曾 錦，魯 藝，徐 銳*，孫 蓉，劉 瑩，曾維慶，岳志強(qiáng),周 鷹

(1.云南師范大學(xué) 能源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650500;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)設(shè)施與裝備研究所，江蘇 南京 210014；3.玉溪市農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)和農(nóng)村能源工作站，云南 玉溪653100;4.九溪鎮(zhèn)規(guī)劃建設(shè)和環(huán)境保護(hù)中心，云南 玉溪 652604))

隨著人民生活水平提高，中國的畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，畜禽糞便的處理方式也在不斷完善，其中，沼氣池因其諸多優(yōu)勢(shì)，被廣泛地運(yùn)用在農(nóng)村地區(qū)以及畜禽養(yǎng)殖場，尤以戶用水壓式沼氣池為主。沼氣發(fā)酵技術(shù)屬于厭氧消化技術(shù)中的一種，其主要利用厭氧微生物消化分解沼氣池內(nèi)的有機(jī)物質(zhì)，最終產(chǎn)生沼氣。沼氣發(fā)酵是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，依靠多種菌群協(xié)同共生代謝，其中產(chǎn)甲烷菌是沼氣發(fā)酵微生物的核心，而沼氣池穩(wěn)定運(yùn)行的關(guān)鍵是微生物生態(tài)系統(tǒng)能夠維持高效穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)平衡。云南因其獨(dú)特的氣候條件，是理想的發(fā)展沼氣池的地區(qū)。玉溪市江川區(qū)九溪鎮(zhèn)位于云南省中部偏東，屬于亞熱帶半干燥高原季風(fēng)氣候類型，年平均溫度約15.7℃，適合發(fā)展沼氣池建設(shè)。田光亮采用批量發(fā)酵工藝對(duì)云南亞熱帶戶用沼氣池發(fā)酵過程進(jìn)行模擬并對(duì)系統(tǒng)中原核生物群落進(jìn)行了動(dòng)態(tài)研究；李秋敏分析了云南亞熱帶戶用沼氣池原核微生物多樣性并對(duì)冬季和夏季沼氣池中的微生物進(jìn)行了計(jì)數(shù)和形態(tài)的觀察。然而目前對(duì)于云南省亞熱帶氣候地區(qū)的水壓式沼氣池實(shí)際發(fā)酵過程中微生物群落的變化，缺乏系統(tǒng)性及長期性研究。本試驗(yàn)采用16S rDNA測序技術(shù)對(duì)玉溪市九溪鎮(zhèn)某穩(wěn)定運(yùn)行的水壓式沼氣池內(nèi)微生物多樣性及結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行了長期研究，揭示不同時(shí)間段云南亞熱帶典型沼氣發(fā)酵生態(tài)系統(tǒng)微生物多樣性的變化特征，同時(shí)對(duì)產(chǎn)甲烷過程中的主導(dǎo)菌群進(jìn)行分析，進(jìn)而反映產(chǎn)甲烷途徑的變化情況，以期為優(yōu)化水壓式沼氣池的發(fā)酵工藝提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所選用的沼氣池在云南省玉溪市江川區(qū)九溪鎮(zhèn)中營村某生豬養(yǎng)殖場(育肥豬存欄98頭)附近，沼氣池容積為100 m，以豬糞為發(fā)酵原料，屬于典型的規(guī)?；B(yǎng)殖小區(qū)小型聯(lián)戶沼氣池。該沼氣池長期穩(wěn)定運(yùn)行，池內(nèi)pH 6.5～7.5，甲烷含量63.62%～67.16%。

2019年2-6月，每月定期選擇1天于11：30 AM 左右，從沼氣池出料口底部采集10 mL發(fā)酵料液置于15 mL塑料采樣瓶，每次采3～5個(gè)樣品，于當(dāng)天送返云師大能環(huán)學(xué)院生物質(zhì)能實(shí)驗(yàn)室并放于-80℃冰箱冷凍保存。采樣池環(huán)境參數(shù)見表1。后期統(tǒng)一將所有的微生物樣品送至上海銳翌生物科技有限公司進(jìn)行16S rDNA測序。

表1 采樣當(dāng)天部分環(huán)境因子參數(shù)Table 1 Some environmental factor parameters on the sampling day

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品基因組DNA抽提和質(zhì)檢 每個(gè)樣品取3 mL發(fā)酵料液，4 ℃、9401.7 g離心4 min，取底泥樣品提取總DNA，利用Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度計(jì)和1 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)和合成 選擇V3～V4區(qū)作為16S rDNA的擴(kuò)增區(qū)域，引物為通用引物341F(5'-CCTACGGGRSGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACVVGGGTATCTAATC-3')。在通用引物的5'端加上合適的I11umina Hiseq PE250測序的接頭序列和index序列。

