李清清 劉志齋張潔 徐德林?

（1.遵義醫(yī)科大學(xué)， 貴州 遵義563099； 2.西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院， 重慶400715； 3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所， 四川 成都610061）

中醫(yī)藥是我國(guó)的瑰寶，在我國(guó)數(shù)千年的歷史長(zhǎng)河中對(duì)人類的健康有著決定性作用。中藥防治和干預(yù)疾病時(shí)發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)就是藥用植物中的藥用活性成分，這些活性成分主要包括生物堿類、甾體類、多酚類、萜類等，是植物進(jìn)行次生代謝產(chǎn)生的復(fù)雜化合物，也是中藥治療疾病的根本。在植物細(xì)胞、組織等的分化與完善過(guò)程中，這些次生代謝產(chǎn)物在特定的部位逐漸積累，但是總含量較低，因而入藥部位少，藥用成本高。采用化學(xué)法合成植物的復(fù)雜次生代謝產(chǎn)物，存在合成步驟繁瑣、合成成本高、環(huán)境不友好等缺點(diǎn)，使得藥用植物生物活性成分無(wú)法大量人工合成。而合成生物學(xué)方法具有高效、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定、綠色環(huán)保、周期短等優(yōu)點(diǎn)，是現(xiàn)代新藥的創(chuàng)新途徑，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和發(fā)展?jié)摿?。合成生物學(xué)的發(fā)展為藥用植物活性成分的研究注入新的動(dòng)力，對(duì)于藥用植物活性成分的生物合成研究也取得了巨大進(jìn)展，本文對(duì)藥用植物活性成分在合成生物學(xué)上的研究進(jìn)展做概括介紹，以期為進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 中藥藥用活性成分

藥用植物的治療潛力是由于其存在一些生物活性成分，如單寧、萜類、生物堿、類黃酮等小分子化合物。單寧具有收斂、消炎、止瀉、抗氧化、抗菌等生理活性，可加速傷口和發(fā)炎黏膜的愈合。萜類化合物存在多種類別，有單萜、二萜、倍半萜等，大多具有清除自由基、消除炎癥、防治腫瘤、降血糖、抗膽堿酶等活性，對(duì)預(yù)防和治療癌癥、減少炎癥發(fā)生、治療呼吸道疾病、治療糖尿病等都有重要價(jià)值。生物堿具有防治瘧疾、哮喘、癌癥、心律失常、高血糖、鎮(zhèn)痛等作用，在傳統(tǒng)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中廣泛使用，亦可作為藥物發(fā)現(xiàn)的起點(diǎn)。有些生物堿還是興奮劑類精神活性藥物，可用于創(chuàng)傷治療。類黃酮也具有抑菌、抗病毒、防治癌癥、清除自由基、延緩衰老、預(yù)防心血管疾病、止痛、鎮(zhèn)痛等作用。

中藥起作用的根本保證是藥用活性成分，這些活性成分也是開發(fā)新藥的源頭［1?2］。藥用活性成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜、含量少，化學(xué)方法合成難度大，甚至?xí)茐纳鷳B(tài)環(huán)境，而且許多中藥材的生長(zhǎng)還受土壤、季節(jié)等生態(tài)環(huán)境因素限制，部分珍稀中藥材的生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，其活性成分更是無(wú)法大量獲取，科研和新藥的大量需求是傳統(tǒng)提取方法或化學(xué)合成法無(wú)法滿足的，合成生物學(xué)方法將有效解決這一矛盾［3］。

