黃 亮， 褚瑰燕， 楊公社*

(1)陜西省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西， 楊凌 712100；2)西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物脂肪沉積與肌肉發(fā)育實(shí)驗(yàn)室，陜西， 楊凌 712100)

晝夜節(jié)律是一種循環(huán)的內(nèi)源性生物模式，以大約24 h為周期，調(diào)節(jié)機(jī)體生理、新陳代謝和行為[1]。幾乎所有的生命體都通過(guò)生物鐘機(jī)制來(lái)預(yù)測(cè)地球自轉(zhuǎn)所引起的每日變化。晝夜節(jié)律是一種普遍的生命現(xiàn)象，在維持動(dòng)植物的多種生理功能和調(diào)節(jié)動(dòng)植物對(duì)內(nèi)外環(huán)境的適應(yīng)性方面發(fā)揮重要作用[2]。晝夜節(jié)律性是哺乳動(dòng)物新陳代謝的主要特征，它使新陳代謝過(guò)程與晝夜光照周期同步[3]。晝夜節(jié)律的產(chǎn)生、維持和調(diào)節(jié)依賴于生物鐘的輸入系統(tǒng)和輸出系統(tǒng)在整體水平和細(xì)胞水平上的協(xié)同作用，也依賴于內(nèi)源性生物鐘基因網(wǎng)絡(luò)的精確調(diào)節(jié)。隨著人類對(duì)生物鐘研究的日益深入，從最初的植物到哺乳動(dòng)物最后到人，生物鐘機(jī)制研究得到較大的發(fā)展并取得了一些重大成就。在哺乳動(dòng)物中，晝夜節(jié)律由視交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)的中央時(shí)鐘驅(qū)動(dòng)[4]，并通過(guò)視網(wǎng)膜下丘腦束被光重置[5]。SCN通過(guò)內(nèi)分泌、自主和行為線索影響外周組織時(shí)鐘，例如與代謝、內(nèi)分泌和生殖功能有關(guān)的生物鐘[6]。激素水平、藥代動(dòng)力學(xué)和疾病方面的時(shí)間變化(例如，清晨心血管病發(fā)作的發(fā)生率增加，以及哮喘癥狀的夜間加重)，顯示了晝夜節(jié)律對(duì)人類生理和病理生理學(xué)的顯著影響[7]。雌性生殖系統(tǒng)的節(jié)律性生理變化依賴于多個(gè)神經(jīng)內(nèi)分泌和內(nèi)分泌組織的協(xié)調(diào)和同步活動(dòng)。卵巢的每種細(xì)胞類型，包括卵泡膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞，都有一個(gè)與卵泡生長(zhǎng)、類固醇激素合成和排卵過(guò)程有關(guān)的生物鐘。卵巢的生殖周期受晝夜節(jié)律的影響，擾亂周期或阻礙卵泡生長(zhǎng)的疾病會(huì)破壞卵巢生物鐘基因表達(dá)的節(jié)律[8]。生物鐘在卵巢卵泡的募集、生長(zhǎng)、排卵等生殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用。生物鐘紊亂不僅會(huì)導(dǎo)致排卵障礙和不孕，也與卵巢的衰老有緊密聯(lián)系。目前，卵巢生物鐘的分子機(jī)制尚未完全闡明。本文就近些年卵巢的生物鐘研究進(jìn)展予以綜述，并對(duì)今后的研究作出展望。

1 生物鐘概述

在哺乳動(dòng)物中，生物鐘由中央時(shí)鐘和外周時(shí)鐘兩部分組成，兩者協(xié)調(diào)產(chǎn)生生理和行為上的每日節(jié)律。中央時(shí)鐘位于下丘腦前部的視交叉上核[9]，視交叉上核由多個(gè)單細(xì)胞晝夜節(jié)律振蕩器組成，當(dāng)它們同步時(shí)，會(huì)產(chǎn)生協(xié)調(diào)的晝夜節(jié)律輸出[7]。外周時(shí)鐘存在于外周器官和組織中(肝、胰腺、卵巢、肺等)，是一種具有自主性的時(shí)鐘[10]。視交叉上核通過(guò)視網(wǎng)膜下丘腦束接受體外信號(hào)(光)，通過(guò)神經(jīng)和體液機(jī)制調(diào)節(jié)身體幾乎所有組織與外周時(shí)鐘的相位同步[11]。在某些情況下，外周時(shí)鐘可以獨(dú)立于中央時(shí)鐘發(fā)揮作用。然而，與視交叉上核中時(shí)鐘基因節(jié)律性表達(dá)的相位相比，外周時(shí)鐘基因節(jié)律性表達(dá)的相位相反或相位延遲[12]。