1.2.3 PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物純化 以稀釋后的基因組DNA為模板，使用KAPA HiFi HotstartReadyMix PCR kit高保真酶，參照Sundberg C等的試驗(yàn)設(shè)置PCR參數(shù)進(jìn)行PCR。用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收和純化PCR產(chǎn)物，利用Thermo NanoDrop 2000光譜測定儀和2 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行文庫質(zhì)檢。

1.2.4 PCR產(chǎn)物定量化和均一化 在文庫質(zhì)檢合格后，使用Qubit進(jìn)行文庫定量，同時(shí)根據(jù)每個(gè)樣品的數(shù)據(jù)量要求進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。

1.2.5 I11umina高通量測序 使用I11umina Hiseq PE250進(jìn)行上機(jī)測序。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用Pandaseq(V2.9)軟件，利用序列的重疊關(guān)系將雙末端測序得到的成對(duì)Reads拼成一條序列，得到高變區(qū)的長Reads。利用Usearch(V7.0.1090)軟件在0.97相似度下進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)聚類，對(duì)聚類后的序列進(jìn)行嵌合體過濾，得到OTU(Operational Taxonomic Units)的代表序列，一個(gè)OTU代表一個(gè)物種。為避免因樣品數(shù)據(jù)大小不同而造成分析時(shí)的偏差，在測序深度足夠的情況下，對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行隨機(jī)抽平處理，使用Qiime(V1.9.1)軟件做出相應(yīng)的稀釋曲線并進(jìn)行Alpha多樣性分析。從每個(gè)OTU中分別提取一條Read作為代表序列，使用RDP方法將該代表序列與已知物種的RDP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比，對(duì)每個(gè)OTU進(jìn)行物種分類。歸類后，以每個(gè)OTU中序列的條數(shù)為依據(jù)，得到OTU豐度表，最后根據(jù)此豐度表進(jìn)行后續(xù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沼氣發(fā)酵過程中微生物群落多樣性變化分析

2.1.1 基于OTU水平的分析 本研究獲得177 365條有效序列，聚類共產(chǎn)生1 069個(gè)OTU。5組試驗(yàn)中所共有的物種有543個(gè)，分別占A1、A2、A3、A4和A5總物種的60.07%、60.81%、65.90%、63.96%和67.04%；A1、A2、A3、A4和A5特有的物種分別為12、8、1、3和8個(gè)。

由圖1可知，A2與A3距離較近，A4與A5距離較近，說明沼氣池池內(nèi)微生物群落組成在3月份和4月份、5月份和6月份變化不大；A1與其他試驗(yàn)組距離較遠(yuǎn)，說明2月份與其它月份相比沼氣池內(nèi)微生物群落組成差異較大；各試驗(yàn)組均呈現(xiàn)不同月份的微生物沿著橫坐標(biāo)有規(guī)律的波動(dòng)，隨著時(shí)間的延長，微生物之間的距離越遠(yuǎn)，說明沼氣池池內(nèi)微生物隨著季節(jié)的變化存在波動(dòng)性變化。

圖1 基于OTU豐度的PCA分析Fig.1 Principal component analysis based on OTU abundance

2.1.2 基于Alpha多樣性分析 由表2可知，A1組Chao 1指數(shù)和Observed species指數(shù)均最大，說明沼氣池池內(nèi)微生物群落在2月份豐度最大；A5組Chao 1指數(shù)和Observed species指數(shù)均最小，說明沼氣池池內(nèi)微生物群落在6月份豐度最小。由5組試驗(yàn)樣品的Shannon指數(shù)可以看出，Shannon指數(shù)呈逐漸下降趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，中間略有波動(dòng)但波動(dòng)性不大，A1組Shannon指數(shù)最大，反映出其均一性最好，微生物群落多樣性最大；Simpson指數(shù)均在0.9以上，說明各組樣品中均含有十分豐富的微生物種類；樣品覆蓋度Goods-Coverage指數(shù)均為0.99，說明樣品的采樣和測序均有較高的覆蓋度；5組樣品的PD-whole Tree指數(shù)差異性較小，說明其物種豐富度相差不大，其中A1組物種最豐富。

