郝夢(mèng)媛， 杭琦， 師恭曜

（1.鄭州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，鄭州 450001；2.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450001）

隨著大量作物基因組信息被公布，研究并驗(yàn)證基因具體功能是后基因組時(shí)代（post-genome era）的一項(xiàng)重要任務(wù)。基因功能缺失（loss-offunction）是揭示基因功能的重要手段。通常可以在3個(gè)水平上實(shí)現(xiàn)基因的功能缺失：第1種是基因組水平上的基因突變（gene mutation，GM），即基因編碼序列的無(wú)義突變或缺失，導(dǎo)致基因功能缺失；第2種是轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默（transcriptional gene silencing，TGS），即基因編碼序列正常，但轉(zhuǎn)錄受到抑制，使其無(wú)法發(fā)揮功能；第3種是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默（posttranscriptional gene silencing，PTGS），即基因可以正常轉(zhuǎn)錄，但無(wú)法正常翻譯，如提前降解，造成基因功能缺失。目前，常用的基因功能缺失研究方法仍依賴轉(zhuǎn)基因技術(shù)，如創(chuàng)制T-DNA插入突變體或CRISPR靶向突變體、通過(guò)CRISPRi抑制靶向基因、利用RNAi造成目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄后沉默。而多種作物還未建立起成熟的轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系，使得以上方法無(wú)法應(yīng)用于其基因功能研究。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）是一種不依賴轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基因功能缺失研究方法，其綜合植物病毒的非轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)性侵染、植物的免疫應(yīng)答及細(xì)胞RNAi沉默機(jī)制于一體，可以簡(jiǎn)易、快速且高效地沉默靶向基因，屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默。相比于依賴遺傳轉(zhuǎn)化的基因功能缺失研究方法，VIGS技術(shù)具有不需要遺傳轉(zhuǎn)化、實(shí)驗(yàn)周期短、研究成本低及應(yīng)用植物范圍廣等特征，被越來(lái)越多地應(yīng)用于不同作物的基因功能研究中［1-2］。本文基于VIGS技術(shù)原理，系統(tǒng)闡述了植物VIGS技術(shù)的發(fā)展過(guò)程，重點(diǎn)歸納了VIGS在不同作物中的應(yīng)用現(xiàn)狀，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步總結(jié)和討論了影響VIGS基因沉默效率的主要因素，以期為VIGS技術(shù)在作物基因功能研究中的進(jìn)一步應(yīng)用和發(fā)展提供參考與借鑒。

1 VIGS技術(shù)原理

VIGS利用了植物固有的RNA干擾（RNA interference，RNAi）和病毒免疫應(yīng)答的機(jī)制。RNAi是指通過(guò)一些長(zhǎng)度為21～30 nt的小RNA特異調(diào)節(jié)序列互補(bǔ)基因表達(dá)和翻譯的基因沉默過(guò)程。在生物體內(nèi)，初級(jí)小RNA轉(zhuǎn)錄后形成雙鏈RNA（double stranded RNA，dsRNA），dsRNA會(huì)被Dicer酶識(shí)別并切割成21～24 nt的成熟siRNA（short interfering RNA）［3］。 這 些 siRNA 與Agronaute1（AGO1）及其相關(guān)蛋白質(zhì)形成沉默效應(yīng)復(fù)合體RISC（RNA-induced silence complex），并特異性地結(jié)合并降解互補(bǔ)mRNA序列，引發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因沉默（圖1A）。植物的病毒免疫應(yīng)答即利用了RNAi機(jī)制，當(dāng)病毒侵染植物后，病毒復(fù)制形成的dsRNA同樣會(huì)被植物體內(nèi)的Dicer酶識(shí)別并切割成siRNA，進(jìn)而觸發(fā)RNAi機(jī)制特異識(shí)別并降解病毒RNA，免疫病毒入侵。VIGS技術(shù)巧妙地利用了植物的病毒免疫應(yīng)答和RNAi機(jī)制，通過(guò)在病毒載體中插入目標(biāo)基因片段，在侵染的植物細(xì)胞中誘發(fā)產(chǎn)生可以特異互補(bǔ)目標(biāo)基因的siRNA，靶向降解目的mRNA，結(jié)合病毒的侵染能力，誘發(fā)全植株的靶向基因沉默［4］（圖1B）。

