聶石輝，王 仙，向 莉，張金汕,3，李志強(qiáng)，任 毅,3，方伏榮

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，新疆烏魯木齊 830091； 2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院奇臺(tái)麥類試驗(yàn)站，新疆奇臺(tái) 831800； 3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052)

大麥(L.)屬于禾本科(Gramineae)大麥屬(Hordeum)植物，在世界主要谷類作物中，其播種面積僅次于玉米、小麥和水稻。大麥?zhǔn)侵匾募Z食、釀酒和飼料作物，與其他谷類作物相比，能更好地適應(yīng)干旱、寒冷、鹽脅迫等惡劣環(huán)境。因其擁有比其他谷類作物更加廣泛的生態(tài)適應(yīng)性，被認(rèn)為是最適宜進(jìn)行抗旱研究的遺傳試驗(yàn)材料。前人研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫會(huì)減少大麥的分蘗數(shù)、穗數(shù)和單株粒重，進(jìn)而降低籽粒產(chǎn)量，干旱也會(huì)對(duì)大麥根系的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生不良影響。Ryu等報(bào)道，大麥泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在其抗旱過(guò)程中發(fā)揮重要作用。 Marzec等研究表明，大麥獨(dú)腳金內(nèi)酯(SL)和脫落酸(ABA)共同參與干旱的防衛(wèi)反應(yīng)。

全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study，GWAS)是進(jìn)行功能基因定位的重要方法之一。Wehner等利用9K芯片對(duì)156份冬大麥材料進(jìn)行基因分型，獲得3 213個(gè)有效的SNP位點(diǎn)，對(duì)干旱脅迫下葉片衰老等表型進(jìn)行性狀GWAS分析，共定位到181個(gè)QTLs；Zhang等利用DArT標(biāo)記對(duì)166份野生大麥抗氧化酶活性、丙二醛含量、可溶性蛋白含量、鉀濃度等響應(yīng)干旱脅迫的表型性狀QTL位點(diǎn)進(jìn)行定位，共關(guān)聯(lián)到91個(gè)QTL位點(diǎn)。除了基于自然群體的GWAS之外，基于大麥遺傳群體的抗旱QTL定位挖掘也有研究。如Piasecka等用819個(gè)標(biāo)記構(gòu)建了大麥重組自交系(recombinant inbred line，RIL)群體的高密度遺傳圖譜，以干旱脅迫下代謝物含量作為表型性狀，共定位到138個(gè)響應(yīng)干旱脅迫的QTLs。

目前，在干旱脅迫條件下，前人已經(jīng)定位到多個(gè)控制株高、穗型等表型的QTL，但大麥抗旱機(jī)制復(fù)雜，仍然需要發(fā)掘更多的調(diào)控大麥株型和產(chǎn)量構(gòu)成的QTL。同時(shí)，在建設(shè)“絲綢之路經(jīng)濟(jì)帶”上升為國(guó)家戰(zhàn)略的新形勢(shì)下，充分發(fā)揮新疆絲綢之路經(jīng)濟(jì)帶主體地位，亟需解決新疆大麥種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)相對(duì)狹窄、優(yōu)異種質(zhì)資源短缺等問(wèn)題。鑒于此，本研究以167份從中亞國(guó)家(哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦、塔吉克斯坦等)收集和引入的中亞大麥為材料，利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序SLAF-seq技術(shù)進(jìn)行全基因組SNP標(biāo)記開(kāi)發(fā)，并在大田環(huán)境下，設(shè)置三種水分管理環(huán)境，分別測(cè)定其株高、穗長(zhǎng)、穗數(shù)等農(nóng)藝性狀并進(jìn)行GWAS，以期為大麥抗旱基因的克隆和遺傳改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

在1 024份引進(jìn)種質(zhì)資源中，篩選出167份中亞地區(qū)大麥品種(系)，其中154份來(lái)自吉爾吉斯斯坦，12份來(lái)自哈薩克斯坦，1份來(lái)自塔吉克斯坦。有1份大麥品種(系)來(lái)自中國(guó)，由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧作所自育。品種名稱詳見(jiàn)表1。

表1 供試大麥品種(系)Table 1 List of the tested barley varieties(lines)

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)處理及性狀調(diào)查

參試材料分別于2018-2019年度種植在新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院奇臺(tái)麥類試驗(yàn)站，隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)，小區(qū)面積10 m，各處理如下：