表2 不同樣品中Alpha多樣性分析Table 2 Alpha diversity analysis in different samples

2.1.3 基于Beta多樣性分析 由圖2可以看出，所有的試驗(yàn)樣品主要分為3大聚類，其中 A2和A3組成第一大類，A1組成第二大類，A4和A5組成第二大類，這與之前的PCA分析結(jié)果相一致。從整體上看，所有樣品的UniFrac距離介于0.15～0.35之間，說明所有樣品物種組成的相似度較高，這與之前的Alpha多樣性分析結(jié)果相一致。以A1為對(duì)照樣，可以看出隨著月份的推移，樣品之間的UniFrac距離逐漸增大，微生物的多樣性也在緩慢演替，其中A4和A5的距離相對(duì)較近，說明該地區(qū)5月份和6月份沼氣池池內(nèi)微生物多樣性變化較小，微生物中的物種組成逐漸趨于穩(wěn)定，這與月平均氣溫的變化相一致，進(jìn)一步反映了發(fā)酵溫度對(duì)沼氣池池內(nèi)微生物的影響。

圖2 樣品Beta多樣性分析的heatmap圖Fig.2 Heatmap of Beta diversity analysis of samples

2.2 沼氣發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)組成的變化研究

2.2.1 沼氣發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌群 本研究檢測到的古菌群落占整個(gè)微生物群落的3%，細(xì)菌群落占整個(gè)微生物群落的97%，表明沼氣發(fā)酵微生物中古菌群落所占比重遠(yuǎn)小于細(xì)菌群落，這與Sundberg等和代媛的研究結(jié)果相一致。本研究將相對(duì)豐度大于5%的菌群定義為優(yōu)勢(shì)菌群，將相對(duì)豐度大于1%但小于5%的菌群定義為亞優(yōu)勢(shì)菌群。

由圖3可知，在目水平上，梭菌目(Clostridiales)、甲烷八疊球菌目(Methanosarcinales)、擬桿菌目(Bacteroidales)、厭氧繩菌目(Anaerolineales)是在沼氣發(fā)酵穩(wěn)定運(yùn)行過程中占主導(dǎo)地位的4種優(yōu)勢(shì)菌群，其平均相對(duì)豐度分別是33.80%、27.70%、18.60%和5.38%。亞優(yōu)勢(shì)菌群有Synergistales、乳桿菌目(Lactobacillales)、甲烷微菌目(Methanomicrobiales)和Selenomonadales。

圖3 沼氣發(fā)酵微生物菌群在目水平上的相對(duì)豐度Fig.3 The relative abundance of microbial flora from biogas fermentation at the order level

由圖4可知，在屬水平上，甲烷絲菌屬()、、梭菌屬()為沼氣發(fā)酵穩(wěn)定運(yùn)行過程中占主導(dǎo)地位的3種優(yōu)勢(shì)菌群，其中的相對(duì)豐度在A2試驗(yàn)組最小為26.54%、在A5試驗(yàn)組最大為53.83%，的相對(duì)豐度在A3試驗(yàn)組最小為6.85%、在A1試驗(yàn)組最大為14.53%，的相對(duì)豐度在A5試驗(yàn)組最小為6.36%、在A2試驗(yàn)組最大為10.24%。亞優(yōu)勢(shì)菌群有、、乳桿菌屬()、、、、、、甲烷螺菌屬()、。

圖4 沼氣發(fā)酵微生物菌群在屬水平上的相對(duì)豐度Fig.4 The relative abundance of microbial flora from biogas fermentation at the genus level

2.2.2 產(chǎn)甲烷過程中的主導(dǎo)菌群分析 廣古菌門(Euryarchaeota)的菌群屬于沼氣發(fā)酵微生物中的優(yōu)勢(shì)菌群，其相對(duì)豐度從2月份到6月份始終大于15%。檢測到Euryarchaeota門里包含3類產(chǎn)甲烷菌，分別是優(yōu)勢(shì)菌群甲烷八疊球菌目(Methanosarcinales)、亞優(yōu)勢(shì)菌群甲烷微菌目(Methanomicrobiales)，同時(shí)還檢測到甲烷桿菌目(Methanobacteriales)。Methanosarcinales屬于產(chǎn)甲烷菌中的乙酸型產(chǎn)甲烷菌，Methanomicrobiales和Methanobacteriales屬于產(chǎn)甲烷菌中的氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌。由圖4可知，Methanosarcinales在各試驗(yàn)組中始終處于主導(dǎo)地位，Methanosarcinales的相對(duì)豐度在3月份最小為17.79%、在6月份最大為34.06%。

