蔣昆霞，朱美玲，王雅心，陳小婷，林羽，許文*，徐偉*

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)生物醫(yī)藥研發(fā)中心，福建 福州 350122)

栝樓桂枝湯源自張仲景的《金匱要略》，福建中醫(yī)藥大學(xué)陳立典教授結(jié)合多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，將栝樓桂枝湯應(yīng)用于腦卒中后的康復(fù)取得良好的療效，目前該復(fù)方的顆粒劑栝樓桂枝顆粒經(jīng)院內(nèi)制劑新藥申報(bào)批準(zhǔn)為福建省第二人民醫(yī)院制劑(批件號：閩2013S0001)，主要用于腦卒中后肢體痙攣及康復(fù)治療[1-2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，還可用于治療缺血性腦卒中、癲癇、脊髓損傷后的肢肉痙攣等[3-5]。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明栝樓桂枝顆?？梢酝ㄟ^調(diào)控神經(jīng)抑制性氨基酸——γ-氨基丁酸(GABA)受體發(fā)揮改善腦卒中后痙攣?zhàn)饔肹6]，也可以調(diào)節(jié)興奮性氨基酸及其受體的表達(dá)，改善MCAO大鼠模型大鼠的神經(jīng)損傷[7]，代謝組學(xué)研究顯示栝樓桂枝湯可以改善體內(nèi)氨基酸代謝異常[8]。提示栝樓桂枝顆粒中氨基酸類成分可能與其在體內(nèi)調(diào)控神經(jīng)調(diào)控相關(guān)的氨基酸受體有關(guān)，尤其君藥栝樓根富含多種氨基酸類化合物[9]。

目前復(fù)方中關(guān)于氨基酸類化合物的分析方法主要采用高效液相色譜(HPLC)法[10-13]，由于氨基酸屬于強(qiáng)極性成分，在普通反相色譜上往往難以保留，常規(guī)HPLC方法的樣品前處理相對較復(fù)雜，往往需要進(jìn)行柱前衍生，但是分析測定時(shí)容易受到衍生劑的穩(wěn)定性以及衍生速度的影響，導(dǎo)致測定方法的靈敏度不高，難以滿足對中藥復(fù)方樣品進(jìn)行快速、高靈敏度和高通量的分析要求。近幾年，隨著現(xiàn)代色譜-質(zhì)譜分析技術(shù)的發(fā)展，超高效親水作用色譜，越來越多的用于中藥復(fù)方中強(qiáng)極性成分的分離，通過串聯(lián)質(zhì)譜可高效的應(yīng)用于中藥復(fù)方中復(fù)雜體系的分析[14-15]。因此，本文通過建立一種超高效親水作用色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法(UHILIC-MS/MS)對栝樓桂枝顆粒中22種氨基酸類成分進(jìn)行無衍生化的快速含量測定，從氨基酸角度探討栝樓桂枝顆粒抗腦卒中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Xevo TQS三重四極桿質(zhì)譜(美國Waters公司)；CPA225D型十萬分之一分析天平(德國Sartorius公司)；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)。

1.2 試藥 甲醇、乙腈(質(zhì)譜純，德國Merk公司)，甲酸(色譜純，批號：F190210，阿拉丁試劑上海有限公司)，其余試劑均為分析純。亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、異亮氨酸(Ile)、蛋氨酸(Met)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、蘇氨酸(Thr)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)、組氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)、纈氨酸(Val)，以上對照品均購自中國食品藥品檢定研究院，批號：140681-201703；γ-氨基丁酸(GABA,A104200)、羥脯氨酸(Hpro,H111005)、天冬酰胺(Asn,A105949)、門冬氨酸(Asp,I1412118)、瓜氨酸(Cit,C109228)、谷氨酰胺(Gln,G103978)均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氘代甘氨酸(D-Gly,TRC1599)購于加拿大Toronto Research Chemicals Inc公司，純度均大于98%。栝樓桂枝顆粒來自福建省第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑。

