王玉婷,張 成,柳 璇,高 娜,楊勇飛,李有文 （1.塔里木大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)南疆動(dòng)物疫病診斷與防控工程實(shí)驗(yàn)室,新疆 阿拉爾 843300）

1919年,MOHR[1]發(fā)現(xiàn)Notch基因的缺失會(huì)導(dǎo)致果蠅翅膀的邊緣有些缺刻（notches）,該基因被命名為“Notch”。1983年,ARTAVANIS-TSAKONAS等[2]成功克隆了Notch基因。該基因廣泛存在于脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中,在進(jìn)化上有高度保守性[3]。Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過“旁分泌”連接某個(gè)細(xì)胞與其鄰近細(xì)胞,從而控制心血管系統(tǒng)、動(dòng)物神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞等分化、增殖和凋亡事件[4-6]。與果蠅只攜帶1個(gè)Notch受體不同,在脊椎動(dòng)物中已經(jīng)鑒定出4個(gè)Notch旁系（包括Notch1,Notch 2,Notch 3,Notch 4）和5個(gè)Notch配體（即JAG1、JAG2、DLL1、DLL3和DLL4）[7]。有研 究 發(fā) 現(xiàn),Notch信號(hào)被激活的途徑包括細(xì)菌和病毒感染[8]。1991年,在人類的T淋巴母細(xì)胞白血病中首次鑒定到Notch基因,提示Notch基因與腫瘤存在關(guān)系[9]。后續(xù)越來(lái)越多的研究表明,Notch基因異常與惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),包括食管癌、胃癌、卵巢癌、結(jié)腸癌以及皮膚癌等有關(guān)[7],人類最早在染色體易位的T細(xì)胞急性淋巴白血病發(fā)現(xiàn)Notch1[10]。研究表明,Notch1基因與腫瘤發(fā)生有緊密的聯(lián)系,Notch1基因在參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用[7]。大部分研究指出這個(gè)基因在癌組織中主要位于胞漿或胞核中[11]。

本課題組前期在進(jìn)行羊痘病毒毒力因子KLP1的互作蛋白研究中,用酵母雙雜交的方法從羊皮膚細(xì)胞中篩選出與其互作蛋白之一是Notch1蛋白。KLP1是位于羊痘病毒基因組側(cè)翼區(qū)域基因編碼的蛋白,已有研究證實(shí)其是羊痘病毒的一個(gè)毒力因子。而Notch1蛋白是宿主細(xì)胞的一個(gè)跨膜蛋白,能夠定位于胞漿或胞核中,有非常重要的生物活性功能,可能參與細(xì)胞對(duì)病原的防御作用。為了更進(jìn)一步了解Notch1蛋白,同時(shí)為鑒定其與羊痘病毒KLP1互作的真實(shí)性和作用部位,本研究通過構(gòu)建與GFP標(biāo)簽融合表達(dá)的真核表達(dá)載體以及和GST標(biāo)簽融合的原核表達(dá)載體,分別表達(dá)Notch1蛋白與GFP和GST標(biāo)簽的融合表達(dá)蛋白,同時(shí)用Western blot和細(xì)胞定位技術(shù)研究其表達(dá)情況和細(xì)胞定位情況,為進(jìn)一步研究Notch1蛋白及其與羊痘病毒的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、菌株及質(zhì)粒羊皮的c DNA酵母文庫(kù)、大腸桿菌BL21、DH5α、BHK21細(xì)胞及pGEX-KG、p EGFP質(zhì)粒均保存于塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2主要試劑PCR Mix酶購(gòu)自莊盟生物科技公司；核酸染料Golden View購(gòu)自博邁德生物公司；DNA MarkerⅢ、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自北京天根生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；瓊脂糖凝膠電泳DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；HindⅢ、Bam HⅠ等限制性內(nèi)切酶與d NTP、PCR試劑均購(gòu)自賽默飛生物科技公司；T4連接酶及Buffer購(gòu)自Promega公司；Tris base、SDS、甘氨酸、瓊脂粉瓊脂糖購(gòu)自北京天根生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；30%丙烯酰胺購(gòu)自LABTIDE公司；Protein Marker購(gòu)自北京全式金公司；卡那霉素、氨芐青霉素購(gòu)于索萊寶公司；抗GST標(biāo)簽的一抗（鼠源單抗）、二抗（羊抗鼠IgG）購(gòu)于博士德生物公司。

