王 石,夏醫(yī)君,胡志偉,王 磊,佟根喜,王 鵬*

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 肝膽胰脾外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特010010;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特010010)

被稱為Klatskin瘤(Klatskin tumor)的肝門部膽管癌(Hilar cholangiocarcinoma，HCCA)，在膽道系統(tǒng)中是最為常見的一種惡性腫瘤，主要發(fā)生的部位是左肝管、右肝管、左右肝管分叉部以及肝總管位置[1]。此腫瘤在膽管黏膜下層沿膽管壁縱向生長，透壁性浸潤并向膽管周圍的其它組織呈放射狀擴(kuò)散，同時(shí)伴有對神經(jīng)的侵犯以及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移[2]。波形蛋白(Vimentin，VIM)作為Ⅲ型中間絲纖維蛋白，它的變化能夠使多數(shù)腫瘤細(xì)胞骨架和細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生重排、重塑，從而獲得間質(zhì)細(xì)胞特征,使得細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，獲得侵襲轉(zhuǎn)移能力，細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)[3]。糖類抗原19-9(Carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)是臨床上較為實(shí)用的一種腫瘤標(biāo)志物，CA19-9的檢測對某些腫瘤的診斷以及腫瘤組織的大小及分期的預(yù)測具有一定的臨床意義[4]。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)染色方法檢測波形蛋白在肝門部膽管癌的表達(dá)及分析血中CA19-9水平在肝門部膽管癌的臨床意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象

VIM的實(shí)驗(yàn)對象：實(shí)驗(yàn)組為收集2010年12月-2020年12月期間因“HCCA疾病”于內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院肝膽外科住院行根治性手術(shù)切除的存檔組織蠟塊60例，對照組為癌旁組織60例(經(jīng)病理科專家鏡下確定為無癌細(xì)胞的膽管組織)；所有標(biāo)本均經(jīng)病理科專家顯微鏡下確診，出具報(bào)告單，標(biāo)本4%甲醛固定，石蠟包埋，編號存檔。實(shí)驗(yàn)組取標(biāo)本入組時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)手術(shù)切除的組織經(jīng)病理確診為HCCA；②術(shù)中均留取HCCA組織作為標(biāo)本；③有完整臨床及隨訪資料；④術(shù)前均未接受化療或放射治療；⑤年齡性別不限。排除標(biāo)準(zhǔn)：①圍術(shù)期死亡者；②臨床資料不完整者；③合并有嚴(yán)重的心肝腎肺疾病以及精神疾病者；④合并其他惡性腫瘤者；對照組取標(biāo)本時(shí)納入標(biāo)準(zhǔn)：①標(biāo)本經(jīng)病理科專家鏡下確定為無癌細(xì)胞的膽管組織；②有完整臨床及隨訪資料；③術(shù)前均未接受化療或放射治療；④年齡性別不限。排除標(biāo)準(zhǔn)：①圍術(shù)期死亡者；②臨床資料不完整者；③合并有嚴(yán)重的心肝腎肺疾病以及精神疾病者；④合并其他惡性腫瘤者；

CA19-9的實(shí)驗(yàn)對象：實(shí)驗(yàn)組同上(按條件選擇的60例HCCA患者)；對照組為按條件選擇的60例膽總管結(jié)石患者；其中60例膽總管結(jié)石患者的入組標(biāo)準(zhǔn)是：①有完整的臨床病理資料；②患者經(jīng)手術(shù)或臨床確診為膽管良性疾??；③無其他系統(tǒng)惡性腫瘤或是良性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)為：①圍術(shù)期死亡者；②臨床資料不完整者；③合并有嚴(yán)重的心肝腎肺疾病以及精神疾病者；④合并其他惡性腫瘤者。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

通過免疫組化方法分別檢測60例肝門部膽管癌癌組織及癌旁組織中波形蛋白的表達(dá)，并分別收集實(shí)驗(yàn)組及對照組各個(gè)患者入院術(shù)前的血清CA19-9數(shù)值(單位為U/mL)，做好記錄。

1.3 IHC結(jié)果的判定

免疫組織化學(xué)結(jié)果分析：在醫(yī)學(xué)光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行評分，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為VIM陽性細(xì)胞，按視野中陽性細(xì)胞染色比例進(jìn)行評分，再按染色程度進(jìn)行評分。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評分：無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按染色比例進(jìn)行評分：未著色為0分，1%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，76%-100%為4分。染色強(qiáng)度與染色比例的乘積為最終評分，最終評分<3分為低表達(dá)，≥3分為高表達(dá)。