2 VIGS的發(fā)展

2.1 病毒沉默載體的發(fā)展

合適的病毒載體是影響VIGS技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。對(duì)植物病毒序列的侵染性克隆，對(duì)病毒基因功能、侵染機(jī)理、病毒?植物互作的研究以及對(duì)病毒載體的改造都極大地推進(jìn)了VIGS技術(shù)的發(fā)展。雖然現(xiàn)有的VIGS仍以RNA病毒載體為主，但已有多個(gè)DNA病毒及衛(wèi)星病毒被成功開發(fā)成VIGS載體，它們各自具有不同特點(diǎn)以及應(yīng)用范圍（表1）。

表1 VIGS載體及其在植物中的應(yīng)用Table1 VIGS vectors and their applications in plant

續(xù)表 Continued

構(gòu)建VIGS載體常用的RNA病毒有煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）［5］、馬鈴薯X病毒（potato virus X，PVX）［6］、煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）［9］、大麥條紋花葉病毒（barley stripe mosaic virus，BSMV）［15］、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）［28］和雀麥花葉病毒（brome mosaic virus，BMV）［23］等。1995 年，Kumagai等［5］首次基于煙草花葉病毒TMV構(gòu)建了VIGS載體，將編碼八氫番茄紅素合酶（phytoene synthase，PSY）的cDNA和編碼八氫番茄紅素去飽和酶（phytoene desaturase，PDS）的反義cDNA片段置于煙草花葉病毒亞基因組啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下。當(dāng)PDS表達(dá)水平受到抑制時(shí)，植物失去了類胡蘿卜素的光保護(hù)作用，光照后會(huì)出現(xiàn)葉片白化效應(yīng)。與預(yù)期結(jié)果一致，攜帶有反義PDS序列的TMV侵染煙草后，PDS的mRNA積累水平顯著降低，侵染一周后煙草葉片表現(xiàn)出白化表型［5］。此后，多種RNA病毒被成功開發(fā)成VIGS載體，它們被廣泛應(yīng)用于擬南芥、馬鈴薯、番茄、大麥、辣椒等植物中［32-34］。

基于TRV病毒構(gòu)建的VIGS體系具有寄主范圍廣、沉默效率高、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、病毒癥狀輕和可感染分生組織等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用最廣泛的VIGS系統(tǒng)［35］。TRV是一種土傳的桿狀RNA病毒，其基因組由2條RNA鏈——RNA1和RNA2組成（圖1B），其中，RNA1編碼RNA聚合酶、運(yùn)動(dòng)蛋白以及其他蛋白質(zhì)，RNA2主要編碼病毒外殼蛋白和介導(dǎo)線蟲傳播的29.4和32.8 kD蛋白［12］。Ratcliff等［9］在2001年構(gòu)建了TRV病毒的雙元載體 pBINTRA6（TRV1） 和 pTV00（TRV2），將RNA2序列中的29.4和32.8 kD蛋白編碼基因刪除，替換為1個(gè)多克隆位點(diǎn)（multiple cloning site，MCS），用于目的基因片段的插入（圖1B），并在本氏煙草中成功沉默了外源GFP及內(nèi)源PDS基因。改造后的TRV載體不會(huì)誘發(fā)明顯的病癥，避免了對(duì)基因沉默表型的影響。此外，TRV會(huì)造成頂端分生細(xì)胞的基因沉默，更利于產(chǎn)生表型一致的基因沉默植株［9］。

圖1 RNAi與VIGS作用機(jī)制（以TRV為例）Fig.1 Mechanism of RNAi and VIGS（taking TRV as an example）

植物DNA病毒也可以被改造為基因沉默載體，最早被發(fā)現(xiàn)的可用于構(gòu)建VIGS體系的DNA病毒是番茄金色花葉病毒（tomato goldenmosaic virus，TGMV）。Kjemtrup等［8］在 1998年首次以TGMV作為載體，在本氏煙草中分別沉默了鎂螯合酶的硫等位基因（SU）和外源螢火蟲螢光素酶基因（LUC）。在此之后，白菜曲葉病毒（cabbage leaf curl virus，CbLCV）［19］、非洲木薯花葉病毒（african cassava mosaic virus，ACMV）［20］等 DNA病毒均被用于VIGS體系的構(gòu)建。基于DNA病毒構(gòu)建的VIGS體系目前已經(jīng)被用于研究本氏煙草、擬南芥、棉花和木薯等植物的基因功能［33］。

