王 頌 黃俊彬 徐巧林 陳穎樂黃文妍 王志宏 余玉娟 曾 雷

（廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實驗室/廣東省林業(yè)科學(xué)研究院，廣東 廣州 510520）

木姜葉柯Lithocarpus litseifolius屬于殼斗科柯屬植物，是山地常綠的常見樹種[1]。作為一種天然茶飲，木姜葉柯的利用歷史可追溯到南朝時期，在《本草綱目》和《茶經(jīng)》等均有記載[2]。其嫩葉嚼爛時為粘膠質(zhì)，因具明顯甜味，民間常以其葉沖泡成茶湯，常被稱為“甜茶”[3-4]。以甜茶葉入藥，具有清熱利尿、滋潤肝腎、潤肺鎮(zhèn)咳等功效，可預(yù)防溫?zé)崃〖病⑵つw瘙癢和癰疽惡瘡等癥狀[5-7]；現(xiàn)代研究也證明，木姜葉柯含有黃酮類、多酚類、多糖類、三萜類、甾體類、氨基酸和微量元素等成分[8-13]，具有“一健一潤一醒”和“三防三抗四降”等作用功效[2,5,12,14]，被譽(yù)為兼具茶、糖、藥于一體的“樹上蟲草”[4]，并于2017 年6月被批準(zhǔn)為新食品原料[15]。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，木姜葉柯中黃酮類物質(zhì)主要為二氫查耳酮，包括根皮苷、三葉苷和根皮素等[11,16-17]。其中根皮苷和三葉苷互為同分異構(gòu)體[2]，根皮苷是根皮素的葡萄糖苷，為微黃色或白色針狀結(jié)晶物質(zhì)，味先甜后苦[17]，具有降血糖、抗氧化、改善記憶力和抗癌等生物活性[18-19]；根皮素則具有抗氧化、抗炎、免疫抑制、抗癌和抗腫瘤作用，可清除皮膚內(nèi)自由基，抑制黑色素細(xì)胞活性，同時可以抑制血管內(nèi)皮功能失調(diào)以及肝損傷的發(fā)生[17,20-21]；三葉苷能夠抑制炎癥因子的分泌，抗氧化能力顯著，并且對于糖尿病的防治具有潛在的應(yīng)用價值[22-24]?；诹己玫拈_發(fā)利用前景，目前對于木姜葉柯的資源繁育、種植、特征成分的提取制備等方面已經(jīng)開展了一些研究[25-30]，王鈺等[31]建立了同時測定木姜葉柯中根皮苷、三葉苷和根皮素等高效液相色譜方法，可為其質(zhì)量控制提供有效的檢測技術(shù)。但是關(guān)于木姜葉柯不同表型葉中二氫查耳酮類物質(zhì)含量的動態(tài)變化卻鮮有報道。

本研究主要通過對同時檢測木姜葉柯根皮苷、三葉苷和根皮素的高效液相色譜法進(jìn)行優(yōu)化，并分析木姜葉柯不同表型葉片中根皮苷、三葉苷和根皮素在不同月份的含量差異，從而為木姜葉柯的品質(zhì)評價和良種選育及采收提供有價值的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試藥

木姜葉柯樣品材料采集于湖南富農(nóng)甜茶有限責(zé)任公司長田溪基地，經(jīng)中國科學(xué)院昆明植物研究所楊永平研究員鑒定為木姜葉柯，不同表型葉包括大葉型、尖葉型和紫葉型，各樣品分別于7月、8 月、9 月和10 月中旬進(jìn)行采摘。7 月、8月、9 月和10 月每月各采集30 批次樣品，包括10 批次大葉型、10 批次尖葉型、10 批次紫葉型，共計120 批次樣品。經(jīng)50℃烘干，粉碎后過65 目標(biāo)準(zhǔn)篩，得樣品粉末，4℃保存待用。不同品種木姜葉柯見圖1。

無水乙醇、乙腈（色譜級，fisher chemical），甲酸（色譜級，上海麥克林生化科技有限公司），根皮苷對照品（純度98%，上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司），三葉苷對照品（純度98%，上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司），根皮素對照品（純度98%；上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司），實驗用水為超純水，純度符合GB/T 6682-2008 一級水要求。