2 方法與結(jié)果

2.1 色質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC BEH Amide (2.1 mm×100 mm,1.7 μm)，流動(dòng)相：(0.25%甲酸+2 mmol·L-1甲酸銨)水(A)-乙腈(B)，親水作用色譜梯度洗脫程序：0～2 min，8%A→8%A；2～3 min，8%A→35%A；3～4 min，35%A→45%A；4～4.1 min，45%A→8%A；4.1～6 min，8%A，進(jìn)樣量：1 μL，流速：0.4 mL·min-1，柱溫：45 ℃。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧正離子模式；毛細(xì)管電壓2.5 kV；脫溶劑氣流：氮?dú)?00 L·h-1；脫溶劑溫度：200 ℃；錐孔氣流：氮?dú)?0 L·h-1；離子源溫度：150 ℃；Extractor：3.00 V；碰撞氣體：氬氣。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取Leu、Phe、Trp、Ile、GABA、Met、Val、Pro、Tyr、Ala、Hpro、Thr、Gly、Glu、Gln、Ser、Asn、Asp、Cit、Arg、Hit、Lys的對照品適量，精密稱定，加入50%甲醇分別制備質(zhì)量濃度為148.5、130.25、221.5、89.8、693.0、5.93、340.5、1 584、178.2、244.8、5.12、257.5、256.0、275.5、51.3、128.5、1 110、406.0、1 784、564、352.0、84.0 μg·mL-1的單一對照品儲備液。分別精密量取上述對照品儲備液適量至100 mL量瓶中，加入50%甲醇定容，即得以上成分的質(zhì)量濃度分別為1 485、1 302.5、2 215、898、6 930、59.3、3 405、15 840、1 782、2 448、51.2、2 575、2 560、2 755、513、1 285、11 100、4 060、17 840、5 640、3 520、840 ng·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱定對照品氘代甘氨酸(D-Gly)適量，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，制備質(zhì)量濃度為1.03 mg·mL-1的單一對照品儲備液。精密量取上述對照品儲備液適量至10 mL量瓶中，加入50%甲醇定容，即得質(zhì)量濃度為1.03 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.3 供試品溶液 取栝樓桂枝顆粒約0.5 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入50%甲醇100 mL，密塞，稱量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱量，用超純水補(bǔ)足失重，搖勻，0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。用于定量分析的樣品溶液：按1∶1(200,200 μL)加入內(nèi)標(biāo)溶液后進(jìn)行測定。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 質(zhì)譜測定方法 采用正離子多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)定量模式，22種分析物及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜分析條件參數(shù)見表1。混合對照品和栝樓桂枝顆粒樣品(S1)在“2.1”項(xiàng)色譜及質(zhì)譜條件下分析得栝樓桂枝顆粒的UHILIC-MS/MS的MRM色譜圖(見圖2)。結(jié)果表明22種分析物對照品與栝樓桂枝顆粒中所鑒定成分的色譜峰保留時(shí)間符合定性定量分析要求。

圖1 各成分及內(nèi)標(biāo)物化學(xué)結(jié)構(gòu)圖1.Leu;2.Phe;3.Trp;4.Ile;5.GABA;6.Met;7.Val;8.Pro;9.Tyr;10.Ala;11.Hpro;12.Thr;13.Gly;14.Glu;15.Gln;16.Ser;17.Asn;18.Asp;19.Cit;20.Arg;21.Hit;22.Lys;IS.D-Gly

圖2 空白溶液(A)、對照品(B)和栝樓桂枝顆粒樣品(C)的UHILIC-MS/MS色譜圖1.Leu；2.Phe；3.Trp；4.Ile；5.GABA；6.Met；7.Val；8.Pro；9.Tyr；10.Ala；11.Hpro；12.Thr；13.Gly；14.Glu；15.Gln；16.Ser；17.Asn；18.Asp；19.Cit；20.Arg；21.Hit；22.Lys;IS.D-Gly

圖2(續(xù))

圖2(續(xù))

表1 22個(gè)氨基酸及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜測定條件

2.3.2 線性和范圍 取“2.2.1”項(xiàng)下方法制備的混合對照品溶液，用50%甲醇逐級稀釋1、2、5、10、25、50倍系列梯度濃度的對照品混合溶液。按“2.1”項(xiàng)下條件測定峰面積，用峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(Y)對分析物質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 22種氨基酸的回歸方程、線性范圍以及相關(guān)系數(shù)

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)條件1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次及連續(xù)3 d重復(fù)進(jìn)樣(每天重復(fù)進(jìn)樣3次)測定，測定各成分和內(nèi)標(biāo)的峰面積，分別計(jì)算其峰面積比的RSD，其日內(nèi)精密度和日間精密度結(jié)果見表3，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液(S1批次)，分別于0、2、6、10、12和24 h按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定，測定各成分和內(nèi)標(biāo)的峰面積，求出峰面積比的RSD。結(jié)果見表3，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批栝樓桂枝顆粒6份(S1批次)，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定，計(jì)算22個(gè)分析物的含量及其RSD，結(jié)果見表3，表明方法重復(fù)性良好。

