)病率約1/600。常見的染色體微缺失/微重復(fù)有Cir du chat(貓叫)綜合征、Prader-Willi綜合征、Angelman綜合征、Williams綜合征、22q11微缺失綜合征和DiGeorge綜合征等。隨著NGS技術(shù)的發(fā)展，染色體微缺失/微重復(fù)綜合征的產(chǎn)前遺傳篩查將成為NIPT的下一個(gè)臨床應(yīng)用熱點(diǎn)。Wapner等[4]對(duì)22q11.2缺失的檢出率為97.8%，貓叫綜合征(5p缺失)檢出率為100%。Helgeson等[5]對(duì)175 393例孕婦進(jìn)行染色體微缺失篩查，檢出32例DiGeorge綜合征，20例1p36、15q和5p缺失綜合征，總假陽(yáng)性率為0.0017%。Srinivasan等[6]檢出的染色體微缺失/微重復(fù)的最小分別率為300kb。國(guó)際產(chǎn)前診斷協(xié)會(huì)(International Society of Pregnatal Diagnosis，ISPD)于去年8月明確指出NIPT可用于已知的染色體微缺失/微重復(fù)綜合征的檢測(cè)[7]。

二、流產(chǎn)查因

自然流產(chǎn)是婦科的一種常見疾病，多發(fā)生于懷孕早期，其發(fā)生率占全部妊娠的10%～15%，50%以上的自然流產(chǎn)與胚胎染色體異常有關(guān)。美國(guó)婦產(chǎn)科協(xié)會(huì)(American Congress of Obstetricans and Gynecologists，ACOG)、美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)(American Society of Reproductive Medicine，ASRM)和英國(guó)皇家婦產(chǎn)科協(xié)會(huì)(Royal College of Obsterricans and Gynecologists，RCOG)一致倡導(dǎo)要查明流產(chǎn)原因。流產(chǎn)病因的明確診斷，有利于對(duì)該類患者進(jìn)行合理的治療和遺傳咨詢，并能緩解孕婦心理負(fù)擔(dān)，同時(shí)為下一胎的生育提供醫(yī)學(xué)指導(dǎo)。

流產(chǎn)組織傳統(tǒng)核型分析可確定染色體的數(shù)目異常及>5Mb的結(jié)構(gòu)異常，準(zhǔn)確度高且覆蓋全面，是目前染色體疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。但該方法操作繁瑣，具相對(duì)較高的組織培養(yǎng)失敗率(10%～40%)[8]，存在漏診、誤診等情況。NGS不僅可以一次性檢測(cè)全部染色體的數(shù)目，而且可檢測(cè)<5Mb結(jié)構(gòu)異常，覆蓋度更高，更均勻，更精確。Qi等[9]通過NGS檢測(cè)到的染色體微缺失/微重復(fù)分辨率可達(dá)0.1Mb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)核型分析；傳統(tǒng)核型分析平均耗時(shí)22天，而NGS分析需7～10天，大大縮短檢測(cè)時(shí)間；NGS檢測(cè)無需細(xì)胞培養(yǎng)，且可檢測(cè)冷凍樣本，放寬了樣本要求，可作為細(xì)胞培養(yǎng)失敗核型分析的重要補(bǔ)救方法。

三、體外輔助生殖

我國(guó)不育不孕發(fā)病率逐年增長(zhǎng)，體外受精和胚胎移植技術(shù)(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)為無法自然受孕的夫婦帶來希望。然而，胚胎染色體非整倍體是影響IVF-ET成功的重要因素，主要因?yàn)轶w外受精獲得的胚胎通常存在染色體非整倍體，且隨著孕婦年齡越大，風(fēng)險(xiǎn)越高，當(dāng)孕婦年齡達(dá)40歲時(shí)，胚胎染色體非整倍體超過50%。