正常灌水：分別于出苗期、拔節(jié)期、孕穗期、抽穗期、灌漿期各灌水600 m·hm。

灌水2次：分別于出苗期、孕穗期各灌水一次，每次灌水600 m·hm。

灌水1次：僅在出苗期灌水一次，灌水量600 m·hm，其他生育階段不灌水。

用CATB法提取參試材料植株幼嫩葉片的DNA。于小麥成熟期，每個(gè)處理每個(gè)品種(系)選取10株，每株調(diào)查株高、主穗穗長(zhǎng)、主穗小穗數(shù)和單株穗數(shù)。依據(jù)灌水2次的性狀值和灌水1次的性狀值計(jì)算抗旱指數(shù)，計(jì)算公式如下：

抗旱指數(shù)(DI)=旱地性狀值×(旱地性狀值/水地性狀值) /所有品種(系)旱地性狀的平均值。不同處理之間表型的差異分析采用SAS 9.1.3的Duncan法進(jìn)行。

1.2.2 基因分型與系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用Illumina HiSeq Xten測(cè)序儀(Illumina,USA)對(duì)167份大麥品種(系)進(jìn)行SLAF-Seq，共得到1 633.83 Mb reads，平均Q30為 95.46%，平均GC含量為47.35%。共獲得2 638 490個(gè)SLAF標(biāo)簽，其中多態(tài)性的SLAF標(biāo)簽有1 157 041個(gè)。利用bwa軟件，將測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到大麥基因組(http://plants.ensembl.org/Hordeum_vulgare/Info/Index)上，并使用GATK和SAMtools兩種方法開(kāi)發(fā)SNP，以兩種方法得到的SNP標(biāo)記交集作為最終可靠的SNP標(biāo)記數(shù)據(jù)集，共得到6 057 352個(gè)群體SNP。使用MEGA X軟件，基于鄰接法，采用Kimura 2-parameter模型，bootstrap重復(fù)1 000次，構(gòu)建各樣品的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，通過(guò)admixture軟件分析研究材料的群體結(jié)構(gòu)，通過(guò)EIGENSOFT軟件進(jìn)行主成分(PCA)分析。

1.2.3 關(guān)聯(lián)分析

基于變異檢測(cè)的SNP數(shù)據(jù)，按照MAF≥ 0.05和INT≥0.8進(jìn)行過(guò)濾，獲得479 252個(gè)高一致性SNP位點(diǎn)。結(jié)合表型數(shù)據(jù)，利用TASSEL、FaST-LMM和EMMAX軟件進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。其中TASSEL軟件的混合線性模型公式如下：=+++。其中，通過(guò)admixture軟件計(jì)算樣品的群體結(jié)構(gòu)，通過(guò)SPAGeDi軟件計(jì)算樣品間的親緣關(guān)系。為基因型，為表型，最終每個(gè)SNP位點(diǎn)都能得到一個(gè)關(guān)聯(lián)值。設(shè)置≤0.05 和≤ 0.01為閾值線，值經(jīng)過(guò)Bonferroni校正后，將超過(guò)閾值線的SNP位點(diǎn)前后100 Kb做為候選區(qū)域，用于后續(xù)候選基因篩選。應(yīng)用BLAST軟件對(duì)候選區(qū)間內(nèi)的候選基因比對(duì)到Nr(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db)、Pfam(http://pfam.xfam.org/)和Swiss-Prot(http://www.gpmaw.com/html/swiss-prot.html)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行功能注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對(duì)大麥主要農(nóng)藝性狀的影響

結(jié)果(表1)表明，隨著干旱脅迫的加劇，株高和主穗小穗數(shù)的抗旱指數(shù)有所降低；穗長(zhǎng)和單株穗數(shù)的抗旱指數(shù)有所增加。與CK處理相比，株高在灌水2次和灌水1次的處理下均顯著降低，主穗小穗數(shù)在灌水1次的處理下顯著降低，而灌水2次處理與CK處理間無(wú)顯著差異；穗長(zhǎng)在灌水2次和灌水1次的處理下均顯著增加；單株穗數(shù)隨灌水次數(shù)的減少呈降低的趨勢(shì)，但差異并不顯著。這些結(jié)果表明，不同表型對(duì)干旱脅迫表現(xiàn)出不同的響應(yīng)程度。株高和穗長(zhǎng)對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)較為敏感，且株高能反映不同干旱脅迫的程度；只有干旱比較嚴(yán)重時(shí)，主穗小穗數(shù)才顯著降低。

2.2 大麥群體系統(tǒng)發(fā)育和群體結(jié)構(gòu)分析

為探討大麥的的系統(tǒng)發(fā)育和群體結(jié)構(gòu)，利用測(cè)序得到的SNP標(biāo)記對(duì)167份材料構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)和PCA分析。如圖1 所示，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和PCA分析均未將材料分成明顯的群或者亞群，群體結(jié)構(gòu)分析顯示，最優(yōu)分群數(shù)量等于或者超過(guò)10。這些結(jié)果表明，這些材料在大麥育種中可能經(jīng)過(guò)了頻繁的基因交流，未形成地理亞群。