血清CA19-9水平分析：CA19-9≥39 U/mL 為陽性(高水平)，CA19-9<39 U/mL 為陰性(低水平)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析相關(guān)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用SPEARMAN秩相關(guān)進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在HCCA癌組織及癌旁組織中VIM表達(dá)的情況

在本實(shí)驗(yàn)中：(1)實(shí)驗(yàn)組(即HCCA患者癌組織)中VIM呈高表達(dá)者：43例患者；(2)對照組(即HCCA患者癌旁膽管組織)中VIM呈高表達(dá)者：23例患者；VIM在HCCA癌組織及癌旁組織中的高表達(dá)率分別為71.7%和38.3%，表達(dá)程度的差異性顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001<0.05)，見圖1。

圖1 鏡下：在HCCA組織中VIM的高表達(dá)為A圖(×200倍，×400倍)，低表達(dá)為B圖(×200倍，×400倍)；在癌旁正常膽管組織中VIM的高表達(dá)為C圖(×200倍，×400倍)，低表達(dá)為D圖(×200倍，×400倍)。

2.2 HCCA患者中VIM表達(dá)的程度與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系

在本實(shí)驗(yàn)中，通過60例癌組織切片檢測VIM表達(dá)程度與各臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析如下：

(1) 年齡≥60歲的患者癌組織中波形蛋白的陽性表達(dá)率高于<60歲的患者，兩組有顯著的差異性(χ2=19.86，P<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；腫瘤直徑≥2 cm的波形蛋白表達(dá)率高于腫瘤直徑<2 cm的患者，具有顯著的差異性(χ2=20.86，P<0.05)，在統(tǒng)計(jì)學(xué)中有意義；低分化患者的癌組織中波形蛋白的陽性表達(dá)率顯著高于中、高分化患者(χ2=10.86，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在淋巴轉(zhuǎn)移為陽性的患者中波形蛋白的陽性表達(dá)率高于淋巴轉(zhuǎn)移陰性的患者，兩組有顯著的差異性(χ2=17.93，P<0.05)，在統(tǒng)計(jì)學(xué)中有意義；在腫瘤TNM分期中的T分期里：在T3/T4期中波形蛋白的陽性表達(dá)率高于T1/T2期，兩組有顯著的差異性(χ2=18.61，P<0.05)，在統(tǒng)計(jì)學(xué)中有意義；血管侵犯為陽性的患者中VIM的陽性表達(dá)率高于血管侵犯為陰性的患者，兩組有顯著的差異性(χ2=7.07，P<0.05)，在統(tǒng)計(jì)學(xué)中有意義。

(2)其中HCCA中的VIM表達(dá)程度與患者性別、神經(jīng)侵犯的相關(guān)性均無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=3.10、1.05，P>0.05)。

2.3 HCCA患者及所患良性膽管疾病(膽總管結(jié)石)患者血清中的術(shù)前CA19-9水平

在本實(shí)驗(yàn)中：(1)實(shí)驗(yàn)組(即HCCA患者)中術(shù)前的血清CA19-9水平明顯為高(陽性)：40例患者；(2)對照組(即：膽總管結(jié)石患者)術(shù)前的血清CA19-9水平明顯為高(陽性)：25例患者；CA19-9在HCCA患者及膽總管結(jié)石患者中的陽性率分別為66.7%和41.7%，其水平高低程度有明顯的差異，此差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006<0.05)。

2.4 HCCA患者血清CA19-9水平程度與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

本實(shí)驗(yàn)通過收集60例HCCA患者相關(guān)數(shù)據(jù)，研究HCCA患者術(shù)前血清中CA19-9水平與各組臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性：

(1)年齡≥60歲的HCCA患者中CA19-9水平的陽性率高于<60歲的患者，兩組的差異性明顯(χ2=6.34，P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；腫瘤直徑≥2 cm患者的CA19-9水平的陽性率高于腫瘤直徑<2 cm的患者，具有顯著的差異性(χ2=32.175，P<0.05)，在統(tǒng)計(jì)學(xué)中有意義；低分化患者的CA19-9水平的陽性率高于中、高分化患者，差異性顯著(χ2=19.86，P<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在淋巴轉(zhuǎn)移為陽性的患者中CA19-9水平的陽性率高于淋巴轉(zhuǎn)移陰性的患者，兩組有顯著的差異性(χ2=16.15，P<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在腫瘤TNM分期中的T分期里：在T3/T4期中CA19-9水平的陽性率高于T1/T2期，兩組有顯著的差異性(χ2=35.71，P<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；血管侵犯為陽性的患者中CA19-9水平的陽性率高于血管侵犯為陰性的患者，兩組有顯著的差異性(χ2=25.65，P<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；神經(jīng)侵犯陽性的患者中CA19-9的陽性率高于神經(jīng)侵犯陰性的患者，兩組有顯著的差異性(χ2=6.54，P<0.05)，在統(tǒng)計(jì)學(xué)中有意義。