2 合成生物學(xué)應(yīng)用于藥用活性成分富集的研究概況

合成生物學(xué)是21 世紀(jì)新興的一門學(xué)科，是在基因工程、代謝工程等學(xué)科的基礎(chǔ)上形成的整合學(xué)科。合成生物學(xué)以生物學(xué)為基礎(chǔ)，融入工程學(xué)的模塊化與系統(tǒng)設(shè)計(jì)理念，以達(dá)到人工改造并優(yōu)化生物合成過(guò)程中有關(guān)的生物元件，或者合成全新的具有定向性能的新生物體的元件、器件或模塊，設(shè)計(jì)更加系統(tǒng)穩(wěn)定的生物體系的目的。由此形成的合成生物體系將在能源、醫(yī)學(xué)、材料、環(huán)境、天然化合物等領(lǐng)域達(dá)到規(guī)?；瘧?yīng)用。合成生物學(xué)是生命發(fā)展過(guò)程中人類第1 次將生命科學(xué)工程化的學(xué)科［4］。合成生物學(xué)的內(nèi)容包括合成生物學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與組裝、調(diào)控與優(yōu)化，在生物合成系統(tǒng)設(shè)計(jì)上主要包括底盤細(xì)胞的選擇、合成生物系統(tǒng)所需元件和途徑挖掘、計(jì)算機(jī)輔助的設(shè)計(jì)與分析、生物合成系統(tǒng)的構(gòu)建與組裝等方面。系統(tǒng)的調(diào)控優(yōu)化主要是在基因組水平上的全局優(yōu)化以及單點(diǎn)的調(diào)控與優(yōu)化，系統(tǒng)優(yōu)化包括單一基因的優(yōu)化、多基因途徑的組合優(yōu)化、基因組簡(jiǎn)化和重構(gòu)、生物合成系統(tǒng)的分析與篩選、“設(shè)計(jì)→構(gòu)建→檢驗(yàn)→重設(shè)計(jì)”的特征循環(huán)等方面。

生物合成是生物體內(nèi)同化反應(yīng)的總稱，具有不同的生理意義，包括①提供生物體生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖所必要的物質(zhì)；②在正常狀態(tài)下，對(duì)消耗掉的物質(zhì)進(jìn)行補(bǔ)充；③為長(zhǎng)期和短期的貯藏進(jìn)行必要的合成。生物合成有由主要原料進(jìn)行從頭合成的全合成途徑（如光合作用等），也有可逆性的廢物利用途徑，由部分分解產(chǎn)物合成（如嘌呤核苷酸的轉(zhuǎn)換）。生物合成的各個(gè)途徑之間可能存在相互作用，在生物體中受到復(fù)雜的調(diào)控［5］。

生物合成通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化的生物模塊，構(gòu)建起具有詳細(xì)生物學(xué)特征的元件后轉(zhuǎn)入底盤細(xì)胞，通過(guò)重新構(gòu)建代謝合成途徑，實(shí)現(xiàn)定向高效的異源合成，使代謝工程的改造效率大幅提高，亦可使生物學(xué)系統(tǒng)變得更加豐富［6］，具有標(biāo)準(zhǔn)性、簡(jiǎn)便性的特點(diǎn)。合成生物學(xué)策略主要有4種，分別為①表達(dá)目標(biāo)產(chǎn)物，即通過(guò)微生物宿主使目標(biāo)產(chǎn)物的基因?qū)崿F(xiàn)異源表達(dá)；②改進(jìn)生物合成途徑，即將新的生物元件或基因引進(jìn)生物合成途徑，重新組織構(gòu)建或延伸原有的生物合成途徑；③雜合生物合成途徑在合適的底盤細(xì)胞中的表達(dá)；④人工設(shè)計(jì)構(gòu)建目標(biāo)化合物的基因，在合適的底盤細(xì)胞中完成基因的表達(dá)［7］。底盤細(xì)胞即人為在細(xì)胞中構(gòu)建生物系統(tǒng)，使其具有特定功能的細(xì)胞，如大腸桿菌、煙草細(xì)胞等一些微生物和植物細(xì)胞。

基于合成生物學(xué)的特點(diǎn)，天然產(chǎn)物尤其是有明確藥理活性的單體化合物的研究，在合成生物學(xué)出現(xiàn)后獲得了全新的機(jī)遇。中藥藥用活性成分的大量獲取在極大程度上可依賴合成生物學(xué)，其在藥用活性成分生物合成中的操作包括選擇優(yōu)良的底盤細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行改造（如敲除細(xì)胞中的冗余基因、將基因組整合到底盤細(xì)胞中人為組裝構(gòu)建新的目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑、對(duì)合成代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行調(diào)控、通過(guò)宿主細(xì)胞構(gòu)建異源合成途徑等），進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化并結(jié)合發(fā)酵工程技術(shù)，實(shí)現(xiàn)藥用活性成分的定向高效合成（如青蒿素的微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)等）［8］。目前，許多研究已經(jīng)通過(guò)DNA 重組技術(shù)順利構(gòu)建擁有高附加值的微生物工程菌株，包括紫杉醇前 體［9］、丹參酮［10］、人參皂苷［11］、阿 片類［12］、姜黃素［13］、鼠尾草酸［14］等化合物。形成一套藥用植物合成生物學(xué)研究策略［15］，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的高效生產(chǎn)，從而滿足人們對(duì)藥用植物資源中活性成分的大量需求，這將對(duì)藥用植物資源的可持續(xù)利用，提升我國(guó)研發(fā)創(chuàng)新性藥物的能力和國(guó)際醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的核心競(jìng)爭(zhēng)力都有很大幫助。