健康的胚胎是IVF-ET成功的第一步，然而，基于形態(tài)學(xué)的胚胎選擇不能篩查染色體非整倍性，所以植入前遺傳學(xué)篩查/診斷(preimplantation genetic screening/diagnosis,PGS/PGD)越來越受到重視。PGS是指在試管嬰兒助孕過程中，胚胎移植前對(duì)早期胚胎的遺傳物質(zhì)進(jìn)行染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常的分析，以期篩選出染色體正常的胚胎進(jìn)行移植，從而提高妊娠率、降低流產(chǎn)率；PGD主要用于胚胎移植前遺傳缺陷診斷，可有效降低遺傳病患兒出生率，對(duì)臨床體外輔助生殖意義重大。臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，PGS可使接受體外輔助生殖治療的反復(fù)流產(chǎn)患者的流產(chǎn)率從33.5%降低到6.9%[10]，同時(shí)將臨床妊娠率從45.8%提高至70.9%[11]。Yan等[12]利用PGD對(duì)移植胚胎進(jìn)行突變位點(diǎn)、染色體異常以及連鎖分析，成功地幫助遺傳性多發(fā)性骨軟骨瘤患者產(chǎn)下健康后代。

PGS/PGD最早采用單細(xì)胞熒光原位雜交技術(shù)(FISH)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)，只能分析5～10對(duì)染色體，所得遺傳信息有限。近幾年興起的比較基因組雜交(CGH)和單核苷酸多態(tài)性(SNP)基因芯片技術(shù)，已經(jīng)能對(duì)細(xì)胞內(nèi)所有染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面、快速分析，但僅能檢測(cè)已知信息，且成本高；而NGS技術(shù)可低成本、快速的對(duì)胚胎完成全面的遺傳診斷。Gillssen等[13]比較了芯片技術(shù)和NGS技術(shù)在兒童嚴(yán)重智力障礙病因診斷中的作用，結(jié)果顯示芯片的診斷率為12%，全外顯子測(cè)序的診斷率為27%，全基因組測(cè)序的累計(jì)診斷率高達(dá)62%，體現(xiàn)出NGS技術(shù)較芯片技術(shù)在發(fā)現(xiàn)新信息方面的優(yōu)勢(shì)。

四、婦科腫瘤

女性常見惡性腫瘤主要有乳腺癌、卵巢癌和宮頸癌等，它們嚴(yán)重影響女性生殖健康。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)，2016年美國(guó)將有246 660例乳腺癌新發(fā)病例，占女性新發(fā)病例29%，位列之首，60 050例子宮癌新發(fā)病例，占女性新發(fā)病例7%；40 450例乳腺癌患者死亡，位列女性癌癥死亡人數(shù)第二，14 240例卵巢癌患者死亡，占女性癌癥死亡人數(shù)的5%[14]。中國(guó)的情況也不容樂觀，其中乳腺癌每年新發(fā)病例和死亡病例分別占全世界的 12.2% 和 9.6%[15]。

目前，臨床上多采用影像學(xué)(CT和核磁共振等)以及血清學(xué)(腫瘤標(biāo)志物)進(jìn)行腫瘤篩查。影像學(xué)檢測(cè)敏感度低，只能檢測(cè)到一定大小的腫瘤。血清學(xué)檢測(cè)敏感度及特異性較差，且早期腫瘤在血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果上無明顯變化。腫瘤診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是組織病理學(xué)，但需要組織樣本，不僅有創(chuàng)而且很多患者無法取樣。基于NGS技術(shù)的循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA， ctDNA)和循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating Tumor Cell， CTC)使得腫瘤診治進(jìn)入液體活檢時(shí)代。ctDNA是指腫瘤細(xì)胞DNA脫落或者細(xì)胞凋亡后釋放進(jìn)入到循環(huán)系統(tǒng)的遺傳物質(zhì)，CTC是存在于外周血中的各類腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱。ctDNA和CTC均攜帶實(shí)體瘤細(xì)胞的基因改變等信息，通過二者的檢測(cè)可以對(duì)腫瘤患者進(jìn)行精準(zhǔn)的遺傳信息解讀，在無創(chuàng)腫瘤早期篩查、輔助診斷分型、個(gè)性化用藥指導(dǎo)、預(yù)后判斷和無創(chuàng)腫瘤動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等方面發(fā)揮日益重要的作用。