衛(wèi)星病毒誘導(dǎo)的沉默系統(tǒng)(satellite virusinduced silencing system，SVISS)以衛(wèi)星病毒為載體。衛(wèi)星病毒是一類亞病毒，其基因組中往往僅含有編碼外殼蛋白的遺傳信息，需要依賴輔助病毒才能進(jìn)行核酸的復(fù)制與表達(dá)。2002年，Gosselé等[18]開發(fā)了一種全新的兩組分VIGS系統(tǒng)，并以衛(wèi)星煙草花葉病毒(STMV)為載體將抑制性RNA傳遞到煙草中，用煙草花葉病毒株U2(TMV-U2)作為輔助病毒幫助STMV復(fù)制與表達(dá)，在SR1型煙草中分別對(duì)PDS、chsA等基因進(jìn)行了沉默。此后又有多種衛(wèi)星病毒被用于構(gòu)建VIGS體系，在煙草、番茄和矮牽牛等植物中實(shí)現(xiàn)了目的基因沉默，如中國(guó)番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV）的 β 衛(wèi)星病毒[21]、木爾坦棉花曲葉病毒β衛(wèi)星病毒（cotton leaf curl Multan virus,CLCuMV）[36]等。衛(wèi)星病毒和輔助病毒的二元體系將基因沉默誘導(dǎo)組分與病毒復(fù)制的輔助組分相互分離，提升了VIGS體系的穩(wěn)定性，為進(jìn)一步改良植物VIGS系統(tǒng)提供了參考。

2.2 VIGS技術(shù)的拓展

2.2.1 小RNA介導(dǎo)的VIGS 病毒誘導(dǎo)的小RNA介導(dǎo)的基因沉默（microRNA-mediated virusinduced gene silencing,MIR-VIGS）是結(jié)合 MIGS（microRNA-induced gene silencing）和 VIGS為一體的基因沉默技術(shù)。植物編碼的miRNA能夠被DCL1與RNAseⅢ酶切割，形成大約22 bp的成熟雙鏈miRNA，與AGO2蛋白結(jié)合后可識(shí)別內(nèi)源靶基因mRNA，造成mRNA降解或翻譯抑制[37]。Schwab等[38]利用內(nèi)源microRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和加工過(guò)程，設(shè)計(jì)出了可以特異靶向目標(biāo)基因的人工合成microRNA（artificial microRNAs,amirRNAs）。隨后，Tang等[39]將MIGS和VIGS技術(shù)結(jié)合發(fā)展出了MIR-VIGS，成功沉默了煙草中的SGT1基因，導(dǎo)致煙草喪失了對(duì)煙草花葉病毒的抗性（圖2A）。傳統(tǒng)的VIGS通過(guò)切割200～600 bp插入片段產(chǎn)生一系列21～24 nt的siRNA靶向降解目的基因mRNA，這可能會(huì)造成非特異性基因沉默。在MIR-VIGS中，病毒載體被用來(lái)傳遞靶向特異性更高的amirRNAs，降低了VIGS的非靶向沉默概率。

圖2 MIR-VIGS與HIGS技術(shù)機(jī)理Fig.2 Mechamism of MIGS-VIGS and HIGS

2.2.2 寄主誘導(dǎo)的基因沉默 寄主誘導(dǎo)的基因沉默（host-induced gene silencing，HIGS）是對(duì)傳統(tǒng)VIGS應(yīng)用的另一個(gè)重要拓展。Nowara等［40］研究發(fā)現(xiàn)，將病原體基因片段載入病毒載體并感染寄主植物后，寄主細(xì)胞中會(huì)產(chǎn)生dsRNA，這些dsRNA在病原體感染寄主時(shí)會(huì)進(jìn)入病原體中，從而引起病原體發(fā)生PTGS（post-transcriptional gene silencing），下調(diào)病原體目標(biāo)基因的表達(dá)或?qū)е缕鋯适Чδ埽▓D2B），這是HIGS概念首次被提出。HIGS將VIGS沉默對(duì)象從植物內(nèi)源基因拓展到病原體基因，根據(jù)病原體表型的變化可以對(duì)病原體目標(biāo)基因的功能進(jìn)行研究。

HIGS已成功應(yīng)用于作物的病蟲害防治研究中［9，41］。2007 年，Valentine等［42］將線蟲基因片段裝載入TRV載體后侵染擬南芥，成功抑制了擬南芥根部寄生線蟲體內(nèi)目標(biāo)基因的表達(dá)。通過(guò)HIGS沉默線蟲基因，如酪氨酸磷酸酶基因、鈣網(wǎng)蛋白基因Mi-CRT、寄生基因8D05等，可以提高植物對(duì)線蟲的抵抗力［43］。2010年，Nowara等［40］通過(guò)BSMV介導(dǎo)的基因沉默成功抑制了小麥白粉菌表達(dá)效應(yīng)基因，使得小麥對(duì)白粉病的抗性提高。2013年，Panwar等［44］通過(guò)BSMV介導(dǎo)的HIGS成功抑制了小麥條銹病菌致病基因在宿主中的表達(dá)，提高了小麥的抗條銹病能力。