A：系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析；B：主成分分析；C：群體結(jié)構(gòu)分析；D：群體結(jié)構(gòu)交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率。

2.3 與大麥株高和穗部性狀相關(guān)聯(lián)的QTL位點(diǎn)

利用性狀表型數(shù)據(jù)與SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行GWAS，結(jié)果共檢測(cè)到8個(gè)性狀關(guān)聯(lián)位點(diǎn)(表3)，其中正常灌水條件下檢測(cè)到1個(gè)QTL()，灌水2次條件下檢測(cè)到5個(gè)QTL(、、、和)，灌水1次條件下檢測(cè)到2個(gè)QTL(和)。這表明，干旱條件下和正常條件下可能有不同的大麥株高和穗型調(diào)控機(jī)制，且大麥產(chǎn)量性狀可能有多個(gè)微效位點(diǎn)控制，干旱條件下，導(dǎo)致某些位點(diǎn)效應(yīng)增大，從而在干旱條件下被檢 測(cè)到。

表2 不同灌水處理對(duì)大麥主要農(nóng)藝性狀的影響Table 2 Effect of different irrigation treatments on main agronomic traits of barley

表3 與株高和穗部性狀相關(guān)聯(lián)的QTL的檢測(cè)結(jié)果Table 3 Detection result of QTL associated with plant height and spike traits

2.4 與大麥株高和穗部性狀相關(guān)聯(lián)的候選基因

將位點(diǎn)前后100 Kb做為候選區(qū)域，對(duì)其進(jìn)行候選基因分析。結(jié)果(表4)發(fā)現(xiàn)，調(diào)控株高的候選基因有HORVU7Hr1G118490、HORVU7Hr1G118500、HORVU7Hr1G118510、HORVU7Hr1G118520、HORVU7Hr1G118550、HORVU7Hr1G118560和HORVU7Hr1G118570，其中HORVU7Hr1G118560、HORVU7Hr1G118570編碼的蛋白為預(yù)測(cè)編碼蛋白，HORVU7Hr1G118490、HORVU7Hr1G118500和HORVU7Hr1G 118510編碼的蛋白為鋅脂蛋白，HORVU7Hr1G118520編碼bZIP轉(zhuǎn)錄因子TRAB1，Hobo等報(bào)道發(fā)現(xiàn)，TRAB1是一個(gè)反式作用因子，參與ABA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。調(diào)控穗長(zhǎng)的候選基因有HORVU7Hr1G044080、HORVU7Hr1G 044100、HORVU7Hr1G044150和HORVU7Hr1G 044160，除HORVU7Hr1G044150未能獲得功能注釋外，其他基因注釋均為膜蛋白。

表4 株高、穗長(zhǎng)、單株穗數(shù)和主穗小穗數(shù)QTL位點(diǎn)候選基因的預(yù)測(cè)結(jié)果Table 4 Analysis of QTL candidate genes for plant height,ear length,spike number per plant and spikelet number per main spike

調(diào)控單株穗數(shù)的候選基因有HORVU6Hr1G-053210、HORVU6Hr1G053970、HORVU6Hr1G053980和HORVU6Hr1G054160，其中，HORVU6Hr1G053970編碼EMG1/NEP1甲基轉(zhuǎn)移酶，HORVU6Hr1G054160編碼LRR受體樣絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶EFR。調(diào)控小穗數(shù)的候選基因有HORVU6Hr1G075300和HORVU7Hr1G037140， 其中，HORVU6Hr1G075300編碼E3泛素連接酶COP1。

2.5 與抗旱指數(shù)相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)及其候選基因

利用抗旱指數(shù)數(shù)據(jù)與SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行GWAS分析，結(jié)果共檢測(cè)到7個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)(表5)，與株高、穗長(zhǎng)、主穗小穗數(shù)和單株穗數(shù)相關(guān)的抗旱QTL分別有2、2、2和1個(gè)，且均與穗型、株高、單株穗數(shù)、主穗小穗數(shù)四個(gè)性狀QTL區(qū)間未重合，且不同性狀抗旱指數(shù)相關(guān)聯(lián)的QTL也不同。本研究共檢測(cè)到96個(gè)潛在的候選基因，其中，HORVU4Hr1G084250編碼陽(yáng)離子質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)體(Cation/Hantiporter 2)，可調(diào)節(jié)Ca轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而提高抗旱性；HORVU1Hr1G023280和HORVU7Hr1G085130響應(yīng)干旱脅迫；HORVU1Hr1G081910編碼IAA相關(guān)蛋白，預(yù)測(cè)它們均是抗旱功能基因，但結(jié)果還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

