劉 瑾, 仇冬冬, 孫俊毅,3,楊冬梅,裴丹丹,4,茍建重,李 昂

(1.西安交通大學口腔醫(yī)院 陜西省顱頜面精準醫(yī)學研究重點實驗室,陜西 西安 710004; 2.西安交通大學口腔醫(yī)院 牙周科,陜西 西安 710004;3.西安交通大學口腔醫(yī)院 特診特需科,陜西 西安 710004; 4.西安交通大學口腔醫(yī)院 修復科,陜西 西安 710004)

藥物應用是牙周炎治療不可或缺的輔助手段,其中，中藥治療可避免西藥長期使用造成的口腔菌群失調(diào)和細菌耐藥性,同時具備效果穩(wěn)定、副作用小、多靶點治療等優(yōu)點,成為現(xiàn)代中醫(yī)藥研究的熱點之一[1-3]。研究表明,黃芩、骨碎補等中藥煎煮劑可明顯改善牙周炎癥狀下的菌群失調(diào),促進牙周組織新附著形成[4]。黃芩、骨碎補的有效成分與其他中藥配伍用藥可明顯降低牙周炎大鼠齦溝液、唾液及血液中PGE2和CRP水平，促進局部牙槽骨再生[5-8]。本課題組在前期研究中也發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應用骨碎補中的活性成分柚皮苷與黃芩中的活性成分黃芩素，可明顯增強人牙周膜細胞 (human periodontal ligament cells, hPDLCs) 的增殖、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性并促進礦化[9]。

局部緩釋制劑作為牙周局部藥物治療的重要方式,是指將藥物置于牙周袋內(nèi)緩慢釋放以減少給藥次數(shù)，提供比較平穩(wěn)的藥物濃度制劑。在目前常用的幾種牙周緩釋劑型中,原位凝膠制劑因具有使用方便、患者感覺舒適、藥物活性穩(wěn)定、流動性好等特點，較為廣泛地應用于臨床[10-13]。

因此, 本研究通過檢測不同中藥配比下hPDLCs產(chǎn)生ALP的含量,獲得黃芩提取物與骨碎補提取物最佳配伍質(zhì)量比;進一步制備芩補中藥緩釋凝膠,并通過對形態(tài)學、pH值、流變學、穩(wěn)定性、回收率及藥物體外釋放率等指標的考察,篩選藥物最佳緩釋濃度,為進一步考察芩補中藥緩釋凝膠用于實驗性牙周炎模型體內(nèi)治療的藥效學奠定實驗基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

倒置相差顯微鏡(Nikon,日本);TL-40B低速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);78HW-1恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機廠);AA-250電子分析天平(Denver,美國);LC-2010高效液相色譜儀(日本島津);SB5200DTD型超聲震蕩儀(寧波新芝生物科技股份有限公司);KDC-16H高速離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司);酸度計PHS-3C(雷磁,上海)。

1.2 試藥

骨碎補提取物(四川中藥研究所,活性成分柚皮苷含量30.71%);黃芩提取物(陜西飛達生物有限公司,活性成分黃芩素含量80%);DMEM/F12(Dulbecco eagle′s minimum essential medium,DMEM);I型膠原酶、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽(Sigma公司,美國); 胎牛血清 (fetal bovine serum,FBS,Gibco公司,美國); 胰蛋白酶(1∶10)(Hyclone公司,美國); L-谷氨酰胺(華美生物工程公司); Antibiotic-Antimycotic (Atlanta Biologicals公司,美國);SABC 免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、角蛋白單克隆抗體、波形蛋白單克隆抗體(博士德,武漢); 羥乙基纖維素(hydroxyethyl cellulose,HEC,天津愛勒易醫(yī)藥材料有限公司);聚丙烯酸樹脂(Eudragit RS PO,羅姆公司);甘油(國藥集團化學試劑有限公司);三乙酸甘油酯(glycerol triacetate,GTA,北京精求化工有限責任公司)。