2 生物鐘的分子機(jī)制

哺乳動(dòng)物晝夜節(jié)律受一些生物鐘基因的調(diào)控，包括腦和肌肉組織芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的類似蛋白1(brain and muscle Arnt-like protein-1，Bmal1)、晝夜節(jié)律運(yùn)動(dòng)輸出周期故障(circadian locomotor output cycles kaput，Clock)、周期1/2/3 (period1/2/3，Per1/2/3)、隱花色素1/2 (cryptochrome1/2，Cry1/2)、核受體亞家族1D組成員1/2 (nuclear receptor subfamily 1 group D members 1/2，Rev-Erbα/β；Nr1d1/2)、維甲酸相關(guān)的孤核受體α/β/γ(retinoic acid-related orphan nuclear receptors α/β/γ，RORα/β/γ)、D-box結(jié)合蛋白(D-box binding protein，Dbp)、分化胚胎軟骨細(xì)胞基因1/2 (differentiated embryonic chondrocyte gene1/2，Dec1/2)、促甲狀腺細(xì)胞胚胎因子(thyrotroph embryonic factor，Tef)、肝白血病因子(hepatic leukemia factor，Hlf)、神經(jīng)元PAS結(jié)構(gòu)域蛋白2 (neuronal PAS domain protein 2，Npas2)、酪蛋白激酶1e (casein kinase 1 epsilon，Ck1e)等，這些基因共同組成連鎖的轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路(transcription-translation feedback loop, TTLs)[13]。生物鐘系統(tǒng)由一組核心的轉(zhuǎn)錄因子組成，它們共同在TTLs中發(fā)揮作用(Fig.1)。BMAL1和CLOCK是轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路的兩個(gè)主要轉(zhuǎn)錄因子，分別由Bmal1和Clock基因編碼，二者都具有堿性螺旋環(huán)-螺旋/PAS結(jié)構(gòu)域(basic helix-loop-helix-PER-ARNT-SIM，bHLH/PAS)。在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，BMAL1和CLOCK蛋白質(zhì)結(jié)合形成異二聚體轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，作為主要的正向調(diào)節(jié)因子，然后進(jìn)入細(xì)胞核，通過(guò)與啟動(dòng)子中的E-box元件結(jié)合來(lái)激活靶基因的表達(dá)[14]，這些靶基因包括Bmal1、Clock、Per1/2/3和Cry1/2等[15]。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)PER和CRY蛋白質(zhì)形成異二聚體轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，延遲后進(jìn)入細(xì)胞核，直接與CLOCK/BMAL1復(fù)合物結(jié)合，并抑制其活性[16]，從而抑制Per和cry基因以及其它生物鐘基因的轉(zhuǎn)錄激活[17,18]，最終形成核心的負(fù)反饋環(huán)路。當(dāng)PER和CRY下降到低水平時(shí)，BMAL1/CLOCK又可以啟動(dòng)新一輪的基因反式激活周期。在大多數(shù)情況下，BMAL1和CLOCK是鐘控基因的反式激活所必需的，但BMAL1也可以獨(dú)立地調(diào)節(jié)某些基因的表達(dá)，例如II型碘甲狀腺原氨酸去碘酶(type II iodothyronine deiodinase，Dio2)[19]。除了核心的負(fù)反饋環(huán)路外，還存在其他的反饋環(huán)路，例如BMAL1/CLOCK復(fù)合物能促進(jìn)Rev-Erbα/β核受體的轉(zhuǎn)錄，當(dāng)REV-ERBα/β積累到臨界值時(shí)，又能反向抑制Bmal1的轉(zhuǎn)錄[20]。REV-ERBα與其基因啟動(dòng)子中的應(yīng)答元件RRE(或RORE, retinoic acid related orphan receptor response element)結(jié)合，通過(guò)募集輔阻遏物核受體輔加壓素1 (nuclear receptor corepressor 1，NCoR1)和組蛋白脫乙酰酶3 (histone deacetylase 3，HDAC3)抑制基因的轉(zhuǎn)錄[21]。此外，RORα以單體形式與應(yīng)答元件(ROREs)結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。結(jié)合ROREs的能力與其他幾種核受體共享，例如REV-ERBα和REV-ERBβ[22]，通過(guò)在BMAL1啟動(dòng)子中競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ROREs，這些受體可以對(duì)抗彼此對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響[23]，從而控制其轉(zhuǎn)錄水平。同時(shí)，RORα和REV-ERBα轉(zhuǎn)錄水平又受BMAL1/CLOCK復(fù)合物調(diào)節(jié)。RORs和REV-ERBs對(duì)RORE介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄的正負(fù)調(diào)控，在BMAL1表達(dá)的控制中發(fā)揮作用，并且可能是若干其他調(diào)節(jié)反饋回路的一部分[24,25]。

