王丙雷,王 晶,劉 媛,陳少杰,顧文源,郭 禹,2,范京惠,2*,左玉柱,2* （.河北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,河北 保定 0700；2.河北省獸醫(yī)生物技術創(chuàng)新中心,河北 保定 0700；.邢臺市邢東新區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所,河北 邢臺 05400）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）也被稱為豬神秘病或藍耳病,該病是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起,以各年齡段豬表現(xiàn)呼吸道癥狀,妊娠母豬流產(chǎn)、死胎以及高病死率為主要特征[1-2]。PRRS最早于1987年發(fā)生于美國,并很快流行于歐洲和美洲[3]。直至2006年由變異毒株HP-PRRSV為病原引起的高致病性PRRS在我國南方暴發(fā),引起了人們的關注和重視,隨后在國內(nèi)出現(xiàn)了極易的類NADC30毒株[4]。高致病性毒株在全國范圍內(nèi)傳播,給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失,已成為養(yǎng)豬業(yè)中危害最為嚴重的疾病之一[5]。

PRRSV為動脈炎病毒屬的成員,單股、正鏈、不分節(jié)段RNA病毒,該病毒基因組長度約為15 kb,編碼9個開放閱讀框（ORF）:1a,1b,2a,2b,3～7[2]。由于依賴RNA的RNA聚合酶缺乏3′至5′核酸外切酶的校對能力,因此RNA病毒的突變率很高。PRRSV核苷酸取代的計算速率為每年（4.7～9.8）×10—2/位點,是報道的RNA病毒中最高的[6]。PRRSV的糖蛋白5（GP5）由開放閱讀框5（ORF5）編碼,包含多個中和表位,其編碼序列通常用于PRRSV分離株的系統(tǒng)發(fā)育分析和分類。通過嚴格的分子時鐘模型對分離毒株進行BEAST估計,得出ORF5的平均替代率為7.966×10—3,可信區(qū)間的95%為每年（6.943～9.031）×10—3替代/位點[6]。迄今為止,PRRSV已在全球范圍內(nèi)被識別,并分為2種不同類型:PRRSV-1（歐洲血統(tǒng),原型病毒Lelystad病毒,LV）和PRRSV-2（北美血統(tǒng),原型病毒,VR-2332）[7],這2個基因型共有50%～80%的氨基酸序列和55%～70%的核苷酸同一性[8]。根據(jù)ORF5序列間的遺傳關系,Ⅱ型PRRSV分為9個譜系,譜系1～譜系9（L1～L9）[9]。同樣,每種病毒亞型的菌株之間也存在廣泛的遺傳變異。這種變異意義重大,因為實驗室和現(xiàn)場研究支持以下論點:遺傳上不同的PRRSV變異體可能具有固有的毒力和臨床特性。由ORF5基因編碼的GP5蛋白作為主要的結構蛋白,其功能最復雜和最易變異,該蛋白在病毒附著和內(nèi)在化過程中發(fā)揮了重要作用[10-11]。因此,檢測ORF5基因的遺傳變異對PRRSV的流行病學研究具有重要意義。目前,PRRSV已被視為控制豬場疾病的主要問題之一,雖然商品化的疫苗可預防和控制PRRSV,但無法為豬群提供充足且有效的保護[12],且導致疫苗免疫失敗的重要因素是PRRSV的遺傳多樣性[11]。因此,對流行株的遺傳多樣性分析將有助于制定有效的預防和控制策略,本試驗為進一步了解在2016—2020年華北地區(qū)PRRSV的流行病學和遺傳特征,對測序得到的33條PRRSV ORF5基因開展遺傳進化及分子流行病學分析。

1 材料與方法

1.1樣品采集2016—2020年,在華北地區(qū)的不同豬場中采集到692份臨床組織樣本,—80℃保存。

1.2引物設計參考GenBank上登錄的PRRSV ORF5基因設計1對引物ORF5-F/R,引物由上海生工生物工程有限公司合成。ORF5-F:5′-AGGCTTGACCCTGCCTGCCTTGA-3′,ORF5-R:5′-GAATTCACAAGCAGTGCCGACTG-3′。

1.3病毒核酸的提取根據(jù)RNeasy Mini試劑盒說明書提取病毒總RNA,并通過反轉錄試劑盒PrimeScriptTM1st Strand c DNA Synthesis Kit進行反轉錄,以獲得cDNA,—80℃保存。