2 方法

2.1 黃芩、骨碎補提取物溶液配制

分別稱取黃芩提取物、骨碎補提取物1 mg,用DMSO溶解成母液,過濾備用。用含10%FBS的DMEM細胞培養(yǎng)基配制成終濃度為黃芩提取物(以黃芩素為濃度監(jiān)測指標)100、10、1.0、0.l、0.01 mg·L-1的溶液;骨碎補提取物(以柚皮苷為濃度監(jiān)測指標)10、1.0、0.l mg·L-1的溶液,過濾除菌備用。

DMEM 培養(yǎng)基的配比:在超凈臺中,于成品DMEM培養(yǎng)基中加入10%的FBS,1%三抗,1% L-谷氨酰胺,1%Vitamin C,混勻,封口膜封口,4℃保存。

2.2 hPDLCs培養(yǎng)及鑒定[14]

在患者及家屬知情同意下, 選取 12～29 歲患者的健康正畸牙或阻生牙, 所選牙齒均無齲壞、 根尖周炎及牙周炎, 術前根尖片顯示所拔除牙齒根尖無明顯骨質(zhì)吸收、 牙周膜清晰完整。 采用酶消化結(jié)合組織塊法進行hPDLCs原代培養(yǎng): 拔牙后立即放入無菌含雙抗的PBS液中， 轉(zhuǎn)移至超凈工作臺后反復沖洗牙冠及牙根表面, 用無菌刀片刮除根中1/3牙周膜組織并剪碎, 11 200 r·min-1離心5 min, 移至小培養(yǎng)皿, 加入3 mg·mL-1Ⅰ型膠原酶1 mL,恒溫消化30 min。加入DMEM,1 000 r·min-1離心3 min,棄上清,加入含體積分數(shù)為20%FBS、三抗的DMEM培養(yǎng)基5 mL,吹打混勻移入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng), 3～4 d 換液去除未貼壁組織, 倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。 待細胞長滿瓶底約80%, 即可進行傳代培養(yǎng)。 將第3代hPDLCs制備成細胞爬片,HE 染色和sABC免疫組化染色后在光鏡下觀察細胞形態(tài),進行細胞鑒定。

2.3 ALP法檢測黃芩、 骨碎補提取物復方對hPDLCs成骨的影響

單味藥物實驗分組

1) 黃芩提取物組:黃芩素(100、10、1.0、0.l、0.01 mg·L-1)；

2) 骨碎補提取物組:柚皮苷(10、1、0.1 mg·L-1)。

復方藥物實驗分組

1) 1.0 mg·L-1黃芩提取物+骨碎補提取物(10、1、0.1 mg·L-1)；

2) 0.1 mg·L-1黃芩提取物+骨碎補提取物(10、1、0.1 mg·L-1)；

3) 0.01 mg·L-1黃芩提取物+骨碎補提取物(10、1、0.1 mg·L-1)。

取第 4 代 hPDLCs, 消化后調(diào)整細胞濃度至1×105mL-1,按照每孔200 μL 細胞懸液接種于96 孔板,標準環(huán)境下孵育24 h。按照上述分組外加1個陰性對照組,每組4個復孔,實驗組每孔加藥物培養(yǎng)液200 μL,對照組為 DMEM 液(含10%FBS)。作用5 d 后, 收集細胞培養(yǎng)上清液。 按照ALP試劑盒使用說明,在測定管、標準管、空白管中加入顯色劑1.5 mL混勻后,空白管調(diào)零,在波長520 nm下,用紫外分光光度儀測定各管吸光度(A520)值,再換算出各個樣本 ALP 的活性,并采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件做獨立樣本單因子變異數(shù)分析。

2.4 芩補中藥緩釋凝膠的制備

以羥乙基纖維素、甘油、聚丙烯酸樹脂、三乙酸甘油酯為主要輔料，分別制備了濃度為2%、4%、6%的芩補中藥緩釋凝膠(即黃芩、骨碎補提取物復方占總凝膠成分的質(zhì)量分數(shù)為2%、4%、6%)。制備過程如下:

1) 取處方量的甘油保持90℃～100℃恒溫,加入處方量羥乙基纖維素,高速攪拌至完全溶解后降溫至45℃～50℃,按質(zhì)量比1∶1的比例加入處方量黃芩、骨碎補提取物,低速攪拌至溶解;