1.3Notch1基因序列分析根據(jù)酵母雙雜交篩選所得羊痘病毒KLP1的互作蛋白Notch1的基因序列（部分）GenBank中Blast得到不同動(dòng)物的Notch1基因的序列19種（表1）,進(jìn)行同源性比較和遺傳進(jìn)化分析。

表1 不同物種Notch1基因（部分）信息

1.4特異引物設(shè)計(jì)依據(jù)酵母雙雜交篩選得到的Notch1基因的測(cè)序結(jié)果,用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)Notch1基因的特異性引物（表2）,為了后續(xù)構(gòu)建方便,5′端分別加入HindⅢ、Bam HⅠ酶切位點(diǎn),引物由上海生工公司合成。

表2 引物合成列表

1.52種表達(dá)載體的構(gòu)建

1.5.1目的基因的PCR擴(kuò)增 100μL PCR擴(kuò)增體系:5×buffer 20μL,PFU酶1.2μL,d NTP 4μL,模板（篩選得到的Notch1的羊皮膚酵母cDNA文庫(kù)）4.8μL,各自相對(duì)應(yīng)的上、下游引物各2.4μL,dd H2O 65.2μL；擴(kuò)增程序:95℃5 min；94℃30 s,52℃30 s,72℃60 s,35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定并切膠回收目的基因。

1.5.2連接、轉(zhuǎn)化 回收獲得的目的片段與p GEXKG、p EGFP載體分別使用限制性內(nèi)切酶HindⅢ、Bam HⅠ進(jìn)行雙酶切,然后用純化試劑盒對(duì)載體和目的片段全部進(jìn)行純化回收。目的片段與相應(yīng)的載體用T4連接酶連接,其產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,分別涂布含氨芐青霉素或卡那霉素（50 mg/L）的LB平板,37℃培養(yǎng)過夜后挑取單個(gè)菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定。

1.5.3質(zhì)粒鑒定 菌液PCR鑒定正確的克隆,其菌液使用OMEGA公司的質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒,進(jìn)行HindⅢ、Bam HⅠ雙酶切鑒定,并送交上海生工測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定,并于—20℃保存。

1.6原核表達(dá)及鑒定

1.6.1原核表達(dá) 經(jīng)鑒定陽(yáng)性的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞,挑取單菌落培養(yǎng),并用誘導(dǎo)劑1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)好的菌液離心去上清,沉淀加入100μL PBS懸浮,并加SDS緩沖液煮沸10 min,產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE。

1.6.2Western blot鑒定 融合表達(dá)的Notch1-GST融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE,用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,使用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h；再用1∶2 000的GST單抗孵育2 h；用TBST Buffer漂洗3次,15 min/次；再用二抗（羊抗鼠Ig G）孵育1 h；用TBST Buffer漂洗3次,15 min/次；用A/B顯色液顯色10 min,觀察結(jié)果。

1.7真核表達(dá)及細(xì)胞定位用10%FBS的DMEM培養(yǎng)基,于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)BHK21細(xì)胞并傳至6孔板中,待細(xì)胞長(zhǎng)滿85%左右,將構(gòu)建的融合表達(dá)GFP的Notch1真核表達(dá)載體用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞,轉(zhuǎn)染方法參考文獻(xiàn)[12],以GFP的空載體作為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染24 h后開始在熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白的表達(dá),并確定Notch1蛋白是否表達(dá)及在BHK 21細(xì)胞中的定位情況。

2 結(jié)果

2.1Notch1基因序列分析酵母雙雜交法篩選出的KLP1的互作蛋白Notch1的基因經(jīng)測(cè)序序列為780 bp,只是Notch1的一小部分序列,用該序列在GenBank的Blast中與19種動(dòng)物該部分序列相應(yīng)的基因序列進(jìn)行同源性比較,相互間同源性大于94.13%,說(shuō)明該基因在種間非常保守。用DNAstar軟件對(duì)其進(jìn)行遺傳進(jìn)化關(guān)系分析,發(fā)現(xiàn)其呈3個(gè)分支,其中非洲果蝠為單獨(dú)1支,牛羊豬等動(dòng)物為1分支,人、猿、猩猩和水生動(dòng)物為1支（圖1）。

圖1 19種動(dòng)物Notch1基因（部分）遺傳進(jìn)化樹分析

2.2Notch1基因PCR擴(kuò)增使用2對(duì)引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,之后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果顯示,在1號(hào)泳道的750～1 000 bp處有1條亮帶,約為780 bp,與理論大小相符（圖2）。