表3 22個(gè)氨基酸的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性結(jié)果

2.3.6 回收率試驗(yàn) 精密稱取“2.3.5”項(xiàng)下已測知含量的栝樓桂枝顆粒6份，約0.25 g，按近似1∶1質(zhì)量濃度精密加入22種對照品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定待測成分的量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。

表4 栝樓桂枝顆粒中22種待測成分的回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表4(續(xù))

表4(續(xù))

2.4 樣品含量測定 分別精密稱取0.5 g栝樓桂枝顆粒6批樣品粉末各3份，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定峰面積，根據(jù)內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各批次栝樓桂枝顆粒中22種化合物的含量，結(jié)果見表5。

表5 6批栝樓桂枝顆粒各成分的含量(mg·g-1,n=3)

3 討論

本研究對22個(gè)氨基酸進(jìn)行無衍生化的含量測定，首先色譜分離上，通過比較兩種類型的HILIC柱，包括BEH Amid酰胺HILIC柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)和BEH 硅膠HILIC柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在相同的流動(dòng)相中，前者對這些氨基酸類化合物的總體保留能力和分離度均優(yōu)于后者；比較了流動(dòng)相的不同添加劑，如甲酸銨、乙酸銨、甲酸、乙酸和氨水，結(jié)果顯示，在水中添加0.25%甲酸和2 mmol·L-1甲酸銨可得到的最佳峰形。其次在質(zhì)譜檢測的優(yōu)化上，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)α-氨基酸均表現(xiàn)分子離子峰主要為[M+H]+峰，二級質(zhì)譜上最佳子離子為結(jié)構(gòu)中中性丟失一分子的甲酸，產(chǎn)生[M+H-HCOOH]+的子離子峰；而對于一些非α-氨基酸，如GABA，其子離子[M+H-NH3]+比[M+H-HCOOH]+豐度更高，最佳子離子為[M+H-NH3]+；另外含酰胺基團(tuán)的氨基酸類化合物如Gln，能夠同時(shí)產(chǎn)生m/z130[M+H-NH3]+，m/z101[M+H-HCOOH]+和m/z84[M+H-HCOOH-NH3]+的子離子峰，其中[M+H-HCOOH-NH3]+的豐度最大，所以選其最佳定量子離子為[M+H-HCOOH-NH3]+，最終在色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化下，在6 min內(nèi)使22個(gè)測定的氨基酸成分得到準(zhǔn)確的定量。

氨基酸已被證實(shí)是腦卒中的重要代謝物之一[16]，興奮性毒性損傷是缺血性腦卒中的主要發(fā)病機(jī)制之一[17]，腦缺血時(shí)神經(jīng)抑制性氨基酸如GABA、瓜氨酸等具有神經(jīng)保護(hù)作用[18-19]，臨床研究發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中患者血清中組氨酸、甘氨酸、精氨酸、L-蛋氨酸、谷氨酰胺、L-瓜氨酸等發(fā)生改變[20]，提示氨基酸類成分在腦卒中調(diào)控中可能扮演重要角色，通過本次含量測定發(fā)現(xiàn)栝樓桂枝顆粒中氨基酸含量較高的成分為瓜氨酸(Cit)，含量范圍達(dá)到2.78～4.29 mg·g-1，此外γ-氨基丁酸(GABA)、脯氨酸(Pro)、天冬酰胺(Asn)、精氨酸(Arg)含量也較高，均達(dá)到0.3 mg·g-1以上，而亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、蛋氨酸(Met)、酪氨酸(Tyr)、羥脯氨酸(Hpro)、谷氨酰胺(Gln)、絲氨酸(Ser)、賴氨酸(Lys)含量較低，均低于0.1 mg·g-1。

本研究所建立的UHILIC-MS/MS法，可快速準(zhǔn)確的測定栝樓桂枝顆粒中22個(gè)氨基酸含量，該方法相比于已有的氨基酸分析方法，經(jīng)簡單的提取步驟即可制備樣品溶液，可有效避免氨基酸衍生化所帶來的弊端，方法可為快速測定中藥復(fù)方中氨基酸類成分提供方法技術(shù)，為揭示栝樓桂枝顆粒中氨基酸類成分的物質(zhì)基礎(chǔ)奠定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。