1.2 儀器

電熱鼓風(fēng)干燥箱（HK-92401X，廣州市深華生物技術(shù)有限公司）；流水式中藥粉碎機(jī)（HK-08B，廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)篩（65目，紹興上虞圣超儀器設(shè)備有限公司）；電子分析天平（BM-500，日本艾安得）；超聲波清洗機(jī)（SB-5200DT，寧波新芝生物科技有限公司）；實驗室超純水系統(tǒng)（WP-RO10B，四川沃特爾水處理設(shè)備）；真空抽濾裝置（T-50.2L 型，天津市津騰實驗設(shè)備）；高效液相色譜儀（LC-20A，島津有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜分析條件：色譜柱InertSustain C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.04%甲酸水溶液（B）梯度洗脫（表1）；流速0.8 mL·min-1；柱溫40℃；進(jìn)樣量5.0 μL。檢測波長：根皮苷、三葉苷和根皮素均為285 nm。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution condition

1.3.2 對照品溶液的制備 分別準(zhǔn)確稱取5.0 mg三葉苷、根皮苷、根皮素的標(biāo)準(zhǔn)品置于10 mL容量瓶，加入70%乙醇，待充分溶解并定容到10 mL。

1.3.3 供試樣品溶液制備與分析 精密稱取木姜葉柯樣品粉末0.25 g 3 份，分別置于3 個25 mL 具塞錐形瓶中，各加入10 mL 70%乙醇，連同錐形瓶稱定總質(zhì)量記為m1，超聲（功率100 W，頻率40 kHz）提取30 min，放置至室溫后用70%乙醇補(bǔ)足質(zhì)量達(dá)到m1，搖勻，離心，取上清液1.0 mL置于10 mL 容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度線，搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，濾液作為木姜葉柯樣品供試溶液。按照步驟1.3.1 條件進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理和基礎(chǔ)統(tǒng)計，運(yùn)用SPSS 23.0 軟件對不同葉型木姜葉柯的三種化學(xué)成分進(jìn)行方差分析、相關(guān)分析、多重比較和聚類分析[32]。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)驗證

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品母液，按照1、2.5、5、10、20、40、50 倍數(shù)進(jìn)行稀釋，得系列質(zhì)量濃度溶液，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取各個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液各5 μL 注入高效液相色譜儀，按1.3.1 色譜條件測定峰面積。以進(jìn)樣濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積值Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得各標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程及線性范圍。并根據(jù)3 倍信噪比與10 倍信噪比法計算檢出限（LOD）和定量限（LOQ），結(jié)果如表2 所示，標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖見圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)對照品和木姜葉柯樣品的高效液相色譜圖Fig. 2 HPLC of standard reference substance and samples

表2 擬合方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限、定量限Table 2 Fitting equation, correlation coefficient, linear range, and detection limit, detection limit

2.1.2 重復(fù)性試驗 取同一木姜葉柯供試樣品粉末6 份，每份0.25 g，根據(jù)制備方法制備木姜葉柯供試品溶液，根據(jù)色譜條件進(jìn)行測定，記錄測定濃度。通過對同一樣品進(jìn)行平行6 次測定，計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，對方法重復(fù)性進(jìn)行驗證。結(jié)果顯示根皮苷、三葉苷和根皮素濃度的RSD 值分別為0.47、0.17 和1.35（表3），表明方法重復(fù)性好。

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果Table 3 The result of repeatability

2.1.3 精密度試驗 吸取同一混合對照品溶液，按色譜條件連續(xù)測定6 次，記錄測定濃度，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示根皮苷、三葉苷和根皮素含量的RSD 值分別為0.37、0.12 和0.83，表明儀器精密度良好。

表4 精密度試驗結(jié)果Table 4 The result of precision

2.1.4 日內(nèi)穩(wěn)定性試驗 取同一供試樣品溶液，根據(jù)色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10 和12 h 進(jìn)行測定，記錄測定濃度。結(jié)果顯示不同時間測定的根皮苷、三葉苷和根皮素含量的RSD 值分別為0.52、0.73 和1.21（表5），表明供試樣品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