(2)術(shù)前CA19-9水平與患者性別的相關(guān)聯(lián)性沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.54，P>0.05)。

2.5 HCCA患者中VIM表達(dá)和血清中CA19-9水平的關(guān)聯(lián)性

對60例HCCA患者中VIM和CA19-9的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：在HCCA患者，VIM的高表達(dá)與血清CA19-9高水平(陽性)成正相關(guān)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(相關(guān)系數(shù)r=0.34，P=0.008)，提示VIM的表達(dá)與術(shù)前血清中CA19-9的水平呈現(xiàn)協(xié)同作用。

2.6 預(yù)后分析(生存分析)

2.6.1單因素分析 (1)使用Kaplane-Meier法進(jìn)行分析后顯示，HCCA患者中VIM的高表達(dá)和術(shù)前血清中CA19-9的高水平(陽性)與患者的預(yù)后不良明顯相關(guān)(Log Rank=14.350,P=0．000；Log Rank=32.592,P=0．000)，在統(tǒng)計(jì)學(xué)中有意義。

(2)此外，年齡≥60歲、腫瘤大小≥2 cm，腫瘤低分化、淋巴轉(zhuǎn)移陽性、腫瘤TNM分期中的T分期為T3/T4、血管侵犯陽性等因素與患者預(yù)后差相關(guān)(Log Rank=4.898，P=0.027；Log Rank=19.833,P=0.000；Log Rank=10.705，P=0．001；Log Rank=21.822，P=0．000；Log Rank=28.742，P=0．000；Log Rank=25.516，P=0.000)，同時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

(3)預(yù)后情況與患者的性別、神經(jīng)侵犯不相關(guān)(Log Rank=0.160,P=0．689；Log Rank=3.212,P=0．073)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6.2多因素分析 將影響HCCA患者預(yù)后的單因素變量(P<0.05)納入COX多因素分析證實(shí)：影響HCCA患者根治性切除術(shù)后生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素為VIM高表達(dá)、CA19-9陽性、淋巴轉(zhuǎn)移陽性、血管侵犯陽性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 影響實(shí)驗(yàn)組對象(60例HCCA患者)預(yù)后的多因素分析

3 討論

HCCA是一種最難治療的腫瘤之一，具有侵襲性腫瘤生物學(xué)特性，手術(shù)切除目前是治療的理想方法，但是由于腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移、血管及神經(jīng)侵犯等病理因素的影響，多數(shù)患者手術(shù)切除率低，復(fù)發(fā)率高，生存期短[5]。因此對HCCA的早期診斷在患者后期進(jìn)一步的治療中具有重要意義。多種腫瘤標(biāo)記物(如血清糖類抗原19-9、糖類抗原125和癌胚抗原等)的聯(lián)合檢測可有效的預(yù)測HCCA，但由于血清學(xué)的檢測易受多種因素的影響，在臨床應(yīng)用中相對受限；對于這種難治療的腫瘤，我們應(yīng)不斷通過科研來提高其診斷及治療方式，改善預(yù)后，為患者帶來福音。目前，由于腫瘤診斷過程的煩瑣、費(fèi)用昂貴等因素致使HCCA的早期診斷無法順利進(jìn)展。因此,在人體體液內(nèi)檢測腫瘤細(xì)胞分泌的靶基因可能作為一種無創(chuàng)的、高度可靠的診斷方式出現(xiàn)在臨床中。