2) 另取處方量的三乙酸甘油酯保持45℃～50℃恒溫,攪拌下加入處方量聚丙烯酸樹脂,至完全溶解后,低速攪拌加入到步驟1)中,45℃～50℃保溫條件下攪拌至均質(zhì)即得芩補中藥緩釋凝膠。

2.5 芩補中藥緩釋凝膠制劑學考察

2.5.1 形態(tài)學考察 按2.4方法制備芩補中藥緩釋凝膠,觀察其物理性狀。

2.5.2 pH值考察 取緩釋凝膠0.5 g,置于50 mL純化水中,靜置1～7 d,使用酸度計每日檢測pH值。

2.5.3 穩(wěn)定性考察

1) 冷凍試驗:將復方中藥緩釋凝膠置于-20℃冰箱,24 h后復融,觀察凝膠有無分層及顏色改變。

2) 加熱試驗:將復方中藥緩釋凝膠置于50℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)3個月,觀察凝膠有無分層及顏色改變。

3) 離心試驗:將復方中藥緩釋凝膠置于離心管中,3 500 r·min-1離心30 min,觀察凝膠是否分層。

4) 流動性試驗:采用目測方法,觀察不同濃度復方中藥緩釋凝膠的流動性。

2.5.4 體外釋放率的測定 色譜條件:色譜柱(shimadzu VP-ODS 柱),流動相：甲醇∶水(體積分數(shù)0.4%冰醋酸,體積分數(shù)0.2%三乙胺)=40∶60,流速0.8 mL·min-1,柱溫37℃,檢測波長280 nm，進樣量10 μL。

對照品配置:分別精密稱取柚皮苷、黃芩素標準品10 mg置10 mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容,搖勻作為對照品貯備液。

1) 系統(tǒng)適應性考察:精密吸取對照品溶液、藥物緩釋液、空白凝膠緩釋液各10 μL,在上述色譜條件下檢測。

2) 線性試驗:分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的對照品貯備液于10 mL容量瓶中,用甲醇將其稀釋成10、20、30、40、50 μg·mL-1的系列濃度標準溶液,分別進樣測定,記錄色譜圖,進行線性分析。以峰面積A為橫坐標,濃度C為縱坐標,進行線性回歸。

3) 精密度試驗:精密吸取同一對照品溶液,在280 nm處連續(xù)測5次。記錄峰面積,并計算峰面積相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)值。

4) 回收率試驗:取黃芩、骨碎補提取物適量,精密稱定,用甲醇溶解定容至刻度,分別制成含黃芩素、柚皮苷濃度為30、40、50 μg·mL-1的樣品溶液。在280 nm條件下檢測并按照線性回歸方程計算濃度。

5) 體外緩釋試驗:取約0.5 g制備好的芩補中藥緩釋凝膠注入自制的擴散池中均勻鋪開,將其加入含50 mL去離子水的燒杯中,加蓋密封,放入恒溫空氣浴搖床(37℃,轉(zhuǎn)速40 r·min-1)中,分別于1～7 d后將容量瓶中溶液全部取出,再補加相同溫度的釋放介質(zhì)50 mL,放回。取釋放介質(zhì)液20 μL,40 μmm濾膜過濾,用HPLC法檢測釋放液中藥物的含量,計算出一定時間點黃芩素、柚皮苷的釋放率和累積釋放率。

3 結(jié)果

3.1 hPDLCs培養(yǎng)及鑒定

采用酶消化結(jié)合組織塊法,1周即可看到hPDLSs從組織塊周圍爬出并貼壁生長;4周后細胞生長速度加快并呈一定方向排列(見圖1A，B); HE染色后,光鏡下觀察到細胞呈長梭形或多角形,有數(shù)個長短不一的突起,胞體豐滿,胞漿著紅色，胞核著藍紫色(見圖1C);免疫組化染色后,可見抗波形蛋白染色陽性胞漿呈棕黃色(見圖1D),角形蛋白染色陰性(見圖1E)，說明所培養(yǎng)的細胞來源于外胚層間充質(zhì),而非上皮組織。結(jié)合取材部位及細胞形態(tài)學觀察可以確定是 hPDLCs。