Fig.1 The circadian clock in mammals is formed by interlocking transcription-translation feedback loops In the core loop, the transcription factor CLOCK-BMAL1 dimers induce the expression of their own negative regulators including PER and CRY. By inhibiting the transcriptional activity of CLOCK-BMAL1, PER and CRY repress their own expression. Once PER and CRY levels have sufficiently dropped, a new cycle of transcription by CLOCK-BMAL1 can begin. The CLOCK and BMAL1 dimer also induced the expression of REV-ERBs, and the expression of RORs controlled by Ror gene which containing the D-box element. In the Auxiliary loop, REV-ERB and ROR regulate the expression of Bmal1 by competitively combining RRE components in Bmal1. RRE, REV-ERBα response element. DBP, D-box binding protein

3 生物鐘在卵巢生理中的作用

雌性哺乳動(dòng)物的生殖系統(tǒng)表現(xiàn)出精確的晝夜節(jié)律。自卵巢生物鐘發(fā)現(xiàn)以來(lái)，生殖系統(tǒng)生物鐘迅速成為新的研究熱點(diǎn)。卵巢生物鐘是一種外周時(shí)鐘，接受中央時(shí)鐘SCN的神經(jīng)內(nèi)分泌信號(hào)調(diào)節(jié)。視交叉上核能產(chǎn)生血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)和精氨酸加壓素(arginine vasopressin，AVP)。VIP直接刺激促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)神經(jīng)元活動(dòng)，精氨酸加壓素信號(hào)對(duì)于GnRH神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的視交叉上核調(diào)節(jié)至關(guān)重要，精氨酸加壓素受BMAL1/CLOCK復(fù)合物的調(diào)節(jié), 并以雌激素依賴的方式刺激Kisspeptin神經(jīng)元[26]。Kisspeptin神經(jīng)元在生殖中的主要作用是刺激GnRH神經(jīng)元，將GnRH釋放到垂體-門脈系統(tǒng)中，促性腺激素釋放激素的釋放對(duì)排卵前黃體生成素(luteinizing hormone，LH)的激增是必要的。GnRH促進(jìn)垂體釋放促卵泡激素(follicular stimulating hormone，F(xiàn)SH)和黃體生成素，垂體釋放促卵泡激素和LH進(jìn)入血液，隨后作用于卵巢, 以促進(jìn)配子發(fā)生和性類固醇生成[27]。性類固醇激素又反饋到垂體和下丘腦，從而調(diào)節(jié)不同激素的釋放模式。下丘腦-垂體-卵巢(hypothalamic-pituitary-ovarian，HPO)軸上各種生物鐘相互協(xié)調(diào)和同步以促進(jìn)正常生殖行為。目前的研究表明，卵巢細(xì)胞中的生物鐘在卵巢生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，例如參與卵泡的發(fā)育和成熟，排卵以及類固醇的合成與釋放等。