2.3 VIGS接種方式的發(fā)展

影響VIGS應(yīng)用的另一個(gè)關(guān)鍵因素是，如何將病毒載體投送至植物細(xì)胞誘發(fā)基因沉默。VIGS技術(shù)發(fā)展早期通常以體外轉(zhuǎn)錄的方式生產(chǎn)感染性病毒RNA，然后混合石英砂，使用摩擦接種法造成葉片表面微傷來(lái)感染植物葉片細(xì)胞［5］。這種方法操作復(fù)雜、效率較低、對(duì)植物葉片損傷較大且不易高通量侵染，目前僅在單子葉植物中應(yīng)用。

對(duì)于有肥厚葉片的雙子葉植物而言，葉片注射接種法更加簡(jiǎn)便。葉片注射法使用不帶針頭的注射器將配好的侵染液打入植物葉片背面以侵染細(xì)胞［45］。此外，Ryu等［46］利用TRV-VIGS系統(tǒng)通過(guò)根吸收法成功沉默了煙草的PDS基因。Yan等［47］使用TRV-VIGS系統(tǒng)利用真空浸透法侵染發(fā)芽后的種子，成功沉默了番茄中的PDS基因。根吸收法、真空浸透法在操作上更加簡(jiǎn)單、更利于VIGS的高通量應(yīng)用，但其沉默效率，尤其是對(duì)植物地上部基因的沉默效率相比于葉片注射法仍有不足，其應(yīng)用很少。目前，多數(shù)雙子葉植物的VIGS研究仍廣泛采用葉片注射法。

將病毒載體裝入Ti質(zhì)粒，利用Ti侵染植物細(xì)胞后投送表達(dá)病毒載體，避免體外轉(zhuǎn)錄病毒的繁瑣過(guò)程，可以極大地簡(jiǎn)化VIGS的病毒接種。此外，煙草是多種植物病毒的宿主，因此可以先用農(nóng)桿菌接種煙草葉片，大量生產(chǎn)病毒粗提液用于后續(xù)VIGS［48］。利用煙草生產(chǎn)病毒，不僅省去體外轉(zhuǎn)錄病毒的繁瑣過(guò)程，而且這些病毒以煙草葉片或粗提液的形式可長(zhǎng)期保存，進(jìn)一步方便了VIGS的應(yīng)用。

3 VIGS在作物中的應(yīng)用

VIGS具有不需要遺傳轉(zhuǎn)化、簡(jiǎn)單高效、無(wú)品種依賴性等優(yōu)點(diǎn)，使其非常適合于遺傳轉(zhuǎn)化困難作物的基因功能研究。隨著適用于不同糧食、果蔬和經(jīng)濟(jì)作物的VIGS系統(tǒng)被陸續(xù)構(gòu)建（表1），VIGS已在重要農(nóng)藝性狀基因的功能解析研究中展示了其應(yīng)用價(jià)值。

3.1 VIGS在單子葉作物中的應(yīng)用

在水稻、小麥、玉米等重要單子葉作物中，應(yīng)用較多的VIGS系統(tǒng)主要有BSMV、BMV、CMV以及TRV等。2002年，Holzberg等［15］使用BSMV成功沉默了大麥的PDS基因，這是VIGS技術(shù)在單子葉植物中的首次應(yīng)用。隨后，Scofield等［16］驗(yàn)證了BSMV-VIGS體系在六倍體小麥中的可行性，拓展了BSMV載體的應(yīng)用范圍。2011年，Yuan等［17］使用煙草生產(chǎn)BSMV病毒粗提勻漿，并使用BSMV勻漿在本氏煙草、小麥以及大麥中簡(jiǎn)單、高效地沉默了PDS、ChlH等基因。Yuan等［17］沉默了小麥中與擬南芥PMR5基因同源的TaPMR5基因后，小麥對(duì)于白粉病的抗性明顯減弱，從而驗(yàn)證了其基因家族在單子葉植物和雙子葉植物中具有相似的功能。王蓉［29］利用CMV建立了可以高效沉默玉米基因的CMV-VIGS系統(tǒng)，并沉默了玉米的ZmIspH基因，被沉默植株葉片中葉綠素和類胡蘿卜素含量顯著降低，且接種60 d后該基因表達(dá)仍被抑制。CMV-VIGS系統(tǒng)為研究玉米基因功能提供了高效便捷的工具。