3 中藥藥用活性成分生物合成中的關(guān)鍵技術(shù)

3.1 基因元件的設(shè)計(jì)改造 基因元件是具備特定功能的核苷酸序列，是生物體中最基本、最簡(jiǎn)單的單元，包含啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、功能蛋白、酶編碼基因等，對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控有非常重要的意義。這些元件在天然生物中分離得到后，經(jīng)過(guò)人工組合、完善、優(yōu)化后可得到新的生物元件。李雷等［16］通過(guò)易錯(cuò)PCR 法對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行突變，結(jié)合基因改組的蛋白工程技術(shù)，改造釀酒酵母的TEFl 啟動(dòng)子，建立突變啟動(dòng)子庫(kù)，得到一系列強(qiáng)度不同的突變啟動(dòng)子。簡(jiǎn)單的生物元件還可以通過(guò)多種多樣的組合，在更大規(guī)模的設(shè)計(jì)中形成復(fù)雜的具有特定功能的生物元件和裝置。例如將效應(yīng)結(jié)構(gòu)域、RNA 發(fā)卡結(jié)構(gòu)和單鏈RNA 結(jié)合蛋白進(jìn)行組合獲得新的功能元件，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因功能的調(diào)控［17］。通過(guò)基因編輯技術(shù)對(duì)生物體中基因元件進(jìn)行精確的修改編輯，也可獲得具有新功能的生物元件，例如鋅指核酸酶（ZFN），即為工程化體內(nèi)具有DNA 序列結(jié)合特異性鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域和核酸內(nèi)切酶FokⅠ結(jié)構(gòu)域構(gòu)建新的可識(shí)別特異序列的核酸酶［18］，而現(xiàn)在只有丹參酮［19?21］、紫杉醇［22?23］、青 蒿素［24?25］、人參皂苷［26?27］等少部分藥用活性成分的代謝通路研究比較透徹，大多數(shù)藥物活性成分的代謝途徑還在研究和發(fā)現(xiàn)中，隨著中藥藥用活性成分相關(guān)途徑的不斷解析，應(yīng)用于合成生物學(xué)的基因元件也將得到補(bǔ)充。因此，目前研究的重要任務(wù)之一是對(duì)相關(guān)生物合成途徑的解析以及基因調(diào)控元件的發(fā)掘。

3.2 底盤細(xì)胞的選擇和改造 合成生物學(xué)可以使底盤細(xì)胞具有人類需要的特定生物功能，這些底盤細(xì)胞除了要具備自我復(fù)制和代謝能力，還應(yīng)具備生長(zhǎng)周期短、遺傳背景清晰、易于培養(yǎng)、能通過(guò)人工設(shè)計(jì)調(diào)控元件優(yōu)化原有代謝網(wǎng)絡(luò)提升合成效率等特征。近年來(lái)，大腸桿菌、藍(lán)細(xì)菌、釀酒酵母、煙草細(xì)胞等微生物和一些植物被廣泛用作異源合成的底盤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的高效合成以及某些特定類型的化合物合成，如以酵母為底盤細(xì)胞異源合成丹參酮［10］、以煙草細(xì)胞為底盤合成青蒿素［28］。

一般來(lái)說(shuō)，底盤細(xì)胞本身不能進(jìn)行繁復(fù)的次生代謝，必須對(duì)相應(yīng)底盤細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)施行優(yōu)化，才能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的異源合成。為了解除合成途徑中的某些制約，增加目標(biāo)產(chǎn)物合成效率，有2 種策略可以對(duì)合成代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行改造優(yōu)化，一種優(yōu)化方式是“自上而下”地從頭合成基因，另一種方式是“自下而上”地逐步敲除冗余基因［29］。