3.1 生物鐘參與卵泡發(fā)育

卵泡中存在生物鐘基因的表達(dá)，包括卵泡膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞[28]。許多研究表明，生物鐘和卵泡發(fā)育之間有重要聯(lián)系。卵巢中生物鐘基因表達(dá)的時(shí)機(jī)受卵泡發(fā)育階段的影響。在卵泡發(fā)育過(guò)程中，生物鐘基因表達(dá)的節(jié)律在原始卵泡和腔前卵泡中不存在，但卵泡發(fā)育到早期竇狀卵泡時(shí)就會(huì)出現(xiàn)，并在接近晚期的竇狀卵泡或排卵前卵泡時(shí)會(huì)變得更加穩(wěn)定[29]。研究發(fā)現(xiàn)，處于發(fā)育階段的卵泡在白天表現(xiàn)出較高的BMAL1和CLOCK的蛋白質(zhì)水平，而在晚上，CRY1、CRY2、PER1和PER2的蛋白質(zhì)水平則上調(diào)[30]。卵泡的正常發(fā)育離不開(kāi)顆粒細(xì)胞的支持作用，顆粒細(xì)胞分泌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞因子，會(huì)通過(guò)間隙連接供給卵母細(xì)胞以滿足其生長(zhǎng)需要。因此，顆粒細(xì)胞發(fā)育受阻或功能障礙會(huì)直接影響卵泡的發(fā)育。此外，在大鼠卵巢中存在生物鐘基因dec1(sharp2)的表達(dá)，該基因是細(xì)胞節(jié)律性輔助反饋環(huán)路中的1種，并被卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中的馬絨毛膜促性腺激素(equine chorionic gonadotropin, eCG)和人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG)暫時(shí)誘導(dǎo)[31]。在卵巢中，DEC1是細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄阻遏物，并以促性腺激素依賴性方式直接或間接改變卵巢中基因的表達(dá)，例如FSH受體、環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2, COX2)和其他E-box依賴性基因。這些結(jié)果表明，dec1參與卵泡發(fā)育與排卵過(guò)程[32]。

3.2 調(diào)控排卵反應(yīng)

在哺乳動(dòng)物中，垂體釋放促卵泡激素和LH的水平表現(xiàn)為晝夜節(jié)律的振蕩。垂體釋放促卵泡激素促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)和性類固醇的產(chǎn)生，而LH在雌二醇的循環(huán)水平高到足以促進(jìn)卵泡成熟時(shí)觸發(fā)成熟卵泡的排卵。排卵前，卵泡細(xì)胞上存在大量垂體釋放促卵泡激素和LH受體，垂體釋放促卵泡激素與LH中的1種或2種激素調(diào)節(jié)排卵前卵泡細(xì)胞中生物鐘基因的表達(dá)[28,33, 34]。排卵前LH激增發(fā)生在雌性小鼠發(fā)情前期的夜晚，其時(shí)間是由生物鐘系統(tǒng)決定[35]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)雌性小鼠長(zhǎng)期暴露于破壞的明暗循環(huán)環(huán)境，會(huì)明顯損害排卵前LH激增的發(fā)生，導(dǎo)致排卵故障，這嚴(yán)重?fù)p害生殖活動(dòng)從而導(dǎo)致生殖能力降低[36]。Karman和Tischkau[37]檢測(cè)了12 L：12 D條件下大鼠卵巢中生物鐘基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Bmal1和Per2轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)產(chǎn)物的節(jié)律性表達(dá)模式相對(duì)于SCN是異相的，并且彼此完全反相。在LH激增后的第1 d，Bmal1的表達(dá)顯著升高，該研究確定，LH是卵巢晝夜節(jié)律基因節(jié)律的潛在調(diào)節(jié)劑。Sellix等[38]通過(guò)阻斷內(nèi)源性促性腺激素分泌，并評(píng)估定時(shí)外源性LH治療對(duì)排卵的影響，以此作為階段性卵巢敏感性的衡量標(biāo)準(zhǔn)。研究結(jié)果證明了卵巢對(duì)LH敏感性的晝夜節(jié)律，它決定了促性腺激素參與的排卵反應(yīng)。Kobayashi等[39]用hCG激素處理小鼠卵巢，Bmal1基因在hCG給藥后4～16 h的表達(dá)顯著高于對(duì)照組小鼠，表明健康的排卵需要誘導(dǎo)Bmal1表達(dá)以促進(jìn)LH激增。他們的數(shù)據(jù)還表明，BMAL1可能參與卵巢細(xì)胞的黃體化，因?yàn)锽MAL1的表達(dá)在hCG給藥16 h后達(dá)到最大值，此時(shí)卵泡發(fā)生黃體化。此外，敲除生物鐘基因Clock會(huì)嚴(yán)重影響小鼠的生殖能力，導(dǎo)致卵母細(xì)胞釋放減少和產(chǎn)仔數(shù)減少，表明Clock在卵泡發(fā)育與排卵過(guò)程的重要作用[40]。卵泡膜細(xì)胞中的生物鐘調(diào)節(jié)鐘控基因(例如LHR)表達(dá)的時(shí)間，并通過(guò)保持卵巢對(duì)促性腺激素的穩(wěn)定節(jié)律而在排卵中發(fā)揮重要作用[41]。