3.2 VIGS在棉花中的應(yīng)用

棉花是重要的天然纖維作物，利用VIGS技術(shù)已經(jīng)鑒定多個(gè)棉花抗病相關(guān)基因。Gao等［10］利用TRV載體沉默GhNDR1基因和GhMKK2基因后，發(fā)現(xiàn)超過(guò)80%和65%的棉花嚴(yán)重地感染黃萎病，說(shuō)明GhNDR1和GhMKK2基因在棉花抗黃萎病過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。Tuttle等［26］開發(fā)了基于棉花葉皺縮病毒（cotton leaf crumple virus，CLCrV）的棉花沉默載體，利用基因槍技術(shù)接種CLCrV沉默ChlI基因后，棉花葉片出現(xiàn)黃化表型。2012年，Tuttle等［27］進(jìn)一步開發(fā)出了可用農(nóng)桿菌葉片注射接種的CLCrV基因沉默系統(tǒng)，產(chǎn)生了與基因槍法等效的基因沉默，簡(jiǎn)化了CLCrV-VIGS體系在棉花中的應(yīng)用。

在對(duì)棉花品質(zhì)相關(guān)基因的研究中，Qu等［11］使用TRV系統(tǒng)對(duì)棉花的真葉和根進(jìn)行侵染，對(duì)KATANIN和WRINKLED1基因在棉花發(fā)育過(guò)程中的功能進(jìn)行了研究，首次證明了TRV-VIGS體系在棉花生殖器官中的有效性。結(jié)果顯示，沉默KATANIN基因后，棉花纖維長(zhǎng)度變短而種子的含油量增加，而WRINKLED1基因被沉默后，棉花纖維長(zhǎng)度增加，但種子的含油量降低。該研究驗(yàn)證了通過(guò)重新分配碳流量增加棉花纖維長(zhǎng)度的可行性，為研究棉花纖維發(fā)育機(jī)制和改良棉花纖維品質(zhì)拓展了全新的思路。

3.3 VIGS在蔬菜中的應(yīng)用

VIGS技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于多種蔬菜作物的功能基因研究。馬紅珍［49］建立了番茄TRV-VIGS體系，對(duì)DL-II-C1基因功能進(jìn)行驗(yàn)證，用攜帶目標(biāo)基因的重組病毒載體感染具有白粉病抗性的番茄植株，使其失去了抗病性，證實(shí)了DL-II-C1是番茄白粉病抗性的相關(guān)基因。2019年，Chen等［50］使用TRV-VIGS系統(tǒng)成功沉默了番茄中的MYB80基因，通過(guò)評(píng)估植物在4℃條件下的冷害指數(shù)，證實(shí)MYB80基因與番茄植物的耐寒性有關(guān)，而MYB80基因的沉默降低了其耐寒性。辣椒是一種較難進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的物種，Choi等［31］于2019年，開發(fā)了基于蠶豆萎蔫病毒（broad bean wilt virus，BBWV）的VIGS載體，并在各種辣椒品種中成功地沉默了PDS基因，為辣椒基因功能研究提供了新的VIGS工具。2012年，Liu等［12］以TRV為載體感染茄子，抑制了茄子PDS基因的表達(dá)，首次證實(shí)TRV-VIGS系統(tǒng)可用于茄子的基因沉默。

3.4 VIGS在果樹中的應(yīng)用

果樹生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，應(yīng)用遺傳轉(zhuǎn)化研究果樹基因功能的時(shí)效性較差，因此，非轉(zhuǎn)基因的VIGS技術(shù)是研究果樹基因功能的重要工具。目前，在果樹研究中使用的VIGS載體種類仍比較有限，主要有蘋果潛隱球型病毒（apple latent spherical virus，ALSV）、TRV和柑橘葉斑駁病毒（citrus leaf blotch virus，CLBV）載體［51］。

ALSV可用于侵染蘋果、梨等薔薇科果樹，且引起的癥狀較輕。2011年，Sasaki等［25］從蘋果中提取rbcS基因后構(gòu)建ALSV-rbc201重組載體，使用微粒轟擊法侵染蘋果和梨樹剛發(fā)芽的子葉，2至3周后，實(shí)驗(yàn)組植株均出現(xiàn)了與敲除rbcS基因后相同的表征。Sasaki等［25］利用ALSV沉默了控制蘋果開花時(shí)間的基因TFL1，約有10%的植株在侵染后2個(gè)月內(nèi)開花并結(jié)出果實(shí)，而使用空載體侵染的對(duì)照組則沒(méi)有花蕾形成。該研究表明，ALSV-VIGS系統(tǒng)可以在蘋果、梨等薔薇科果樹中沉默靶基因，但ALSV載體只能用于感染植物韌皮部，仍存在一定的局限性。