A 原代培養(yǎng)1周：組織塊周圍長出的hPDLCs(200×)；B 原代培養(yǎng)4周：待傳代的hPDLCs呈放射狀及漩渦狀(200×)；C HE染色：細胞呈長梭形或多角形，有數(shù)個長短不一的突起(1 000×)；D 波形蛋白染色陽性(1 000×)；E角形蛋白染色陰性(1 000×)圖1 hPDLCs的培養(yǎng)及鑒定 Fig.1 Culture and identification of hPDLCs

3.2 ALP法檢測黃芩、骨碎補提取物復方對hPDLCs成骨的影響

不同配比的黃芩和骨碎補提取物復方對細胞ALP活性的影響不同,但普遍高于單味藥物對細胞ALP活性的促進作用。其中，ALP活性值最高的組方為1 mg·L-1黃芩提取物與1 mg·L-1骨碎補提取物(質(zhì)量比1∶1),其明顯高于對照組及單味藥組的促進作用,且有顯著性差異(*p<0.05;**p<0.01)(見表1)。

表1 不同濃度和配比的黃芩提取物和骨碎補提取物對hPDLCs堿性磷酸酶活性的影響Tab.1 Effect of naringin and baicalin combination on ALP activity of

續(xù)表1

3.3 芩補中藥緩釋凝膠制劑學考察

3.3.1 形態(tài)學考察 黃芩、骨碎補提取物按黃芩素與柚皮苷質(zhì)量比1∶1制備2%、4%、6%不同濃度的緩釋凝膠,外觀為黃褐色乳膏狀,具有一定的稠度,呈非自由流動的流體狀態(tài)(見圖2)。

圖2 4%濃度的芩補緩釋凝膠Fig.2 4% concentration of qinbu sustained-release gel

3.3.2 pH值考察 制備的2%、4%、6%凝膠pH值為7.2～7.4(見表2),符合《中國藥典》2020版規(guī)定的凝膠制劑pH值不超過8.0的要求。

表2 不同濃度的芩補緩釋凝膠pH值Tab.2 pH values of qinbu sustained-release gel at different concentrations

3.3.3 穩(wěn)定性考察 由表3可知,2%、4%、6%三種濃度的凝膠離心、冷凍、加熱后均不分層、不變色,其中2%、4%的凝膠流動性較好,但6%芩補中藥緩釋凝膠流動性及通針性差,故選擇2%、4%濃度的芩補中藥緩釋凝膠用于下一步實驗。

表3 2%、4%、6%濃度的芩補中藥緩釋凝膠穩(wěn)定性考察Tab.3 Stability of qinbu sustained-release gel with different concentrations of 2%, 4%，6%

3.3.4 體外釋放率的測定

1) 系統(tǒng)適應性考察:藥物緩釋液和對照品液在相應的位置上均出現(xiàn)色譜峰,且藥物緩釋液色譜峰中基線穩(wěn)定,分離度良好?？瞻啄z液在該位置沒有峰出現(xiàn),說明基質(zhì)液對藥物檢測無干擾(見圖3～6)。

圖3 柚皮苷對照品色譜圖Fig.3 Chromatogram of naringin reference substance

圖4 黃芩素對照品色譜圖Fig.4 Chromatogram of baicalein reference substance

圖5 芩補凝膠色譜圖Fig.5 Chromatogram of qinbu gel

圖6 空白凝膠色譜圖Fig.6 Chromatogram of blank gel

2) 線性試驗: 經(jīng)計算得柚皮苷在0.1～20 μg·mL-1的范圍內(nèi)線性關系良好，回歸方程為A=2.4E-5C+0.094 4R2=0.999 6;黃芩素在1～50 μg·mL-1的范圍內(nèi)線性關系良好,回歸方程為A=1.6E-5C+2.618 6R2=0.993 1。