構(gòu)建異源合成系統(tǒng)的過(guò)程中，異源合成途徑時(shí)常會(huì)導(dǎo)致某些有毒中間物的積累，制約合成產(chǎn)物的輸送，使代謝途徑中能量流動(dòng)不均勻，目標(biāo)產(chǎn)物合成過(guò)程中沒(méi)有適合的前體供給，嚴(yán)重?cái)_亂底盤細(xì)胞原有的生命活動(dòng)。因此，底盤細(xì)胞的優(yōu)化關(guān)鍵在于分配好目標(biāo)產(chǎn)物合成過(guò)程中的物質(zhì)、信息和能量，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物合成和運(yùn)輸?shù)膬?yōu)化。隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，釀酒酵母、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌等物種的全基因代謝網(wǎng)絡(luò)模型［30］被建立，通過(guò)代謝網(wǎng)絡(luò)通量分析的方法模擬預(yù)測(cè)底盤細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而使目標(biāo)產(chǎn)物的合成得到優(yōu)化［31］。對(duì)底盤細(xì)胞基因組的改造賦予了細(xì)胞工廠全新的生物學(xué)功能和發(fā)展前景，如大腸桿菌等基因組的人為重建和優(yōu)化［29］，不僅對(duì)基因組的結(jié)構(gòu)、功能、相互作用等研究有了新的認(rèn)識(shí)，也為構(gòu)建復(fù)雜天然化合物的細(xì)胞工廠提供指導(dǎo)，從而選擇最佳的底盤細(xì)胞代謝合成途徑，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的合成優(yōu)化。

3.3 代謝途徑的構(gòu)建策略 生物體代謝途徑是由酶催化的復(fù)雜動(dòng)態(tài)平衡網(wǎng)絡(luò)，中藥合成生物學(xué)中有2 種構(gòu)建代謝途徑的策略用于合成藥用活性成分。一種是在已經(jīng)闡明的生物合成代謝途徑上，對(duì)原本存在的代謝途徑進(jìn)行重新構(gòu)建和工程化，這又可以分為3 個(gè)層次［32］，分別為①通過(guò)底盤細(xì)胞本身的前體供應(yīng)途徑，應(yīng)用基因工程技術(shù)生成目標(biāo)產(chǎn)物；②通過(guò)模塊化的設(shè)計(jì)理念和基因工程原理，定向改造并優(yōu)化合成路徑，結(jié)合底物調(diào)控模塊使目標(biāo)產(chǎn)物高效合成；③對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，通過(guò)可拆卸的基因調(diào)控元件構(gòu)建不同的活性模塊，優(yōu)化模塊中的元件［33］，組裝形成不同的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［34］，將復(fù)雜的生物合成途徑變得工程化。另一種策略是設(shè)計(jì)構(gòu)建一條全新的藥用活性成分合成途徑，根據(jù)目標(biāo)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)從基因數(shù)據(jù)庫(kù)中將相應(yīng)酶基因篩選出來(lái)，人為改造并導(dǎo)入底盤細(xì)胞，可在底盤細(xì)胞中程序化形成一條新的異源代謝途徑。

3.4 生物合成工藝的優(yōu)化 目標(biāo)化合物的代謝途徑并不是一成不變的，而是相互交錯(cuò)而成的動(dòng)態(tài)平衡網(wǎng)絡(luò)，需要在已有代謝途徑的基礎(chǔ)上整體進(jìn)行改進(jìn)與創(chuàng)新，提高目標(biāo)產(chǎn)物的合成率，這可從3 個(gè)方面進(jìn)行［32］，分別為①優(yōu)化生物合成路線，提高工程菌株生物合成途徑的效率，方法包括增加前體的供應(yīng)、增加生物合成路徑所需底物的絕對(duì)總量以及提高藥用活性成分合成的特定途徑中的單個(gè)基因的表達(dá)效率和途徑酶的工作效率；②減少或限制競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑流入，使相對(duì)多的底物進(jìn)入藥用活性成分合成的特異代謝途徑；③生物合成代謝網(wǎng)絡(luò)的整體調(diào)控，主要方法是結(jié)合生物信息分析，以一種系統(tǒng)的觀點(diǎn)對(duì)合成途徑中的調(diào)控進(jìn)行數(shù)學(xué)描述，反應(yīng)代謝網(wǎng)絡(luò)中的控制，如代謝流控制分析、代謝流量?jī)?yōu)化等。中藥藥用活性成分對(duì)細(xì)胞大多都有一定的毒性，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄調(diào)控可以有效提高細(xì)胞性能［35］，增加產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的耐受性，有利于整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)的協(xié)調(diào)，同時(shí)增加藥用活性成分的生物合成。