波形蛋白(Vimentin，VIM)是上皮向間充質(zhì)過渡(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)的標(biāo)志，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)展、遷移、侵襲過程中起著重要的作用。有研究表明，間充質(zhì)特征與疾病復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、腫瘤進(jìn)展和預(yù)后惡化的傾向顯著相關(guān)，而VIM正是一種在間充質(zhì)細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞)中組成性表達(dá)的Ⅲ型中間絲蛋白。VIM的高表達(dá)影響著晚期腫瘤分期及預(yù)后，VIM在多種惡性腫瘤(如乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、結(jié)直腸癌和卵巢癌)的癌組織中都呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)[6]。本次實(shí)驗(yàn)中，通過免疫組化方法檢測結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)VIM在HCCA癌組織中表達(dá)程度明顯高于癌旁組織，對比差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；并且通過分析VIM與HCCA患者的多種臨床病理因素的關(guān)系，得知VIM的高表達(dá)與HCCA患者的年齡≥60歲、腫瘤大小≥2 cm明顯相關(guān)，同時(shí)與腫瘤低分化、淋巴轉(zhuǎn)移陽性、腫瘤TNM分期中的T分期(T3/T4)、血管侵犯陽性等因素也相關(guān)聯(lián)，在統(tǒng)計(jì)學(xué)中均有意義(P<0.05)；與患者的性別、神經(jīng)侵犯并無明顯相關(guān)性，也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明，VIM在HCCA的發(fā)生和發(fā)展中起著極大的作用。研究發(fā)現(xiàn)EMT是細(xì)胞獲得逃逸能力的過程，是從上皮層侵入間質(zhì)并形成轉(zhuǎn)移灶的過程，VIM作為其標(biāo)志性分子，與多種腫瘤的預(yù)后有著密切的關(guān)系[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，在HCCA患者中，VIM表達(dá)高的患者比表達(dá)低的患者的生存時(shí)間明顯要短，再次證實(shí)了VIM對HCCA患者的預(yù)后不良起著重要的作用。從而進(jìn)一步推測VIM將來可以作為一種生物標(biāo)記物，被用來評估和預(yù)測患者術(shù)前和術(shù)后生存情況。

糖類抗原19-9(Carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)是在臨床上應(yīng)用價(jià)值很大的一種腫瘤標(biāo)志物，應(yīng)用于多種惡性腫瘤患者的檢測[8]。其在膽管癌的診斷和預(yù)后檢測中的作用被大家一致認(rèn)可。已有研究表明術(shù)前 CA19-9 高水平是膽管癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立因素，在膽管癌的診斷中，其靈敏性也較高[9-10]。本實(shí)驗(yàn)中，通過收集實(shí)驗(yàn)組與對照組二組中受檢對象的血清CA19-9數(shù)值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)CA19-9在HCCA患者中的水平明顯高于良性膽管疾病(膽總管結(jié)石)患者，對比差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；并且通過分析可知：CA19-9的高水平(陽性)與HCCA患者的多種臨床病理因素(即年齡≥60歲、腫瘤大小≥2 cm、腫瘤低分化、淋巴轉(zhuǎn)移陽性、腫瘤TNM分期中的T分期(T3/T4)、血管侵犯陽性及神經(jīng)侵犯陽性)明顯相關(guān)聯(lián)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與性別無明顯相關(guān)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在HCCA中，血清中CA19-9水平高(陽性)的患者比水平相對低(陰性)的患者的生存時(shí)間短，這證實(shí)了在HCCA患者的預(yù)后中，術(shù)前血清CA19-9高水平作為一個(gè)相對獨(dú)立的危險(xiǎn)因素影響著HCCA患者的預(yù)后。在將來，血清CA19-9可能會被用于對早期HCCA的監(jiān)測以及評估和預(yù)測患者術(shù)前和術(shù)后生存情況。

本實(shí)驗(yàn)研究在HCCA患者中VIM表達(dá)與血清中CA19-9水平情況的相關(guān)性進(jìn)行分析后得知，VIM表達(dá)與血清中CA19-9的水平存在明顯的正相關(guān)性，這表明在HCCA的發(fā)生、發(fā)展過程中，VIM與CA19-9起著協(xié)同作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HCCA患者中高表達(dá)的VIM和高水平的CA19-9與患者的臨床病理因素(如年齡、腫瘤大小、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期中的T分期、血管侵犯等)相關(guān)。同時(shí)也證實(shí)了VIM高表達(dá)、CA19-9高水平、淋巴轉(zhuǎn)移陽性、血管侵犯陽性等可作為獨(dú)立危險(xiǎn)因素影響HCCA患者的預(yù)后。

在HCCA患者中，我相信通過不斷對VIM及血清中CA19-9的研究，VIM與CA19-9的聯(lián)合檢測將來可為HCCA患者的早期診斷提供一個(gè)可靠的依據(jù)，同時(shí)也可為該疾病的靶向治療領(lǐng)域提供一個(gè)新的治療手段。

作者簡介：王石，內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院肝膽胰脾外科主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師;王鵬，內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院，肝膽胰脾外科醫(yī)師。