3) 精密度試驗：測得黃芩提取物峰面積RSD為0.15%,柚皮苷峰面積RSD為0.29%,表明儀器性能穩(wěn)定。

4) 回收率試驗:黃芩素、柚皮苷精密度分別為RSD 0.15% (n=5)、0.29%(n=5)，分別測量黃芩素、柚皮苷低、中、高(30、40、50 μg·mL-1)3個質(zhì)量濃度的平均回收率為黃芩素99.62%,RSD 0.288%(n=9);柚皮苷99.02%,RSD 0.417%(n=9)。

5) 體外緩釋試驗:由圖7可知,質(zhì)量分數(shù)2%、4%的芩補中藥緩釋凝膠中藥物釋放均可分為2個階段:第一階段，是將凝膠注入到去離子水中至凝膠凝結(jié)后,在該階段存在“突釋”現(xiàn)象,即2%、4%濃度的芩補緩釋凝膠中柚皮苷在第2天的釋放率相較于第1天分別增長了12%和22%,黃芩素則分別增長了20%和19%;第二階段，是凝膠凝結(jié)后穩(wěn)定釋藥階段,釋放率基本穩(wěn)定。存在“突釋”現(xiàn)象的原因，是由于凝膠中的聚丙烯酸樹脂具有網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)和親水基團,吸水膨脹倍數(shù)較高,其凝膠結(jié)構(gòu)水通道空腔尺寸大導致藥物沿孔道迅速釋放，產(chǎn)生了“突釋”現(xiàn)象。此外,2%、4%濃度的芩補緩釋凝膠中黃芩素的“突釋”現(xiàn)象也可能與黃芩素易于降解有關。4%濃度的芩補中藥緩釋凝膠中黃芩素和柚皮苷的釋放曲線良好，且7天累積釋放率達80%以上。因此，4%濃度為芩補中藥緩釋凝膠的最優(yōu)處方。

圖7 芩補中藥緩釋凝膠中黃芩素、柚皮苷7d累積釋放情況Fig.7 7 days cumulative release of naringin and baicalin in qinbu sustained-release gel

4 討論

牙周局部用藥的方式包括:含漱、局部沖洗、涂布，以及牙周袋內(nèi)應用緩釋和控釋藥物等。前三者作用時間短,對牙周袋內(nèi)的菌群無顯著影響。緩釋和控釋藥物則能直接靶向作用于牙周袋內(nèi)的病變組織，使病變局部較長時間維持有效藥物濃度，達到抑菌、殺菌等目的。目前，常用的幾種緩釋劑型包括纖維條、膜劑、微球、棒劑、原位凝膠等,各具優(yōu)缺點。纖維條使用方便、用藥量少,但因其不可吸收,影響創(chuàng)口愈合;膜劑可吸收,但可變性差,易脫膜,易造成患者不適;微球可降解,但因其突釋效應導致規(guī)模化生產(chǎn)困難;棒劑起效快,用藥量少,但藥物釋放率低,患者體驗感差;原位凝膠(如派麗奧)因其具有流動性好、與牙周袋形狀貼合等優(yōu)勢近年來備受臨床醫(yī)生青睞[15-16]。因此，本研究采取原位凝膠緩釋劑型。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素、骨碎補柚皮苷均可促進hPDLCs增殖,骨碎補柚皮苷對hPDLCs成骨還有促進作用。前期制備的黃芩提取物緩釋凝膠對小型豬牙周炎具有明顯的消炎作用,但無明顯成骨作用。因此，本研究根據(jù)中醫(yī)配伍理論,將黃芩提取物與骨碎補提取物按一定比例混合,采用ALP法測定單味及中藥復方對人牙周膜細胞成骨的影響,證實復方中藥的成骨作用優(yōu)于單味中藥,得到黃芩提取物與骨碎補提取物最佳質(zhì)量比為1∶1,進一步制備芩補緩釋凝膠,利用高效液相色譜法(HPLC)[17-19]等對其進行了形態(tài)學及穩(wěn)定性分析,結(jié)果符合凝膠制劑的質(zhì)量標準[20]。最終確定4% 的芩補緩釋凝膠釋放效果最優(yōu),7 d累計釋放率均可達 80%以上。后續(xù)還將對該芩補緩釋凝膠的毒理作用進行深入研究,為臨床牙周炎藥物應用奠定基礎。