1.4PRRSV ORF5基因擴增以1.3中獲得的cDNA為模板,ORF5-F/R為引物對PRRSV陽性樣品進行PCR擴增,反應體系為20μL:10 mmol/L d NTP 3μL,10×PCR Buffer 2μL,Taq酶0.5μL,2μL cDNA,上、下游引物各1μL,10μL dd H2O。PCR反應程序:94℃5 min；94℃30 s,55℃30 s,72℃1 min,35個循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳,經(jīng)鑒定為陽性的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.5PRRSV ORF5基因遺傳進化分析在MEGA 7.0軟件中利用1 000個重復的最大復合似然和bootstrap置信度,通過鄰接連接構建系統(tǒng)發(fā)育樹。從GenBank下載篩選到的PRRSV毒株的參考序列。通過Meg Align對獲得的序列和71條ORF5參考序列進行核苷酸和氨基酸的同源性分析,探究核苷酸和氨基酸的變異模式。

1.6PRRSV GP5蛋白分析利用Net Nglyc 1.0 Server網(wǎng)站預測GP5蛋白中潛在的N-糖基化位點。

2 結果

2.1PRRSV ORF5基因的擴增通過RT-PCR檢測692份臨床樣品,結果共獲得368份陽性樣品,陽性率為53.18%。對2016—2020年在華北地區(qū)的368份PRRSV陽性樣本進行ORF5基因擴增,共有33份樣品擴增出了目的條帶,除HB-XT為600 bp外,其余均為603 bp（圖1）。測序獲得的33條PRRSV ORF5序列已上傳至GenBank。

圖1 部分PRRSV ORF5基因PCR鑒定結果

2.2ORF5基因遺傳進化分析為研究PRRSV的遺傳關系,本試驗利用MEGA 7.0軟件建立了ORF5基因遺傳進化樹（圖2）。根據(jù)建好的進化樹將104株（其中·代表分離的毒株）分為Ⅰ型和Ⅱ型,Ⅱ型又進一步分為9個譜系。本試驗中的9株屬于Lineage 8,其中包含高致病性代表性毒株JX-A1株和Hu N4株,以及疫苗株CH1-a和CH1-R,其余24株與美國JL580株和中國類NADC30株（CHsx1401）均屬于Lineage 1。然而,北美型VR-2332和活疫苗株MLV RespPRRSV屬于Lineage 5.1,野生型重組株GM2和QYYZ屬于Lineage 3,本研究中獲得的33株PRRSV均分布在Lineage 1和Lineage 8,據(jù)此推斷近2～3年PRRSV流行毒株以NADC30株Lineage 1為主。核苷酸和氨基酸同源性分析結果顯示,33株ORF5基因之間的核苷酸同源性為81.1%～99.8%,氨基酸同源性為80.1%～99.5%。氨基酸同源性分析發(fā)現(xiàn),Lineage 8中9株之間同源性為92%～98.5%,而與CH1a和JXA1同源性分別為90.9%～95.4%和94.2%～99.8%。Lineage 1中的24株之間的氨基酸同源性為85.6%～99.5%,與NADC30毒株的同源性為91.7%～95%,而與CHsx1401株和JL580株的氨基酸同源性略低于NADC30毒株,分別為89.4%～94.7%和90.5%～93.9%。

圖2 PRRSV ORF5基因遺傳進化樹分析

2.3GP5蛋白氨基酸序列分析本研究獲得的33條GP5蛋白氨基酸序列與參考序列比對（圖3）,結果顯 示,與 參 考 毒 株（VR-2332、JXA1、HUN4、NADC30）相比,在信號肽區(qū)域（1～31aa）、跨膜區(qū)（TM）發(fā)生了不同程度變異。而在13位氨基酸有2種突變,且均發(fā)生在亞組3中:R→Q和R→P,其中包含11個Q13R突變和5個P13R突變。作為另一個重要的突變位點,151位氨基酸在Lineage 1中除HB-HS株均有R151K突變,而Lineage 8中無該位點突變。位于B表位（中和表位）中的多個位點均發(fā)生了突變,Lineage1中的6株（HB-LF2、HB-XT 2019、HB-SJZ 2020、HB-LF 2019、HB-XT 2018和HB-ZJK）發(fā)現(xiàn)了N38H突變,此外,39位氨基酸僅在Lineage 8中發(fā)生了與JX-A1株相同的I39L突變。同時在A表位（誘騙表位）中發(fā)現(xiàn)Lineage 8中大多數(shù)出現(xiàn)了A27V突變；而在28、29和30位氨基酸僅有少數(shù)出現(xiàn)了突變,HB-ZJK發(fā)現(xiàn)了獨特的P28L突變；Lineage 8中HB-TS和HB-HS 2018株分別發(fā)現(xiàn)了D29V和A29V突變；HB-XT-2株出現(xiàn)了獨特的E30N突變,HB-XT和HB-SJZ-2 2018和HBHS 2020株出現(xiàn)了S30N突變。GP5第137位氨基酸被認為可以區(qū)分野毒株與疫苗株的鑒別位點[13]。33株PRRSV在137位氨基酸均為S,不同于VR2332株和MLV Resp PRRS株的突變A137S,說明分離到的毒株均為野毒株。在67～90,107～119和138～150位氨基酸區(qū)域相對保守。