3.3 調(diào)節(jié)類固醇激素的生成

卵巢中的生物鐘在調(diào)節(jié)類固醇的生物合成中發(fā)揮重要作用。卵巢類固醇激素合成的第一步是在類固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein，StAR)的作用下，將膽固醇從卵泡內(nèi)膜細(xì)胞線粒體外膜轉(zhuǎn)移至內(nèi)膜。在線粒體內(nèi)膜，膽固醇在細(xì)胞色素P450膽固醇側(cè)鏈切割酶(cytochrome P450 cholesterol side-chain cleavage enzyme，CYP11A1)的作用下轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮，隨后在3β-羥基類固醇脫氫酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD)催化下形成孕酮(progesterone，P4)。類固醇 17α羥化酶(steroid 17 alpha-hydroxylase，CYP17A1)催化P4轉(zhuǎn)變?yōu)樾巯┒巯┒M(jìn)入顆粒細(xì)胞，并最終在芳香化酶(aromatase cytochrome P450 19A1，CYP19A1)的作用下形成雌二醇。類固醇生成基因，例如StAR、CYP11A1、3β-HSD和CYP19A1都是鐘控基因。在成熟的顆粒細(xì)胞中這些基因表達(dá)的節(jié)律性受生物鐘的嚴(yán)重影響。有研究用hCG處理體外培養(yǎng)的人黃體化顆粒細(xì)胞，研究表明，PER2基因在處理后顯示出周期式的震蕩模式。有趣的是，STAR基因的表達(dá)也顯示出與PER2類似的震蕩模式，這可能與卵巢中的類固醇生成有關(guān)[42]。Ratajczak等[43]和Boden等[44]的研究證明，BMAL1在類固醇生成細(xì)胞內(nèi)和在STAR酶產(chǎn)生孕酮中發(fā)揮作用。此外，卵巢類固醇生成細(xì)胞特異性Bmal1基因敲除小鼠模型顯示，Bmal1的缺失破壞了生物鐘機(jī)制相關(guān)轉(zhuǎn)錄物以及Star基因的表達(dá)，Star基因表達(dá)受損會(huì)降低孕酮水平并造成著床失敗[45]。卵巢細(xì)胞內(nèi)的生物鐘機(jī)制對(duì)雌激素的調(diào)節(jié)是生殖能力的一個(gè)關(guān)鍵方面。Wang等[46]通過(guò)抑制豬卵巢顆粒細(xì)胞Bmal1基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)干擾Bmal1能顯著下調(diào)Clock、Per1和Per2的表達(dá)，并且激素合成基因Star、Cyp11a1和Cyp19a1的表達(dá)也下調(diào)，這些基因的啟動(dòng)子區(qū)域都含有生物鐘控制元件(E-box或RORE)，表明生物鐘系統(tǒng)可能是通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因啟動(dòng)子上的生物鐘調(diào)控元件發(fā)揮作用，最終導(dǎo)致顆粒細(xì)胞分泌的雌激素和孕酮減少。綜上可知，卵巢類固醇生成受生物鐘系統(tǒng)的調(diào)控，生物鐘基因的缺失或抑制會(huì)影響類固醇的生成。