4 常用藥用活性成分的生物合成研究概況

中藥活性成分多屬于植物次生代謝產(chǎn)物，類型較多，有4 條主干合成途徑，分別為莽草酸途徑、氨基酸途徑、乙酸?丙二酸途徑（AA?MA 途徑）、甲戊二羥酸途徑（或稱賈瓦龍酸途徑，MVA 途徑）。

4.1 生物堿的生物合成 生物堿是生物體內(nèi)次級(jí)代謝產(chǎn)生的一大類復(fù)雜的含氮有機(jī)化合物，主要有多烴類、莨菪烷類、嘌呤類、托品烷類等多種結(jié)構(gòu)類別，其中托品烷生物堿具備抗膽堿等多種生物活性，主要是茄科、毛茛科等雙子葉類高等植物次級(jí)代謝產(chǎn)生的一類復(fù)雜化合物，具有悠久的藥用歷史。植物中腐胺是托品烷生物堿合成的前體，以鳥氨酸或精氨酸開始，經(jīng)過(guò)相應(yīng)酶的催化最終合成腐胺，這2 條腐胺的生物合成途徑已經(jīng)得到闡明［36］。這2 條途徑在不同植物中對(duì)產(chǎn)物合成的貢獻(xiàn)不同，但其合成的次生代謝產(chǎn)物都具有物種特異性。托品烷生物堿的生物合成途徑也已有部分得到解析，N?甲基?腐胺轉(zhuǎn)移酶（PMT）是托品烷生物堿合成途徑中起作用的第一個(gè)酶，其是否為限速酶與物種有關(guān)。經(jīng)N?甲基腐胺氧化酶（MPO）催化最終可形成在各代謝途徑中發(fā)揮中心作用的活性N?甲基?△1?吡咯啉正離子，可以在植物體中參與一些反應(yīng)生成托品酮，它是合成莨菪堿的前體，也是托品烷生物堿途徑特有的二環(huán)結(jié)構(gòu)。托品酮還原酶分為托品酮還原酶Ⅰ、托品酮還原酶Ⅱ，它們的酶活性可以直接影響托品烷生物堿的含量，也可以通過(guò)影響底物托品酮含量間接地影響托品烷生物堿的含量，這2 種托品酮還原酶的酶活性還會(huì)使代謝流的走向受到調(diào)控［37］。生物體內(nèi)存在的其他代謝途徑也會(huì)調(diào)控托品烷生物堿的生物合成，人為對(duì)相關(guān)信號(hào)途徑進(jìn)行設(shè)計(jì)改造也可能會(huì)間接地調(diào)節(jié)托品烷生物堿的合成和積累［38］。

托品烷生物堿生物合成途徑中的相關(guān)反應(yīng)步驟以及涉及到的酶基因尚未完全研究清楚，例如1?甲基?△?吡咯啉正離子生成前體托品酮的反應(yīng)是如何進(jìn)行的？苯丙酮酸生成苯乳酸是如何還原的以及限速步驟和限速酶都有哪些？雖然不同植物中對(duì)托品烷生物堿合成的調(diào)節(jié)是物種特異的，但是所有植物中的托品烷生物堿天然合成途徑卻是相同的。托品烷生物堿生物合成途徑中的基因片段、關(guān)鍵酶、代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制以及轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制等還有待進(jìn)一步探索，目前相關(guān)的研究工作正在積極有序地開展。

4.2 萜類化合物的生物合成 萜類化合物是以C5為基本結(jié)構(gòu)單元的化合物及其含氧和不同飽和程度的衍生物，包括類胡蘿卜素、紫杉醇、丹參酮等，是中草藥中重要的化合物，萜類化合物的通用合成途徑已經(jīng)基本闡明［39］。類胡蘿卜素是萜類化合物的代表之一，研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌4?磷酸甲基赤蘚糖醇（MEP）途徑的5 個(gè)基因（dxr、ispD、ispE、ispG、ispH）中，過(guò)表達(dá)ispG下游的ispH基因可以使β?胡蘿卜素產(chǎn)量提高73%，ispG、ispH基因的協(xié)同表達(dá)是MEP 途徑中重要限速步驟之一［40］，該研究對(duì)解析MEP 途徑的調(diào)控機(jī)制和通過(guò)微生物細(xì)胞工廠大量生產(chǎn)萜類化合物具有重大意義。