在屬水平上的產(chǎn)甲烷菌主要有甲烷絲菌屬()、甲烷螺菌屬()和甲烷八疊球菌屬()，它們的平均相對(duì)豐度分別為42.00%、1.38%和0.88%，同時(shí)在屬水平上還檢測到了甲烷球形菌屬()、甲烷短桿菌屬()、甲烷桿菌屬()、屬、甲烷囊菌屬()、產(chǎn)甲烷菌屬()、甲烷粒菌屬()、甲烷葉菌屬()、甲烷盤菌屬()、甲烷食甲基菌屬()，詳見表3。其中，和均屬于乙酸型產(chǎn)甲烷菌，且是專性乙酸型產(chǎn)甲烷菌。

表3 屬水平上檢測到的各類產(chǎn)甲烷菌占所在古菌的比例Table 3 Proportion of various methanogenic bacteria detected to the archaea at the genus level

圖5為沼氣池中Top20菌屬與池內(nèi)溫度、進(jìn)料量、日產(chǎn)甲烷量、氣壓之間的相關(guān)性。由圖5可以看出，池內(nèi)溫度、進(jìn)料量、日產(chǎn)甲烷量與甲烷絲菌屬()呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，說明溫度的升高、進(jìn)料量的增加能夠促進(jìn)的生長繁殖，池內(nèi)的數(shù)目隨之增加，進(jìn)而乙酸等物質(zhì)被利用生成甲烷；甲烷螺菌屬()與池內(nèi)溫度、進(jìn)料量、日產(chǎn)甲烷量呈正相關(guān)關(guān)系，與氣壓呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；甲烷八疊球菌屬()與池內(nèi)溫度、進(jìn)料量、日產(chǎn)甲烷量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖5 部分環(huán)境因子與Top20菌群的RDA分析Fig. 5 Redundancy analysis of some environmental factors and Top20 Flora

3 討 論

新檢測出來的物種可能在之前的生長環(huán)境中因不適合生存而被抑制生長，隨著氣候變化導(dǎo)致沼氣發(fā)酵溫度的變化，出現(xiàn)一些新檢測的物種，而未檢測到的物種也有可能不適應(yīng)當(dāng)前新的生長環(huán)境；在沼氣池穩(wěn)定運(yùn)行過程中，池內(nèi)發(fā)酵微生物群落物種組成可能隨著該地區(qū)的氣候變化而發(fā)生變化，但總體變化不大。溫度的改變對(duì)微生物群落的組成影響較大，這與王騰旭研究結(jié)果一致，A2和A3、A4和A5兩者發(fā)酵溫度差異均較小，因此沼氣池內(nèi)發(fā)酵微生物的群落組成變化差異也分別較??；微生物群落組成的變化可能進(jìn)一步影響沼氣池的日產(chǎn)氣量、甲烷含量。

結(jié)合表1采樣當(dāng)天沼氣池部分環(huán)境因子參數(shù)，A1采樣當(dāng)天沼氣池發(fā)酵溫度最低且產(chǎn)氣量最少，而A5采樣當(dāng)天沼氣池發(fā)酵溫度最高且產(chǎn)氣量最多，因此可能是2月份沼氣池池內(nèi)厭氧微生物受到低溫的影響，從而抑制了產(chǎn)甲烷菌的生長代謝，致使池內(nèi)有機(jī)酸產(chǎn)量增加，進(jìn)而增加了沼氣池池內(nèi)微生物多樣性的變化，也影響了沼氣池的日產(chǎn)氣量。根據(jù)評(píng)價(jià)樣品Alpha多樣性的各指標(biāo)參數(shù)的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，可以看出各試驗(yàn)樣品所含物種的豐富度和均勻度有差異，但差異性較小，這可能是因?yàn)樵谠囼?yàn)期間沼氣池每天的進(jìn)料量相對(duì)一致，同時(shí)該地區(qū)的溫度變化相對(duì)較小，致使沼氣池池內(nèi)微生物的多樣性變化較小，始終維持在一個(gè)較穩(wěn)定的狀態(tài)。

Clostridiales、Methanosarcinales、Bacteroidales的相對(duì)豐度隨著月份的變化始終大于10 %，為絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)菌群。這3種菌群均為嚴(yán)格的厭氧菌群，其中Clostridiales是纖維素分解菌，也是主要的厭氧消化產(chǎn)氫微生物；Bacteroidales是水解發(fā)酵細(xì)菌，能將蛋氨酸、亮氨酸和色氨酸等氨基酸大分子有機(jī)物降解為小分子脂肪酸；Methanosarcinales是主要的產(chǎn)甲烷菌群，能夠?qū)⒑唵蔚牡孜锶缂姿帷⒁宜?、甲醇、H、CO等代謝生成甲烷。而本研究在屬水平上所測優(yōu)勢(shì)菌群種類與李秋敏的研究結(jié)果存在一定的差異，可能是因?yàn)檎託獬爻厝?、運(yùn)行狀態(tài)的不同所造成的。