4 生物鐘在卵巢衰老中的作用

過(guò)早衰老會(huì)縮短畜牧生產(chǎn)和人類生殖年限。隨著年齡的增長(zhǎng)，雌性動(dòng)物的生殖能力自然下降，卵巢衰老對(duì)雌性動(dòng)物的生殖生理和生產(chǎn)性能具有較大的影響。卵巢衰老與雌性哺乳動(dòng)物年齡相關(guān)的生殖能力下降的分子機(jī)制仍不清楚[47]。卵巢的衰老與細(xì)胞水平上的衰老和功能退化有關(guān)。卵巢衰老的主要特征是卵巢儲(chǔ)備減少[48]、卵母細(xì)胞質(zhì)量和數(shù)量的下降[49]、卵泡的不斷喪失以及性激素分泌下降[50]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，生物鐘在卵巢衰老過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。盡管生物鐘基因如Per1、Per2、Cry1或Cry2的突變對(duì)年輕(2～6個(gè)月大)小鼠發(fā)情周期的影響很小，但是中年(約10個(gè)月大)突變小鼠的發(fā)情周期不規(guī)律的比例明顯高于野生型同年齡小鼠，其特征是不規(guī)則或延長(zhǎng)的發(fā)情周期[51, 52]。Per突變中年雌性小鼠與老年野生型小鼠的生育能力相近，這暗示生物鐘基因的突變會(huì)加速中年突變小鼠卵巢的衰老，導(dǎo)致不規(guī)則發(fā)情周期的出現(xiàn)，進(jìn)而造成小鼠的生殖缺陷[51]。研究表明，生物鐘系統(tǒng)的損傷加劇了衰老對(duì)生殖節(jié)律的影響[53]。此外，Brzezinski等[54]從接受過(guò)體外受精治療的年輕(18～33歲)和大齡(39～45歲)病人中分離出黃體化顆粒細(xì)胞，在hCG刺激后36 h，測(cè)量細(xì)胞中生物鐘基因的表達(dá)水平。他們發(fā)現(xiàn)生物鐘基因CLOCK、BMAL1、CRY1、CRY2、PER1、PER2在培養(yǎng)的年輕和大齡人黃體化顆粒細(xì)胞中都有表達(dá)。與年輕婦女相比，老年婦女顆粒細(xì)胞中生物鐘基因的表達(dá)呈現(xiàn)總體的下降趨勢(shì)，其中PER1和CLOCK基因顯著下調(diào)，這種下調(diào)可能部分解釋了老年婦女生殖能力下降。有研究發(fā)現(xiàn)，婦女血清抗繆勒氏激素(anti-mullerian hormone，AMH)水平和顆粒細(xì)胞晝夜節(jié)律基因的表達(dá)均隨著年齡的增長(zhǎng)而顯著下調(diào)。除REV-ERBα外，CLOCK、BMAL1、CRY1、CRY2和PER1均與AMH水平呈正相關(guān)，這表明老年婦女卵巢儲(chǔ)備下降，是由于衰老導(dǎo)致的卵巢晝夜節(jié)律下調(diào)造成的[55]。褪黑素是晝夜節(jié)律的標(biāo)志物，是一種由松果體分泌的脂溶性激素，其水平隨晝夜節(jié)律而變化。Liang等[56]在體外培養(yǎng)的衰老牛卵母細(xì)胞中補(bǔ)充外源的褪黑素，研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素能顯著降低衰老細(xì)胞中的活性氧(reactive oxygen species，ROS)和DNA損傷水平，從而改善衰老卵母細(xì)胞質(zhì)量并提高其發(fā)育能力。綜上可知，卵巢細(xì)胞生物鐘基因的突變會(huì)加速卵巢的衰老，并且生物鐘基因的表達(dá)水平隨著年齡的增長(zhǎng)而改變。卵巢衰老與生物鐘密切相關(guān)，因此，可能影響卵巢的功能并導(dǎo)致卵巢儲(chǔ)備減少和生殖能力下降。

5 卵巢病理中的生物鐘

生物鐘系統(tǒng)的破壞可能是導(dǎo)致生殖能力下降相關(guān)疾病的致病因素之一。卵巢細(xì)胞的生物鐘中斷或與其他部位的晝夜節(jié)律振蕩器之間的不同步，也會(huì)導(dǎo)致各種生殖疾病的發(fā)生和發(fā)展。晝夜節(jié)律紊亂引起的代謝和生殖功能障礙的潛在機(jī)制，及其與卵巢疾病的關(guān)系尚不清楚。以下幾種是公認(rèn)的與生物鐘相關(guān)的卵巢疾病。