圖3 PRRSV GP5氨基酸序列分析

2.4GP5蛋白糖基化位點分析通過Net Nglyc 1.0 Server網(wǎng)站預測并分析了GP5蛋白潛在的糖基化位點,結果顯示,本研究中33株GP5蛋白中預測到了7個N-糖基化位點,分別為N30,N32,N33,N34,N35,N44和N51。如表1中顯示,33株分別含有3～5個N-糖基化位點,且在7個位點中均有N44和N51位點。數(shù)量僅次于N44和N51位點的是N34和N30糖基化位點,分別有25個和23個位點。而Lineage 8中僅有1個N32位點,Lineage 1中有2個N32位點。就N33位點而言,Lineage 8和Lineage 1中分別有2個和17個位點。Lineage 1中的N-糖基化位點均無N35位點,Lineage 8中有6個N35位點。

表1 PRRSV GP5蛋白中的N-糖基化位點

續(xù)表1

3 討論

2006年在江蘇省暴發(fā)了HP-PRRS,并于2007年確認了高致病性變異毒株為引起該病的病原,隨后該病在國內(nèi)多呈現(xiàn)為地方性流,HP-PRRSV嚴重影響了中國養(yǎng)豬業(yè)[14]。先前的研究表明,HPPRRSV可能起源于中國經(jīng)典PRRSV（類似CH-1a）,并逐漸轉變?yōu)镠P-PRRSV毒株,在nsp2中不連續(xù)地缺失了30個氨基酸,導致了毀滅性病毒的產(chǎn)生。然而,后來的研究表明,這種獨特的缺失與PRRSV的毒力無關[15]。盡管針對HP-PRRSV的商業(yè)MLV疫苗（例如,JXA1-P80,TJMF-92,R98和Hu N4-F112）被廣泛使用,但是由于PRRSV基因組極易發(fā)生突變、重組和缺失等變異,引起抗原性發(fā)生改變,導致商品化疫苗的保護力下降,使得當前的控制策略未能提供可持續(xù)的疾病控制。同時,廣泛使用MLV疫苗可能會增加豬群的免疫選擇壓力,從而加速PRRSV的變異和進化[16-17]。2013年,類似NADC30的PRRSV毒株在中國出現(xiàn),這增加了PRRS在現(xiàn)場的復雜性。在隨后的1～2年中,中國報道了許多NADC30樣和中國HP-PRRSVs/VR-2332之間的重組菌株[16,18-19]。本實驗室在2016—2020年收集到692份臨床樣品通過RTPCR檢測,結果共獲得368份陽性樣品,陽性率為53.18%。PRRSV檢出率較高,防控力度需要加大。

本試驗共收集到華北地區(qū)368株PRRSV陽性樣品,并用特異引物擴增出了33條ORF5基因序列,經(jīng)進化樹分析得出33株均為北美型,其中9株分布在Lineage 8（包含HP-PRRSV株-JX-A1,Hu N4株）,24株分布在Lineage 1（包含NADC30株和類NADC30株）。同源性分析結果顯示,33株北美型之間的氨基酸序列同源性為80.1%～99.5%,與JX-A1株和NADC30株的同源性分別為81.1%～99.5%和85.6%～94.5%。這意味著華北地區(qū)流行的毒株為HP-PRRSV株和類NADC30株,且在華北地區(qū)以類NADC30毒株流行為主,但分布在Lineage 1的24株核苷酸與氨基酸的同源性差距較大,這提示華北地區(qū)類NADC30毒株一直處于進化狀態(tài),且更加復雜,與此同時防疫意識仍然需要高度警惕。此外,2018年之前流行的HPPRRSV正逐漸被流行的類NADC30毒株所取代,并發(fā)展成為優(yōu)勢毒株,外部環(huán)境的不同PRRSV不可控因素可以通過不同途徑侵襲豬場內(nèi)部,使得豬場內(nèi)部野毒株和變異毒株感染幾率的風險加大。