紫杉醇是紅豆杉Taxus baccataLinn.次生代謝產(chǎn)生的二萜類化合物，具有高效、低毒的特點(diǎn)，且抗癌活性良好。紫杉醇的生物合成大致可以分為3 個(gè)步驟［28］，分別為①紫杉烷環(huán)母核的合成，植物中所有萜類合成的共同代謝前體是異戊二烯，沿著異戊二烯代謝途徑先合成紫杉烷骨架［紫杉?4（5），11（12）?二烯］，該步驟以4 個(gè)異戊二烯分子縮合生成的雙（牻牛兒基）二磷酸鹽（GGPP）作為起點(diǎn)，反應(yīng)酶為紫杉二烯合成酶，最后環(huán)化為紫杉二烯；②骨架上的官能團(tuán)反應(yīng)，在紫杉二烯骨架上的相應(yīng)位點(diǎn)發(fā)生羥基化等一系列的官能團(tuán)反應(yīng)，最終生成化合物巴卡亭Ⅲ，它作為直接前體參與到紫杉醇的代謝合成途徑中；③合成紫杉醇的側(cè)鏈，側(cè)鏈在氨基變位酶的催化下生成，卻是分2 步連接的，在?；D(zhuǎn)移酶的催化下先形成N?苯甲酰紫杉醇，再經(jīng)過(guò)羥基化修飾和苯甲?；揎椛勺仙即肌ｊP(guān)于紫杉醇詳細(xì)的合成過(guò)程和反應(yīng)機(jī)理以及相關(guān)酶基因還沒(méi)有研究完全，要通過(guò)生物合成實(shí)現(xiàn)大量生產(chǎn)紫杉醇還要不斷努力。目前，通過(guò)紫杉醇的抗腫瘤生物活性，研制出了很多新型制劑，包括聚合物膠束、納米顆粒、藥物前體等［41］，但在療效方面還有待提高。

丹參酮是唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.中的一種有效成分，是二萜醌類化合物，與其他二萜類化合物一樣，以MEP 途徑或MVA 途徑這2 條萜類化合物通用前體合成途徑為起點(diǎn)，參與其中的重要酶包括一系列的焦磷酸合酶、細(xì)胞色素P450 家族蛋白CYP76AH1等，中間產(chǎn)物包括共同前體GGPP、半日花二烯／古巴基二磷酸酯（CPP）、丹參酮二烯、鐵銹醇、次丹參酮等，最后合成丹參酮類化合物［42］。在認(rèn)識(shí)生物合成途徑的基礎(chǔ)上，熊丙全等［43］以茉莉酸甲酯為誘導(dǎo)子，研究丹參毛狀根毛中次生代謝途徑的調(diào)控，結(jié)果表明，誘導(dǎo)后丹參酮Ⅰ的含量提高到1.53倍，丹參酮ⅡA的含量提高到1.16 倍；丹參中的另一種活性成分酚酸類化合物，相比于未誘導(dǎo)時(shí)，迷迭香酸的含量提高到1.37倍，丹酚酸B 的含量提高到4.43倍，提示茉莉酸甲酯參與丹參毛狀根中丹參酮類化合物代謝途徑的調(diào)控，對(duì)丹參酮類和酚酸類活性成分的積累具有正效應(yīng)。Guo 等［10］對(duì)丹參酮的生物合成途徑進(jìn)行研究，通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)篩選得到2 個(gè)細(xì)胞色素氧化酶P450 基因（CYP76AH3、CYP76AK），將這2 個(gè)功能基因引入設(shè)計(jì)好的底盤細(xì)胞中，得到的酵母工程菌株能同時(shí)產(chǎn)生6 種二萜類代謝產(chǎn)物，這為生物體中丹參酮生物合成途徑的闡明、代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控、關(guān)鍵酶基因的研究、微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)等奠定基礎(chǔ)。Shi 等［44］研究表明，從丹參（原變種）Salvia miltiorrhizaBunge 毛狀根中克隆了2 個(gè)新基因SmJAZ3、SmJAZ9，這2 個(gè)基因在代謝途徑中調(diào)控丹參酮的生物合成，在茉莉酸信號(hào)途徑中起抑制性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑的作用。Pei等［45］提出SmJAZ8 基因作為茉莉酸誘導(dǎo)的丹酚酸和丹參酮生物合成中負(fù)反饋回路控制器的新作用，SmJAZ8 基因的遺傳轉(zhuǎn)化改變了其他SmJAZ基因的表達(dá)，表明在茉莉酸調(diào)控的次級(jí)代謝中發(fā)生串?dāng)_跡象，為將來(lái)詳細(xì)研究其分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。張建紅等［46］采用RT?PCR 法、生物信息學(xué)分析、遺傳轉(zhuǎn)化、化學(xué)檢測(cè)、代謝組學(xué)分析等研究過(guò)表達(dá)丹參毛狀根中SmCYP81C16 基因，結(jié)果表明，SmCYP81C16對(duì)丹參酮的生物合成有正向調(diào)控作用，為丹參酮類化合物的高效生物合成奠定基礎(chǔ)。

