楊麗麗 黃常新* 李永強(qiáng) 王聰潔 沈靖 陳藝丹 張嗣玉

原發(fā)性肝癌（HCC）是全球發(fā)生率排名第五的癌癥，也是第三大致死癌癥［1］。我國是HCC 的高發(fā)國家，且近年來，原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)病率有所增加［2］但人們對這種腫瘤的分子發(fā)病機(jī)制知之甚少。但對這種腫瘤的分子發(fā)病機(jī)制卻知之甚少。因此，是最關(guān)鍵的挑戰(zhàn)之一。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白4（RBBP4）是一種參與腫瘤發(fā)生的核蛋白。它是一種WD40 重復(fù)的組蛋白伴侶，在體內(nèi)廣泛分布。最近的研究發(fā)現(xiàn)，RBBP4 參與了染色質(zhì)折疊復(fù)合物的形成以及組蛋白的乙?；?。腫瘤的起源、進(jìn)展與RBBP4 的高表達(dá)密切相關(guān)［3］，RBBP4在宮頸癌、曱狀腺癌、乳腺癌等腫瘤中被報道為一種促癌基因［4］，甚至可能影響放療和化療的效果［5］。然而，RBBP4 在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)和功能尚未得到研究。由于CRISPR-Cas9 基因組編輯技術(shù)的高效性和準(zhǔn)確性，它已被廣泛用于癌癥治療。CRISPR-Cas9 系統(tǒng)一直被用作癌癥建模和治療探索中最簡便、最通用的平臺［6］。本研究利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)建立RBBP4 基因靶向敲除系統(tǒng)，為進(jìn)一步研究RBBP4 在肝細(xì)胞癌形成和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源 HEPG2 及LO2 細(xì)胞由杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)平臺實(shí)驗(yàn)室提供及保存。