Schiavon等[16]利用ctDNA檢測(cè)轉(zhuǎn)移乳腺癌的靈敏度和特異性分別為75%和100%。明確三陰乳腺癌分子亞型可為基因靶向治療提供重要依據(jù)，例如，基底樣三陰乳腺癌患者的TP53基因突變頻率(62%～80%)高于非基底樣三陰乳腺癌患者(43%)，LAR亞型三陰乳腺癌患者的PIK3CA基因突變頻率(46.2%)高于其他亞型患者(4.5%)[17]。Dawson等[18]結(jié)果顯示ctDNA能實(shí)時(shí)監(jiān)控轉(zhuǎn)移乳腺癌患者接受治療過程中PIK3CA、ZFYVE21、CD1A、IQCA1、MET和KIAA0406基因突變的動(dòng)態(tài)變化。乳腺癌和宮頸癌患者經(jīng)藥物及手術(shù)治療后，ctDNA檢測(cè)到腫瘤復(fù)發(fā)較CT影像學(xué)分別提前13.5個(gè)月和7個(gè)月，對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)的早期診斷、治療、病情監(jiān)測(cè)及預(yù)后評(píng)價(jià)具有重要意義[19-20]。通過監(jiān)測(cè)外周血中衡量CTC的類型和數(shù)量，同樣在婦科腫瘤治療中發(fā)揮重要作用。Agelaki等[21]研究顯示拉帕替尼治療后的HER2陽(yáng)性CTC數(shù)量有效減少，且疾病穩(wěn)定患者較疾病進(jìn)展患者更易出現(xiàn)CTC數(shù)量減少，這一結(jié)果證明了治療期間監(jiān)測(cè)CTC分子改變的可行性。Janni等[22]對(duì)3 173位早期乳腺癌患者進(jìn)行Meta分析，結(jié)果顯示CTC可以作為無疾病生存率、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率、乳腺癌特異生存率和總生存率的獨(dú)立預(yù)后因素；Giuliano等[23]結(jié)果顯示CTC數(shù)量可預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移乳腺癌的轉(zhuǎn)移潛力，即≥5 CTCs/7.5 mL的患者較<5 CTCs/7.5 mL患者不僅具有更多的轉(zhuǎn)移灶而且會(huì)快速形成新的轉(zhuǎn)移病變。

ctDNA和CTC能夠準(zhǔn)確反應(yīng)惡性腫瘤的分子生物學(xué)特征，且可以直接從患者的外周血中獲取，具有取樣方便、無創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)，便于連續(xù)檢測(cè)和隨訪追蹤,實(shí)現(xiàn)個(gè)性化治療。因此，ctDNA和CTC有望發(fā)展成為一種新型的腫瘤學(xué)監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

五、展望

隨著測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步和測(cè)序成本的降低，NGS技術(shù)已在婦產(chǎn)與遺傳學(xué)科領(lǐng)域包括產(chǎn)前遺傳篩查與產(chǎn)前診斷、流產(chǎn)查因、體外輔助生殖和婦科腫瘤等發(fā)揮越來越重要的作用。NIPT篩查具有高靈敏度、高特異度和無創(chuàng)便捷等特點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于胎兒產(chǎn)前基因篩查。鑒于NGS技術(shù)的飛速發(fā)展、染色體非整倍體的成功應(yīng)用，同時(shí)人們對(duì)染色體微缺失/微重復(fù)和單基因病危害性的重視，染色體微缺失/微重復(fù)和單基因病的篩查必將成為NIPT臨床轉(zhuǎn)化的熱點(diǎn)；自然流產(chǎn)和不孕不育比例逐年增加，利用NGS技術(shù)可精確排查染色體變異原因，提高治療效率；基于NGS技術(shù)的PGS/PGD將大大提高移植率、妊娠率，降低流產(chǎn)率，為不孕不育家庭帶來福音；作為一種靈敏、特異、無創(chuàng)的分子生物學(xué)檢測(cè)手段，ctDNA和CTC檢測(cè)將為婦科腫瘤早期篩查、分型診斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)和個(gè)體化治療等提供有力的臨床證據(jù)。

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