GP5蛋白由ORF5基因編碼,是PRRSV變異中最為明顯的結構蛋白,它包括3個區(qū)域:N端信號肽區(qū)域（signal peptide）、誘騙表位（Decoy）、中和表位（PNE）、2個高變區(qū)（HVRs）和3個跨膜區(qū)（TM）[20],其中抗原決定簇27VLVN30和37SHLQLIYNL45作為主要的誘騙表位和中和表位,具有很高的變異性并且在誘導免疫應答中發(fā)揮重要作用[21]。而且,在PNE中H38、I42、Y43和N44的殘基被認為是GP5的主要抗原識別位點,39～41位氨基酸可能有助于抗體結合。本試驗結果表明,33株中除了HB-XT株在AA33中具有特定的缺失,其他毒株均未發(fā)現(xiàn)缺失。GP5蛋白的13、151位氨基酸（NADC30株:13Q和151K,VR2332株:13R和151R,MLV Resp PRRSV株:13Q和151G）被認為是與PRRSV毒力相關的關鍵殘基。本試驗中只有Lineage 1中11株有Q13R突變且與本譜系JL580株和NADC30株、Lineage 5.1 MLV Resp PRRSV疫苗株相同,而在Lineage 8中的13位氨基酸與JX-A1和Hu N4株均為R。同時,Lineage 1中在151位氨基酸均發(fā)生了R151K,而Lineage 8中未發(fā)生突變,這些結果證明了在華北地區(qū)發(fā)生的PRRS中存在著高致病性毒株和類NADC30毒株的流行。同時,我們還發(fā)現(xiàn)在A表位中發(fā)生了A27V、P28L、D29V和E30N突變,B表位中的38、39和40位氨基酸均發(fā)生了突變,尤其在39位氨基酸發(fā)生突變的數(shù)量較多且具有與JX-A1和Hu N4相同的突變。因此,我們推測位于中和表位中氨基酸發(fā)生突變,導致抗原性改變,使用不同毒株疫苗對華北地區(qū)流行的毒株中和效果不一致,這可能是疫苗未能對宿主提供有效保護力的原因。

GP5蛋白通常具有許多潛在的N-糖基化位點,病毒N-糖基化在病毒的毒性和存活中起著至關重要的作用,因為它促進了正確的蛋白質折疊,這被認為與病毒敏感性和宿主的免疫反應有關,起到幫助病毒從疫苗誘導的免疫反應中逃逸的作用[22]。因此,確定具有保守基序6Asn-X-Ser/Thr（N-X-S/T）的潛在糖基化位點。有研究報道北美基因型GP5蛋白共有4個N-糖基化位點（N30、N34、N44和N51）,且位點的突變?nèi)菀捉档蚉RRSV中和抗體的水平進而增強了PRRSV宿主體內(nèi)的增殖。本研究對PRRSV GP5蛋白氨基酸全序列進行了糖基化位點的預測,分析了位于抗原表位中的N-糖基化位點。結果表明,33株PRRSV預測得到了7個N-糖基化位點,且不同株潛在的位點和數(shù)量均不同,分別含有3～5個位點。作為GP5蛋白的保守N-糖基化位點,在本試驗中的N44和N51位點沒有發(fā)生缺失和突變,這與之前的報道N44和N51位的糖基化信號高度保守相一致。然而,其余5個糖基化位點在不同位置均發(fā)生了突變,僅HB-XT在N33位點發(fā)生了缺失,但不同氨基酸位點的缺失對糖基化位點的預測影響不大。本試驗推測出的N-糖基化位點主要位于抗原表位中的糖基化位點,不同數(shù)量及位點可能會減弱中和抗體表位的免疫原性。這些結果提示,在華北地區(qū)PRRSV中,由于氨基酸的缺失和突變可能導致了抗原性改變,但其生物學功能仍需進一步研究,研究PRRSV GP5蛋白N-糖基化位點對病毒感染能力以及免疫原性具有重要意義。

類NADC30傳入我國數(shù)年間,因其較強的基因變異能力,加之與本土毒株的基因重組能力也較強,迅速發(fā)展成為我國豬場中的優(yōu)勢毒株,而商品化類的疫苗對其豬場的免疫保護能力總是不盡如人意,使得我國豬場對PRRSV防控難度增強。而試驗通過RT-PCR對2016—2020年收集的華北地區(qū)692份組織進行陽性樣品的篩選,并對ORF5基因進行擴增和測序。從遺傳進化分析、序列相似性分析、GP5蛋白氨基酸分析3個方面分析了華北地區(qū)PRRS遺傳特點和流行情況。根據(jù)遺傳進化和相似性分析表明本研究獲得的33株均為Ⅱ型。此外,根據(jù)GP5蛋白氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn),氨基酸位點突變導致毒力不同,可以得出在華北地區(qū)流行的毒株以類NADC30為主,同時還存在少數(shù)高致病性毒株的流行。本研究從分子水平分析了華北地區(qū)PRRSV的流行特征,這些結論有助于制定具有針對性的防控措施和進行新疫苗的研發(fā)。