1.2 主要試劑與儀器 CRISPR/Cas9n 質(zhì)粒GRNACAS9 快速構(gòu)建試劑盒（產(chǎn)品編號HS-CR-0015A）購自北京合生基因公司。感受態(tài)細(xì)菌DH5α 購自上海生工生物工程有限公司。Lipo2000 轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；DMEM 培養(yǎng)基及FBS 等細(xì)胞培養(yǎng)試劑購自寶連生物工程有限公司；兔源RBBP4 抗體，兔源GAPDDH抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)抗兔IgG 由本實(shí)驗(yàn)室。PBS、Hoeehst33342 乳氫酶、RPMI-1640、臺盼藍(lán)、TRIZOL試劑、TAKARA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TAKARA 實(shí)時熒光定量試劑盒購于杭州澤衡生科公司；氯仿、異丙醇、乙醇由杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)平臺提供。96 孔板、6 孔培養(yǎng)板、細(xì)胞計數(shù)板、EP 管、凍存管購自杭州澤衡生科有限公司；10 μL 槍頭、200 μL 槍頭、1,000 μL槍頭購自美國Axygen 公司；微量移液器、可調(diào)式移液器購自德國Eppendorf 公司；剪刀、鑷子、燒杯、200 目篩網(wǎng)、量筒購自杭州華東醫(yī)藥有限公司；光學(xué)顯微鏡、倒置熒光生物顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)購自尼康儀器（上海）有限公司?；驕y序工作及小向?qū)NA（sgRNA）寡鏈核苷酸（oligo）DNA 序列由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 （1）向?qū)NA 寡鏈核苷酸序列的設(shè)計應(yīng)用網(wǎng)站設(shè)計一對針對RBBP4 基因第1 個外顯子的sgRNA 序列。設(shè)計方法如下：①直接輸入基因名稱RBBP4 提交至網(wǎng)址（https：//chopchop.rc.fas.harvard.edu/），選擇sapiens（hg38/grch38）②比對結(jié)果，選擇一對最優(yōu)序列，在最優(yōu)序列正向鏈的5’端添加ACCG，反向鏈的5’端添加AAAC，互補(bǔ)gGRNA-CAS9 質(zhì)粒，見表1。小向?qū)NA（sgRNA）寡鏈核苷酸（oligo）DNA序列及后續(xù)測序工作均由上海生工生物工程有限公司完成。以下將RBBP4 重組質(zhì)粒稱為RBBP4-HS015A。（2）RBBP4-HS015A 的建立與篩選：HS015A 是一種U6啟動子sgRNA 支架表達(dá)載體，可表達(dá)具有Cas9 D10A 切口酶突變的Cas9n，具有氨芐青霉素（AmpR）和嘌呤霉素抗性（PuroR）。本實(shí)驗(yàn)購買的質(zhì)粒雙酶切部分已由上海生工生物工程有限公司完成。oligo1 和oligo2 的磷酸化和退火分別由T4 多聚核苷酸酶進(jìn)行。使用T4 連接酶將線性HS015A 質(zhì)粒載體與oligo1 連接，并在室溫下將oligo2 退火1 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)菌 trans5a中，并在AmpR Luria-Bertani 培養(yǎng)基平板上篩選。挑選陽性克隆，搖床，送公司測定順序。測序的引物見表2。測序正確的克隆用康為世紀(jì)盒提取重組質(zhì)粒HS015ARBBP4。（3）轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染成功的單克隆細(xì)胞的采集：混合Lipo2000 試劑和DMEM，重組質(zhì)粒HS015A-RBBP4 與DMEM（Gibico）混合，室溫放置5 min。染后將Lipo2000試劑和DMEM 混合物與HS015A-RBBP4 合并在一起，室溫下放置30 min。分別重懸HEG2 和LO2 細(xì)胞，接種于6 孔板上，接種密度為30%～50%，加入前述室溫放置的Lipo2000 和DMEM 混合物、HS015A-RBBP4 混合物。轉(zhuǎn)染8 h 后換液，培養(yǎng)2～3 d 后提取細(xì)胞蛋白及RNA。（4）Western blot檢測RBBP4 的表達(dá)：收集野生型HEPG2 和LO2 細(xì)胞和轉(zhuǎn)染的顯綠色熒光的細(xì)胞（見圖1），用RIPA 蛋白裂解液使細(xì)胞發(fā)生裂解，收集全部裂解細(xì)胞的提取物，并通過離心取樣上清液。用野生型的細(xì)胞蛋白作對照。將樣品放置于紫外分光光度計中測定計算蛋白濃度，經(jīng)蛋白變性后調(diào)整為相同蛋白濃度，本實(shí)驗(yàn)均為5 μg/μL，取等量蛋白樣品。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)半干轉(zhuǎn)印至NC 膜后，5%脫脂牛奶封閉，一抗、二抗孵育，加入曝光底物進(jìn)行曝光。以GAPDH 為內(nèi)參，Western bloting 法檢測RBBP4 蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)情況，將野生型細(xì)胞和RBBP4 敲除細(xì)胞中RBBP4 蛋白表達(dá)情況進(jìn)行對比。（5） RT-qPCR 檢測RBBP4 的表達(dá)：收集野生型細(xì)胞和轉(zhuǎn)染的顯綠色熒光的細(xì)胞，用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，去除基因組DNA，再逆轉(zhuǎn)cDNA。設(shè)計RBBP4 和GAPDH RT-qPCR 引物，見表3。進(jìn)行RT-qPCR。GAPDH 作為內(nèi)參，檢測RBBP4 在細(xì)胞中的表達(dá)情況，比較野生型細(xì)胞和RBBP4 敲除細(xì)胞中RBBP4 的表達(dá)差異。

圖1 轉(zhuǎn)染效果圖

表1 sgRNA的選擇

表2 PCR檢測引物

表3 qPCR引物（5’to 3’）基因引物長度（bp）

2 結(jié)果

2.1 HS015A-RBBP4 重組質(zhì)?；驒z測順序數(shù)據(jù)顯示，在酶切位點(diǎn)之間插入的基因序列、方向及位置與設(shè)想中一致，證實(shí)oligo1 正確插入HS015A，成功組建重組質(zhì)粒，見圖2。

圖2 測序結(jié)果比對

2.2 Western blot 檢測HS015A-RBBP4 蛋白敲除的效果相比于野生型HEGG2 細(xì)胞及LO2 細(xì)胞，HS015ARBBP4 細(xì)胞內(nèi)源性RBBP4 蛋白表達(dá)量顯著下降（P＜0.05），但仍然有低表達(dá)。見圖3、圖4。