TRV-VIGS系統(tǒng)可以高效地感染多種果樹，并引發(fā)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的基因沉默，在果樹基因功能研究中應(yīng)用較為廣泛。Li等［13］在蘋果果實(shí)中首次成功應(yīng)用TRV-VIGS體系沉默了蘋果乙烯合成基因MdACS6，在MdACS6基因被沉默的果實(shí)中幾乎沒(méi)有乙烯存在。Li等［14］利用TRV系統(tǒng)沉默了荔枝的果色控制基因LcUFTG1，沉默植株果皮著色延遲，果實(shí)中花青素積累受阻。Jia等［52］利用TRV-VIGS系統(tǒng)成功沉默了草莓中的FaABI1（abelson interactor 1）基因，發(fā)現(xiàn)該基因沉默后果實(shí)提前成熟。

VIGS技術(shù)可被用于研究幼年期較長(zhǎng)的柑桔類植物的基因功能。2012年，Agüero等［30］開發(fā)了基于柑桔葉斑駁病毒（citrus leaf blotch virus，CLBV）的VIGS載體，并成功沉默了柑桔的PDS基因，這是VIGS技術(shù)在柑桔植物中的首次應(yīng)用。CLBV在大多數(shù)柑桔類植物中的感染是無(wú)癥狀的，且能夠在非韌皮部組織中誘導(dǎo)基因沉默，可以作為研究柑桔類植物基因功能的良好工具。

3.5 VIGS在藥用植物中的應(yīng)用

藥用植物是一類具有藥物屬性的特殊作物，但目前其功能基因研究方法十分有限。2018年，Zhou等［53］利用TRV作為病毒載體，沉默了加利福尼亞罌粟中的PDS、ZDS、βOH和ZEP基因，使總色素濃度降低了75%～90%，并成功改變了花瓣的顏色，研究了花瓣類胡蘿卜素代謝物的分布。2019年，Schachtsiek等［54］通過(guò) CLCrV-VIGS系統(tǒng)成功沉默了大麻中的ChlI和PDS基因，形成光漂白表型，并且分別伴隨著葉綠素a和類胡蘿卜素含量的降低?？梢韵胂?，VIGS系統(tǒng)也將被廣泛應(yīng)用于中草藥的藥理研究。

4 影響VIGS效率的因素

4.1 環(huán)境因素

環(huán)境對(duì)于病毒在植物中的復(fù)制和擴(kuò)散有著重要的影響，因此也會(huì)影響病毒誘導(dǎo)的基因沉默效率。Fu等［55］研究發(fā)現(xiàn)，接種了TRV-PDS的番茄植株及其花朵和果實(shí)在低溫（15℃）和低濕度（30%）條件下沉默效率更高。Burch-Smith等［56］研究認(rèn)為，在溫度為21℃或更低時(shí)，利用TRV沉默番茄基因可以形成較好的沉默表型。使用TRV為載體侵染本氏煙草時(shí)，理想的溫度約為25℃。Tuttle等［26］研究發(fā)現(xiàn)，其在棉花中構(gòu)建的CLCrVVIGS體系在較低溫度下可產(chǎn)生更廣泛和持久的基因沉默。針對(duì)不同的作物和載體，應(yīng)當(dāng)選擇合適的溫度以使基因沉默更加高效。

4.2 病毒載體

為了防止病毒載體引起作物病毒的大規(guī)模傳播以及本地植物的大量感染，在選擇VIGS病毒載體時(shí)最好選用當(dāng)?shù)匾呀?jīng)存在的、不能被昆蟲傳播的、毒性較弱的毒株，同時(shí)還要避免因病毒載體毒性過(guò)強(qiáng)而導(dǎo)致宿主死亡，或因病毒載體自身引起的病癥而導(dǎo)致基因沉默性狀無(wú)法被觀測(cè)。當(dāng)選取致病性較強(qiáng)的病毒作為載體時(shí)，可以通過(guò)基因敲除或突變等方式對(duì)病毒進(jìn)行改造后再應(yīng)用于VIGS體系中［1］。