表5 株高和穗部性狀抗旱指數(shù)相關(guān)聯(lián)QTL的檢測(cè)結(jié)果Table 5 Detection result of QTL associated with drought index of plant height and spike traits

3 討 論

本研究對(duì)不同水分脅迫下大麥的株高、穗長(zhǎng)、單株穗數(shù)和主穗小穗數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)位點(diǎn)鑒定，最終共檢測(cè)到8個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，分布在大麥4H、5H、6H和7H染色體上。其中正常灌水處理下檢測(cè)到1個(gè)QTL位點(diǎn)()，灌水2次處理下檢測(cè)到5個(gè)QTL位點(diǎn)(、、、和)，灌水1次處理下檢測(cè)2個(gè)QTL(和)。說(shuō)明響應(yīng)干旱脅迫的QTL位點(diǎn)主要位于7H染色體上。前人在干旱脅迫下，也鑒定到大麥不同表型的QTL位點(diǎn)，在大麥1H、2H、3H、4H、5H、6H和7H染色體上均有分布，說(shuō)明大麥抗旱機(jī)制具有復(fù)雜性。

通過(guò)與前人定位到的大麥干旱相關(guān)QTL位點(diǎn)進(jìn)行比較，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與本研究檢測(cè)到的與株高和穗部性狀相關(guān)聯(lián)的QTL(、、、、、和)區(qū)域重合的位點(diǎn)，說(shuō)明這7個(gè)QTL可能為新的QTL位點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，株高和穗長(zhǎng)表現(xiàn)出干旱敏感特性，定位到的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)和均位于7H染色體上。對(duì)于，前人在7H染色體末端也發(fā)現(xiàn)含有調(diào)控株高的QTL，但相關(guān)基因未被精細(xì)定位和克隆。本研究在位點(diǎn)上下游100 kb檢測(cè)到HORVU7Hr1G118520基因，預(yù)測(cè)其編碼bZIP型轉(zhuǎn)錄因子TRAB1。且TRAB1已經(jīng)被證明能與ABA應(yīng)答元件(ABREs)互作，從而調(diào)節(jié)ABA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，而ABA廣泛參與干旱脅迫的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。推測(cè)大麥中TRAB1有可能通過(guò)調(diào)控大麥株高參與大麥的干旱響應(yīng)，但還需要進(jìn)一步分子生物學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)證。對(duì)于，Li等報(bào)道，調(diào)控穗長(zhǎng)的位點(diǎn)在7H染色體4 664 447、28 173 688、223 596 641、378 019 002、和605 456 401 bp處，而本研究檢測(cè)到的最強(qiáng)的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)在136 320 595 bp處，推測(cè)這可能是一個(gè)新的控制大麥穗長(zhǎng)的位點(diǎn)。本研究的不足之一在于表型性狀鑒定較少，后期還需繼續(xù)在不同干旱梯度脅迫下鑒定新的表型關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，進(jìn)一步發(fā)掘其他的抗旱相關(guān)QTL位點(diǎn)。

本研究進(jìn)一步對(duì)定位到的抗旱指數(shù)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)上下游100 kb內(nèi)潛在的候選基因進(jìn)行分析，共檢測(cè)到96個(gè)潛在的候選基因，其中HORVU4Hr1G084250編碼陽(yáng)離子質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)體(Cation/Hantiporter 2)。BAO等研究表明，Cation/H的積累能維持植物胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)和滲透調(diào)節(jié)，賦予葉片更高的相對(duì)含水量，進(jìn)而維持高水平的光合作用。因此，推測(cè)HORVU4Hr1G084250可能改變Ca的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而提高大麥的抗旱性。本研究還檢測(cè)到HORVU1Hr1G023280和HORVU7Hr1G085130候選基因，注釋到其響應(yīng)干旱脅迫；HORVU1Hr1G081910編碼IAA相關(guān)蛋白，推測(cè)也可能跟激素介導(dǎo)的抗旱性相關(guān)。此外，本研究還檢測(cè)HORVU1Hr1G073940、HORVU1Hr1G077680和HORVU4Hr1G011590候選基因，其中HORVU1Hr1G073940為MYB類轉(zhuǎn)錄因子，HORVU1Hr1G077680為乙烯反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，HORVU4Hr1G011590為WRKY 類轉(zhuǎn)錄因子，這幾類轉(zhuǎn)錄因子都已被證明與抗旱性密切相關(guān)，因此，推測(cè)這3個(gè)候選基因也是潛在的抗旱相關(guān)候選基因，但是其具體生物學(xué)功能還需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。