5.1 多囊卵巢綜合征

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome, PCOS)是哺乳動(dòng)物常見(jiàn)的內(nèi)分泌和與代謝風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)的生殖系統(tǒng)疾病，也是造成生殖力下降或不育的主要原因。多囊卵巢綜合征的主要特征是排卵功能障礙[57]、高雄激素癥[58]、多囊性卵巢形態(tài)[59]、月經(jīng)不調(diào)[60]和胰島素抵抗[61]。肥胖、血脂異常和Ⅱ型糖尿病也是多囊卵巢綜合征的特征[62]。許多證據(jù)表明，多囊卵巢綜合征與晝夜節(jié)律紊亂有關(guān)。Simon 等[63]研究患有PCOS與不患有PCOS的肥胖少女之間褪黑素晝夜節(jié)律的差異。與對(duì)照組相比，患有多囊卵巢綜合征的肥胖女孩褪黑素分泌時(shí)間延遲并且延長(zhǎng)，這表明多囊卵巢綜合征病人晝夜節(jié)律失調(diào)與代謝失調(diào)有關(guān)。此外，有研究探討褪黑素在多囊卵巢綜合征發(fā)病機(jī)制中的潛在作用，研究發(fā)現(xiàn)，正常人早晨的褪黑素水平很低，而多囊卵巢綜合征患者在早晨具有高褪黑素水平，這表明多囊卵巢綜合征患者體內(nèi)褪黑素的晝夜差異較小，這種現(xiàn)象可能是由于多囊卵巢綜合征女性紊亂的晝夜節(jié)律所導(dǎo)致的[64]。把健康的6周齡大鼠暴露于持續(xù)8周的黑暗環(huán)境，經(jīng)過(guò)黑暗處理的大鼠體內(nèi)生物鐘基因表達(dá)的改變與多囊卵巢綜合征患者一致。在持續(xù)的黑暗條件下，Bmal1表達(dá)的下調(diào)通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)促進(jìn)胰島素抵抗，而Per1和Per2表達(dá)的下調(diào)則促進(jìn)雄激素過(guò)剩。此外，褪黑素治療可通過(guò)BMAL1、PER1和PER2減輕黑暗處理大鼠的高胰島素癥和高雄激素癥[65]。同樣，持續(xù)的光照處理會(huì)誘導(dǎo)大鼠的多囊卵巢綜合征變化，大鼠血清抗繆勒氏激素(AMH)水平明顯升高，并且在卵巢中觀察到更多的閉鎖性囊腫樣卵泡[66]。另外，也有研究證明，多囊卵巢綜合征患者卵巢顆粒細(xì)胞中BMAL1基因表達(dá)低于非PCOS患者[67]。

5.2 絕經(jīng)提前和過(guò)早的卵巢功能不全

自然絕經(jīng)年齡對(duì)婦女的健康和生殖能力有重要影響。輪班工作是導(dǎo)致絕經(jīng)年齡提前的重要因素之一。夜班婦女經(jīng)歷的環(huán)境晝夜節(jié)律信號(hào)被打亂，可能通過(guò)性腺功能的慢性失調(diào)而使絕經(jīng)年齡提前。研究表明，絕經(jīng)前婦女如果超過(guò)輪流夜班工作的閾值，則可能會(huì)有中度加速絕經(jīng)發(fā)作的風(fēng)險(xiǎn)，而這種現(xiàn)象在年輕女性中最為顯著，這造成年輕女性更早的發(fā)生卵巢功能衰竭[68]。此外，卵巢功能衰竭也與卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency, POI)密切相關(guān)。POI的主要特征是育齡婦女卵巢功能的喪失，許多基因和非遺傳因素促成POI的發(fā)生。有人用Per1/Per2雙突變的雌性小鼠作研究，基因突變對(duì)卵泡發(fā)育過(guò)程中血管生長(zhǎng)未見(jiàn)明顯影響，但是會(huì)使卵巢卵泡過(guò)早減少，造成卵巢儲(chǔ)備下降和功能的過(guò)早喪失，進(jìn)而導(dǎo)致女性生殖能力下降。研究發(fā)現(xiàn)，Per1/Per2雙突變可能通過(guò)影響小鼠HPO軸的每個(gè)部位的生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)來(lái)促進(jìn)POI的發(fā)生[69]。