4.3 插入基因片段

插入片段與靶基因的同源性對(duì)提升VIGS的效率十分重要，同源性越高，基因沉默效果越好。若VIGS產(chǎn)生的siRNA和目標(biāo)mRNA的序列一致性少于11 bp，基因沉默的效率會(huì)顯著降低［32］。如果選取了不合適的基因片段，可能會(huì)造成基因沉默的“脫靶”，無(wú)法得到期望的沉默表型［44］。為了降低脫靶的風(fēng)險(xiǎn)，Xu等［57］基于Web開發(fā)了一種名為siRNA Scan的計(jì)算工具，用于識(shí)別潛在的脫靶目標(biāo)，以便構(gòu)建更合適的VIGS載體，減少“脫靶”率。對(duì)于植物中大量存在的基因家族，應(yīng)選擇該基因家族的保守區(qū)以沉默一個(gè)基因家族中的多個(gè)基因，防止基因之間功能互補(bǔ)導(dǎo)致沉默效果不佳。如果目標(biāo)基因是某一基因家族中的單個(gè)基因，插入片段應(yīng)該是該基因的特異序列，避免有超過(guò)23個(gè)核苷酸序列與其他家族成員相同［35］。

插入片段的長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)也對(duì)VIGS的效率有著關(guān)鍵影響。病毒在細(xì)胞之間的移動(dòng)性受限于其序列的大小，因此插入序列的長(zhǎng)度不能過(guò)長(zhǎng)。目前通常認(rèn)為，插入片段長(zhǎng)度的極限為1.5 kb，若超過(guò)這一上限，病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)移可能會(huì)受到阻礙，病毒可能不會(huì)傳播或丟失插入片段的可能性增加。Thomas等［58］研究認(rèn)為，插入片段長(zhǎng)度的下限是23 nt，但是23 nt的長(zhǎng)度一般情況下不能成功使靶基因沉默［15］，實(shí)際操作中應(yīng)選擇較長(zhǎng)的序列。目前認(rèn)為，使用300～500 nt作為插入片段的長(zhǎng)度較為合適［56］。Lacomme等［59］等將40～60 bp的反向重復(fù)序列插入病毒載體中，形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)（hairpin），相比由cDNA片段構(gòu)建的載體，產(chǎn)生了更強(qiáng)的 VIGS表型，根據(jù) RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction）檢測(cè)結(jié)果，通過(guò)添加反向重復(fù)序列構(gòu)建的載體使植物組織中靶基因mRNA的積累減少了3倍，表明在植物病毒載體中插入小的反向重復(fù)序列可以顯著地改善VIGS的沉默效率，dsRNA的形成可能有助于提高VIGS強(qiáng)度。

4.4 侵染方式

不同的侵染方式會(huì)在一定程度上影響基因沉默的效率，應(yīng)根據(jù)宿主和病毒載體之間的選擇性、宿主本身的特性以及目的基因的表達(dá)特性選擇合適的接種方法。目前常用的侵染方法有葉片注射法、摩擦接種法、微粒轟擊法、根吸收法、真空滲透法等。不同的接種方法對(duì)不同部位、不同時(shí)期的基因沉默有不同效應(yīng)，如葉片注射法和摩擦接種法多用于沉默幼苗期的基因，根吸收法以及真空滲透法則可以用于更早期的基因沉默。需進(jìn)一步開發(fā)不同時(shí)期的不同侵染方法以進(jìn)一步拓展VIGS的應(yīng)用。

5 VIGS的檢測(cè)

病毒被接種到植物中后，會(huì)隨著植物的生長(zhǎng)逐漸分布于整個(gè)植株中并誘發(fā)系統(tǒng)性的基因沉默。通常通過(guò)提取新生葉片的RNA［35］，使用定量或半定量RT-PCR的方法檢測(cè)靶基因的沉默情況。通過(guò)檢測(cè)試驗(yàn)組與對(duì)照組樣本中靶基因mRNA的含量來(lái)判斷基因沉默的效率。需要注意的是，設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)避免在病毒攜帶的靶基因序列片段內(nèi)擴(kuò)增，否則會(huì)同時(shí)檢測(cè)到復(fù)制后的病毒載體RNA，進(jìn)而影響RT-PCR檢測(cè)結(jié)果。