圖3 Western blot檢測HEG2細(xì)胞RBBP4蛋白表達(dá)水平結(jié)果

圖4 Western blot檢測LO2細(xì)胞RBBP4蛋白表達(dá)水平結(jié)果

2.3 RT-qPCR 檢測RBBP4基因表達(dá)的變化相比較于野生型細(xì)胞，RBBP4 mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。見圖5。

圖5 LO2細(xì)胞及HEG2細(xì)胞MRNA表達(dá)量

3 討論

RBBP4 的高表達(dá)與腫瘤產(chǎn)生、進(jìn)展息息相關(guān)。RBBP4 在原發(fā)性甲狀腺癌中的表達(dá)量顯著上升，尤其在非彈性甲狀腺癌中表達(dá)量更甚。隨著RBBP4 的表達(dá)量降低后，原發(fā)性甲狀腺癌的發(fā)生也明顯受到抑制。RBBP4 在前列腺癌中也是明顯上調(diào)的，它能促進(jìn)前列腺癌的侵襲和遷移。研究發(fā)現(xiàn)MiR-429在上皮細(xì)胞黏附分子陽性的肝癌腫瘤啟動細(xì)胞（T-ICs）中的富集有助于肝細(xì)胞的自我更新、惡性增殖、化療耐藥性和致瘤性。而MiR-429 的表觀遺傳學(xué)修飾可以通過靶向RBBP4/E2F1/Oct4 軸操縱肝臟T-ICs。研究發(fā)現(xiàn)BCL11A 在耐化療的三陰乳腺癌和其他腫瘤群體中都是一個關(guān)鍵基因，RBBP4 是一種組蛋白伴侶蛋白，與許多核心抑制劑復(fù)合物共享的組蛋白伴侶。通過RBBP4，BCL11A 能夠招募NuRD、PRC2、和SIN3A，以啟動轉(zhuǎn)錄抑制，揭示了這種相互作用是一個潛在的治療目標(biāo)［7］。因此構(gòu)建穩(wěn)定敲除RBBP4 基因的肝癌胞系及正常肝細(xì)胞系對研究肝癌多發(fā)耐藥調(diào)控基因發(fā)生發(fā)展機(jī)制有重要的意義。

CRISPR/Cas9n 系統(tǒng)是新一代的基因定向編輯技術(shù)，是一種高效、廉價和易于使用的基因組編輯工具，它正迅速被應(yīng)用于許多領(lǐng)域，包括動物模型的生成、基因敲除細(xì)胞系、功能性基因組篩選和糾正遺傳性紊亂疾病［8］。最近，由于CRISPR-Cas9 基因組編輯技術(shù)的高效性和準(zhǔn)確性，已被廣泛用于癌癥治療的探索中。一些研究使用CRISPR-Cas9 直接針對癌細(xì)胞和動物癌癥模型中的基因組DNA，將這種分子治療策略與傳統(tǒng)的手術(shù)、放療或化療結(jié)合起來有助于擴(kuò)大抗癌療效。在這項(xiàng)研究中，使用CRISPR/Cas9n 系統(tǒng)構(gòu)建了靶向RBBP4敲低的向?qū)NA，并連入HS015A 載體，構(gòu)建RBBP4-HS015A 重組質(zhì)粒，并將構(gòu)建成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)HEG2及LO2 細(xì)胞系，分別選擇嘌呤霉素處理細(xì)胞系，分離并擴(kuò)增單克隆細(xì)胞，成功構(gòu)建了敲低RBBP4 基因的HEPG2 及LO2 的穩(wěn)定細(xì)胞系，一方面通過單向?qū)NA（sgRNA），Cas9 內(nèi)切酶可以被精確地引導(dǎo)到目標(biāo)RBBP4位點(diǎn)，產(chǎn)生DNA 雙鏈斷裂（DSBs），從而啟動DNA 修復(fù)過程，產(chǎn)生引起位點(diǎn)特異度的基因組修飾，避免了RNA 干擾技術(shù)（RNAi）普遍不可預(yù)知的脫靶效應(yīng)［9］。本研究利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)建立肝癌RBBP4 基因靶向敲除系統(tǒng)，為進(jìn)一步研究RBBP4 在肝細(xì)胞癌形成和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。盡管如此，亦有報道指出，有可能使用該技術(shù)在小鼠體內(nèi)誘發(fā)癌癥以創(chuàng)建肺癌模型［10］。因此在使用CRISPR-Cas9 技術(shù)時，必須權(quán)衡利弊，謹(jǐn)慎使用。