5.3 卵巢癌

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中常見(jiàn)的致命疾病，也是婦科惡性腫瘤致死的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，晝夜節(jié)律紊亂卵巢癌患者腫瘤樣品中PER1和PER2蛋白的表達(dá)顯著降低[70]。此外，Per2基因可抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，晚期卵巢癌與Per2突變或缺失有關(guān)，這表明Per2與卵巢癌的發(fā)展密切相關(guān)[71]。Zhao等[72]研究褪黑素的循環(huán)水平與卵巢癌發(fā)病機(jī)制的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者的血清褪黑素水平顯著降低。晝夜節(jié)律不僅與卵巢癌的發(fā)生有關(guān)，還與化療耐藥性有關(guān)。Xu等[73]研究CLOCK基因在順鉑敏感的A2780和順鉑耐藥的CP70細(xì)胞中的表達(dá)，并且研究順鉑處理對(duì)CLOCK敲除后順鉑耐藥的CP70細(xì)胞增殖和凋亡的影響。與順鉑耐藥的CP70細(xì)胞相比，順鉑敏感的A2780細(xì)胞的CLOCKmRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)顯著降低，這表明CLOCK基因表達(dá)與卵巢癌細(xì)胞的順鉑耐藥性密切相關(guān)。順鉑處理能顯著抑制CP70細(xì)胞的增殖，并在敲除CLOCK后誘導(dǎo)其凋亡。此外，ARNTL(BMAL1)在卵巢癌細(xì)胞系中顯著下調(diào)，表觀遺傳治療可以恢復(fù)ARNTL的表達(dá)。ARNTL的過(guò)表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并增強(qiáng)順鉑的化學(xué)敏感性，這暗示生物鐘基因ARNTL可能是卵巢癌的潛在腫瘤抑制基因[74]。

6 問(wèn)題與展望

從哺乳動(dòng)物第1個(gè)生物鐘基因Clock發(fā)現(xiàn)以來(lái)，哺乳動(dòng)物的晝夜節(jié)律引起了很多人的關(guān)注，也陸續(xù)發(fā)表大量的研究性文章?，F(xiàn)已知道，生物鐘基因在哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，特別是在卵巢組織中。卵巢生物鐘是一種外周時(shí)鐘，其接受中央時(shí)鐘調(diào)節(jié)而又具有獨(dú)立的調(diào)節(jié)能力。卵巢生物鐘調(diào)控卵泡的發(fā)育和成熟、排卵以及類固醇激素的生成。雖然開(kāi)展了研究，但其調(diào)控這些生理過(guò)程的具體分子機(jī)制仍然未知。卵巢細(xì)胞中調(diào)節(jié)生物鐘發(fā)生的機(jī)制是什么？生物鐘又是如何調(diào)節(jié)卵巢對(duì)激素和神經(jīng)信號(hào)的反應(yīng)，特別是在每一種卵巢細(xì)胞類型的水平上？目前仍不得而知。解決這些問(wèn)題對(duì)維持哺乳動(dòng)物卵巢的正常機(jī)能和延長(zhǎng)生殖壽命至關(guān)重要。

卵巢衰老是導(dǎo)致哺乳動(dòng)物年齡相關(guān)的生殖能力下降和不孕癥的主要原因。在畜牧生產(chǎn)中，卵巢衰老不僅會(huì)導(dǎo)致家畜卵母細(xì)胞質(zhì)量和數(shù)量的下降，還會(huì)使家畜患與衰老相關(guān)的卵巢疾病，這會(huì)縮短家畜的使用年限并降低生產(chǎn)效益?，F(xiàn)已知道，卵巢衰老與生物鐘密切相關(guān)，卵巢細(xì)胞生物鐘基因的表達(dá)水平隨著年齡的增長(zhǎng)而下調(diào)。目前，衰老在顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞上的研究報(bào)道非常有限，研究?jī)?nèi)容也不深入。生物鐘與卵巢衰老是什么調(diào)控關(guān)系？卵巢衰老又是如何影響生物鐘基因的表達(dá)？其具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步的探索。在未來(lái)，隨著研究的深入和分子機(jī)制的闡明，以豬為模型動(dòng)物研究人卵巢衰老更為適合，因?yàn)樨i的生理狀態(tài)更接近于人。另外，靶向生物鐘基因的藥物治療可能在卵巢抗衰老方面發(fā)揮重要作用。

晝夜節(jié)律紊亂與卵巢疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，包括多囊卵巢綜合征、絕經(jīng)期提前、過(guò)早的卵巢功能不全和卵巢癌。這些損害生殖能力的疾病對(duì)生物鐘功能的影響或生物鐘在這些病因中的作用尚未得到充分認(rèn)識(shí)。當(dāng)前，已有一些藥物用于治療輪班工作或其它環(huán)境因素引起的人或動(dòng)物的卵巢疾病，例如順鉑和褪黑素。針對(duì)生物鐘因子的小分子有很大的潛力來(lái)治療晝夜節(jié)律紊亂及其相關(guān)共病。闡明生物鐘在卵巢疾病中調(diào)控機(jī)制，可為開(kāi)發(fā)新的診斷和治療方法以及新型藥物提供理論依據(jù)。