4.3 黃酮類化合物的生物合成 黃酮類物質(zhì)是自然界中絕大多數(shù)植物都含有的一類含氧雜環(huán)的化合物，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗菌防病等有重要作用，其基本碳骨架為C6?C3?C6，在植物中通常和糖結(jié)合形成苷類，是一種復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物［47］，此類物質(zhì)具有抗氧活性、抗病毒能力、抗血管硬化、免疫調(diào)節(jié)、降低血糖、防治腫瘤等藥理活性，甚至有些具備抗HIV 病毒的生理活性［48］。目前發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物已經(jīng)多達(dá)4 000種，是許多中草藥的活性成分［49］。

黃酮類化合物的生物合成途徑以苯丙氨酸為起點(diǎn)，特點(diǎn)是具有2 個(gè)苯環(huán)，由中央3 個(gè)碳原子相互連接生成二氫黃酮類具有C6?C3?C6結(jié)構(gòu)的基本骨架，通過(guò)分支途徑合成黃酮、花色素等。Zhang 等［50］以番茄作為底盤細(xì)胞構(gòu)建黃酮類化合物的異源合成途徑，將擬南芥中AtMYB12 等基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)，將黃酮醇等化合物的含量增加到100 mg／g。Li 等［51］以大腸桿菌為底盤細(xì)胞人為設(shè)計(jì)一條黃酮合成途徑，通過(guò)表達(dá)PAL、FNSI、4CL以及短SbF6H等不同物種的基因，使黃芩素、野黃芩素含量達(dá)到8.5、47.1 mg／L。通過(guò)對(duì)合成途徑進(jìn)行優(yōu)化，提高丙二酰輔酶A 的利用率，使黃芩素、野黃芩素含量增加到23.6、106.5 mg／L，為黃酮的生物合成提供新的方式。何江等［52］對(duì)新塔花中黃酮類化合物的代謝通路進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PAL、CHS、CHI、FNS這4 個(gè)基因在合成過(guò)程中起重要調(diào)控作用，為研究黃酮類化合物生物合成途徑中的其他酶基因奠定基礎(chǔ)。酶學(xué)研究方法和同位素原子示蹤法等科學(xué)方法的發(fā)展應(yīng)用將推動(dòng)黃酮類次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成途徑的解析、途徑酶以及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

5 展望

本文基于紫杉醇、丹參酮、黃酮等藥用活性成分生物合成途徑的闡明和基因的研究進(jìn)行綜述，發(fā)現(xiàn)通過(guò)底盤細(xì)胞構(gòu)建生物合成途徑能夠合成一些重要的中間代謝產(chǎn)物或前體物質(zhì)，使得藥用植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量都有不同程度的提高，體現(xiàn)出合成生物學(xué)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)。但是這些活性成分有著復(fù)雜的合成步驟，至今尚未完全解析。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，中藥活性成分的生物合成途徑、調(diào)控機(jī)制不斷被闡明，相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、P450 酶等基因元件的研究也在不斷深入，這將為藥用活性成分的細(xì)胞工廠生產(chǎn)提供新的策略和生物元件，對(duì)藥用活性成分的生物合成具有重大意義。藥用活性成分的生物合成在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)方面有很大上升空間。隨著分子生物學(xué)技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)等的發(fā)展，通過(guò)合成生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步挖掘中藥活性成分，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)藥用活性成分的大量合成，為傳統(tǒng)中藥注入新的活力，提升我國(guó)研發(fā)創(chuàng)新性藥物的能力和國(guó)際醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的核心競(jìng)爭(zhēng)力。