Methanosarcinales的相對(duì)豐度從2月份到3月份變化不大、從3月份到4月份逐漸變大然后趨于穩(wěn)定，這和當(dāng)?shù)氐臍鉁刈兓哂幸恢滦?，可能是沼氣池池?nèi)溫度的變化加快了Methanosarcinales的生長代謝。Methanosarcinales細(xì)胞形態(tài)多樣，有八疊狀、球狀、絲狀、桿狀和鞘狀，同時(shí)它的底物利用類型也比較多樣，既可以用H、CO作為底物產(chǎn)甲烷，也可以裂解乙酸鹽產(chǎn)甲烷，同時(shí)還能分解甲基化合物產(chǎn)甲烷。試驗(yàn)結(jié)果表明在沼氣發(fā)酵穩(wěn)定運(yùn)行的過程中，乙酸型產(chǎn)甲烷菌占據(jù)沼氣發(fā)酵微生物菌群的一定比重，也進(jìn)一步說明乙酸裂解途徑產(chǎn)甲烷量對(duì)產(chǎn)甲烷總量的貢獻(xiàn)較大，這與瞿賢等的研究結(jié)果相一致。由圖4可知，每月的相對(duì)豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他兩種產(chǎn)甲烷菌，屬于絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)菌群，表明試驗(yàn)期內(nèi)主要以乙酸裂解途徑為主導(dǎo)產(chǎn)甲烷，也從側(cè)面反映出池內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)的變化并沒有引起甲烷轉(zhuǎn)化途徑發(fā)生顯著性的變化，這與田光亮的研究結(jié)果相一致：15～25 ℃的溫度變化對(duì)云南亞熱帶戶用沼氣池原核生物群落結(jié)構(gòu)影響很小，期間微生物類群和代謝路徑相似。同時(shí)該沼氣發(fā)酵生態(tài)系統(tǒng)采用半連續(xù)發(fā)酵，長期處于一個(gè)穩(wěn)定產(chǎn)氣階段，致使池內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)即使生了較小的變化，但始終處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的穩(wěn)定平衡，因此試驗(yàn)期內(nèi)主要以乙酸裂解途徑為主導(dǎo)產(chǎn)甲烷。

4 小 結(jié)

(1)在典型沼氣發(fā)酵生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行的過程中，系統(tǒng)內(nèi)沼氣發(fā)酵微生物群落結(jié)構(gòu)的物種組成可能隨著該地區(qū)的氣候變化而發(fā)生變化，但總體變化不大。試驗(yàn)結(jié)果表明，氣候的變化導(dǎo)致系統(tǒng)內(nèi)發(fā)酵溫度發(fā)生改變，而發(fā)酵溫度的改變影響著系統(tǒng)內(nèi)沼氣發(fā)酵微生物群落的組成，發(fā)酵溫度變化越小，系統(tǒng)內(nèi)微生物多樣性變化越小。

(2)在目水平上，梭菌目(Clostridiales)、甲烷八疊球菌目(Methanosarcinales)、擬桿菌目(Bacteroidales)、厭氧繩菌目(Anaerolineales)是在沼氣發(fā)酵穩(wěn)定運(yùn)行過程中占主導(dǎo)地位的4種優(yōu)勢(shì)菌群；在屬水平上，甲烷絲菌屬()、、梭菌屬()是在沼氣發(fā)酵穩(wěn)定運(yùn)行過程中占主導(dǎo)地位的3種優(yōu)勢(shì)菌群。

(3)在產(chǎn)甲烷過程中，產(chǎn)甲烷菌主要由甲烷絲菌屬()、甲烷螺菌屬()和甲烷八疊球菌屬()占主導(dǎo)，其平均相對(duì)豐度分別為42.00%、1.38%和0.88%，表明在沼氣發(fā)酵穩(wěn)定運(yùn)行的過程中主要以乙酸型產(chǎn)甲烷菌為主導(dǎo)，甲烷轉(zhuǎn)換途徑隨著時(shí)間的變化并未發(fā)生顯著性變化。

(4)RDA分析表明池內(nèi)溫度、進(jìn)料量均會(huì)影響產(chǎn)甲烷菌的生長繁殖，最終影響日產(chǎn)甲烷量。