表5 日內(nèi)穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 5 The result of intraday stability

2.1.5 加標(biāo)回收率試驗 取已知根皮苷、三葉苷和根皮素含量的木姜葉柯樣品粉末各9 份，每份0.25 g，分別按照低、中和高比例添加適量根皮苷、三葉苷和根皮素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照液相色譜檢測方法測定含量。通過加標(biāo)回收率試驗，計算回收率，結(jié)果見表6。不同二氫查耳酮的平均回收率在80%～110%之間，而且RSD 均小于2.0。

表6 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果Table 6 The result of standard recovery rate

2.2 木姜葉柯二氫查耳酮類物質(zhì)含量差異分析

基于采集所得的木姜葉柯樣品，按照不同月份和不同表型葉，對其特征二氫查耳酮類物質(zhì)進(jìn)行差異分析（圖3）。

圖3 木姜葉柯不同采集月份和不同表型葉三種二氫查耳酮類物質(zhì)的差異性分析Fig. 3 The diversity analysis of three dihydrochalcones from L. litseifolius of different collection months and different phenotypes leaves

不同月份采集的木姜葉柯葉片樣品的根皮素含量、根皮苷含量、三葉苷含量均存在極顯著性差異（P＜0.001）。對于根皮苷而言，7—10 月，隨著月份的增加，葉片根皮苷含量逐漸增加，10月份木姜葉柯的根皮苷含量最高；對根皮素而言，7 月份葉片的根皮素含量最高，8 月和9 月含量有所下降，10 月根皮素含量升高，顯著低于7 月份時根皮素含量。三葉苷在不同月份間的變化規(guī)律與根皮素基本一致。

不同葉型的木姜葉柯，葉片的根皮素含量存在顯著性差異（P＜0.05），根皮苷和三葉苷存在極顯著性差異（P＜0.001）。大葉型木姜葉柯葉片的根皮素含量最高，根皮苷含量最低；尖葉型木姜葉柯的根皮苷含量最高，三葉苷含量和根皮素含量最低；紫葉型木姜葉柯的三葉苷含量最高，根皮素和根皮苷含量居中。

月份與葉型的交互作用對木姜葉柯的根皮苷含量具有顯著性影響（P＜0.05），對根皮素和三葉苷含量具有極顯著性影響（P＜0.001）。7 月份采集的大葉型木姜葉柯葉片樣品的根皮素含量最高，9 月份采集的尖葉型的根皮素含量最低；10 月份采集的尖葉型木姜葉柯的根皮苷含量最高，7 月份的大葉型木姜葉柯的根皮苷含量最低；7 月份采集的紫葉型木姜葉柯的三葉苷含量最高，9 月份的尖葉型木姜葉柯的三葉苷含量最低。

3 結(jié)論與展望

本研究通過高效液相色譜法對木姜葉柯3 種表型葉在7、8、9 和10 月二氫查耳酮類成分（根皮素、根皮苷和三葉苷）進(jìn)行對比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同采收時間的大葉型、尖葉型和紫葉型木姜葉柯中根皮苷、三葉苷、根皮素等化學(xué)成分存在顯著性差異，其中采收時間和葉型均為影響有效成分含量的主效應(yīng)。在不同的采集月份，根皮素和三葉苷變化趨勢相近，均在8 或9 月份含量較低，根皮苷則在7—10 月份采收期間，具有逐步升高的趨勢。大葉型木姜葉柯中根皮素在7 月份含量最高；7 月份采收時，紫葉型三葉苷含量要明顯高于大葉型和尖葉型；從整體分析，根皮苷在10 月份采收時，含量要高于7、8 和9 月份，且其在3 種葉型根皮苷的含量也較為接近。

通過對不同采收時間的3 種葉型木姜葉柯有效特征成分含量分析，可以為木姜葉柯的優(yōu)良種選育和高值化利用提供理論依據(jù)，但由于試驗條件受限，本實驗中僅對7—10 月份的不同樣品進(jìn)行采集與分析，所以對于全年以及不同生長環(huán)境的木姜葉柯特征二氫查耳酮類物質(zhì)的動態(tài)累積與含量分布仍需在后續(xù)研究中不斷完善。