6 VIGS存在的問(wèn)題及解決方法

盡管VIGS不依賴遺傳轉(zhuǎn)化、接種方便且沉默效率高，但VIGS技術(shù)仍有一定的局限性，不能完全沉默基因，某些基因只需少量mRNA即可表達(dá)自身的功能，因此無(wú)法通過(guò)VIGS進(jìn)行功能鑒定。但從另一方面看，這也是VIGS的優(yōu)勢(shì)，VIGS的不完全沉默非常適合一些突變致死基因的功能研究。非特異性基因沉默也是VIGS試驗(yàn)必需考慮的問(wèn)題，300～500 bp的插入片段會(huì)產(chǎn)生一系列21～24 nt的siRNA，這可能會(huì)造成非靶向沉默，因此，開展試驗(yàn)前需要認(rèn)真分析靶向基因的序列特征，選擇特性強(qiáng)的片段以降低“脫靶”率，或者選擇特異性更強(qiáng)的MIR-VIGS系統(tǒng)。同樣的，VIGS易于非靶向沉默的特征使其可以同時(shí)沉默序列相似、功能冗余的多個(gè)基因，也是其優(yōu)勢(shì)之一。

另外，VIGS造成的基因沉默效果不夠均一，同一植株不同組織的沉默效率可能不同，同批植物不同植株間的沉默水平也可能存在差異。VIGS效果不均一的不足可以通過(guò)增加試驗(yàn)重復(fù)以及優(yōu)化侵染方法來(lái)改善。2017年，Cheuk等［60］利用含BSMV顆粒的病毒勻漿侵染不同植物種子時(shí)發(fā)現(xiàn)，與病毒勻漿介導(dǎo)的葉片摩擦法相比，病毒勻漿介導(dǎo)的種子吸漲法接種的VIGS的病毒擴(kuò)散程度更加均一，可獲得較好的沉默表型，并可傳遞到下一代。

病毒的宿主范圍是限制VIGS應(yīng)用的重要因素之一，目前應(yīng)用最廣泛的TRV-VIGS系統(tǒng)，在某些非宿主植物中無(wú)法誘導(dǎo)基因沉默。為解決這一問(wèn)題，研究人員需要根據(jù)研究的植物選擇合適的病毒載體，當(dāng)前已經(jīng)開發(fā)出了多種適用于不同作物的VIGS病毒載體，隨著更多的植物病毒被鑒定，未來(lái)也將會(huì)有更多的病毒載體被開發(fā)用于VIGS。

此外，VIGS引起的沉默效果往往不能長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)，如TRV誘導(dǎo)的基因沉默表型會(huì)存在1～2個(gè)月，此后沉默強(qiáng)度逐漸減少甚至消失，因此不能用于研究植物生長(zhǎng)后期的基因功能。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，首先可以根據(jù)目標(biāo)基因的研究窗口選擇合適的病毒載體。目前研究發(fā)現(xiàn)，CLCrV、CMV以及CLBV的沉默持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)［26，28，30］。同時(shí)，研究人員也可以選擇合適的接種方式來(lái)延長(zhǎng)沉默時(shí)間。Senthil-kumar等［61］利用TRV-VIGS系統(tǒng)，同時(shí)使用葉片注射法和根吸收法感染植株，使目的基因沉默時(shí)間達(dá)到了2年以上，并且被感染植株的后代中也有部分植株出現(xiàn)基因沉默表型，證明VIGS在一定條件下是可被遺傳的，這一發(fā)現(xiàn)提升了VIGS的可用性，證明其具有用于研究植物發(fā)育不同階段基因功能的潛力。

7 展望

VIGS是一種簡(jiǎn)便、高效的轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)，相比轉(zhuǎn)基因、處理誘變等傳統(tǒng)基因沉默方法，使用VIGS可以快速、低成本地獲取靶向目標(biāo)基因沉默植株，極大地方便了植物基因功能的反向遺傳學(xué)研究。此外，VIGS載體可以裝載目標(biāo)病原體的相關(guān)基因，開發(fā)為植物的抗病“疫苗”，通過(guò)HIGS沉默病毒、細(xì)菌、真菌以及昆蟲等病原體的相關(guān)基因?qū)χ参镞M(jìn)行保護(hù)［6］，為植物病蟲害的預(yù)防提供了一種全新的途徑。目前，VIGS已成功用于多種作物重要農(nóng)藝性狀功能基因的挖掘，隨著對(duì)VIGS原理的深入了解、新病毒載體的開發(fā)以及分子生物學(xué)的不斷進(jìn)步，VIGS技術(shù)的局限性將逐步被克服。VIGS系統(tǒng)將會(huì)在更多的植物物種，尤其是在那些難以通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法分析的作物中得以應(yīng)用，成為后基因組時(shí)代作物基因功能研究的重要技術(shù)手段。