圖2 Notch1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3重組表達(dá)質(zhì)粒p GEX-KG-Notch1、p EGFPNotch1的鑒定 將2種重組載體構(gòu)建好后,分別進(jìn)行HindⅢ、Bam HⅠ雙酶切后,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定,1號(hào)泳道為重組質(zhì)粒,2號(hào)泳道為重組質(zhì)粒酶切后結(jié)果,在750～1 000 bp之間有1條帶,與已知目的780 bp基因大小相符,可知載體構(gòu)建成功（圖3）。

圖3 重組質(zhì)粒酶切鑒定圖

2.4Notch1基因的原核表達(dá)及鑒定構(gòu)建原核載體后進(jìn)行大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳檢測(cè),2號(hào)泳道中在55～70 k Da處有一表達(dá)量明顯多于1號(hào)對(duì)照泳道的條帶（圖4）。對(duì)蛋白電泳的結(jié)果進(jìn)行檢測(cè),在1號(hào)泳道56 k Da處可見1條與質(zhì)粒對(duì)照不同表達(dá)量的條帶,與蛋白電泳圖的目的蛋白條帶在同一位置（圖5）。

圖4 Notch1蛋白原核表達(dá)檢測(cè)

圖5 Notch1蛋白表達(dá)的Western blot鑒定

2.5Notch1蛋白的亞細(xì)胞定位GFP及提取的重組真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到BHK21細(xì)胞中培養(yǎng)24～36 h,與陰性對(duì)照對(duì)比可發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒的細(xì)胞有部分細(xì)胞有熒光反應(yīng),熒光物質(zhì)大部位于細(xì)胞質(zhì),則GFP蛋白位于胞質(zhì)部位的多,轉(zhuǎn)染GFP-Notch1蛋白的部分細(xì)胞有熒光反應(yīng),熒光物質(zhì)大部位于胞核,則重組質(zhì)粒蛋白大部位于胞核,通過對(duì)比可知GFPNotch1蛋白主要位于胞核（圖6）。

圖6 Notch1蛋白的亞細(xì)胞定位（20×）

3 討論

據(jù)報(bào)道,腫瘤的發(fā)生是癌基因激活和抑癌基因失活所致[7],也有研究觀點(diǎn)認(rèn)為,細(xì)胞癌變是由于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異常,細(xì)胞接受了異常增殖、分化等信號(hào)所致[3]。Notch1信號(hào)通路作為一種進(jìn)化保守的細(xì)胞間相互作用機(jī)制,在細(xì)胞的發(fā)育、增殖、分化、生存和凋亡中起著十分重要的作用[5],近年來(lái)成為多個(gè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

Notch蛋白是由其基因編碼的單鏈跨膜受體蛋白,其基本結(jié)構(gòu)分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。脊椎動(dòng)物中共發(fā)現(xiàn)了4個(gè)Notch同源體,分別編碼4種Notch受體（Notch1～Notch4）。Notch受體胞內(nèi)區(qū)含有RAM結(jié)構(gòu)域、6個(gè)錨蛋白重復(fù)序列、2個(gè)核定位信號(hào)區(qū)、1個(gè)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域以及1個(gè)PEST序列[6]。胞內(nèi)區(qū)是Notch受體蛋白的活性形式,其中RAM結(jié)構(gòu)域是C啟動(dòng)子結(jié)合因子-1/重組信號(hào)結(jié)合蛋白-Jκ的主要結(jié)合部位,CBF1是存在于人或哺乳動(dòng)物中的Su（H）蛋白的同源蛋白,也能與錨蛋白重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域相互作用；ANK重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域是Deltex、Mastermind等的結(jié)合部位,這些蛋白對(duì)Notch信號(hào)通路有調(diào)節(jié)作用；PEST結(jié)構(gòu)域則與Notch受體蛋白的降解有關(guān)。

本研究中Notch1是通過酵母雙雜交方法從感染感染羊痘病毒的羊皮膚細(xì)胞中篩選出的羊痘病毒毒力因子KLP1的互作蛋白。從羊皮膚酵母文庫(kù)只得到Notch1基因的部分序列,約780 bp,位于Notch1全基因的5 130～5 910位,編碼1 710～1 940之間的氨基酸,剛好是Notch1基因跨膜區(qū)與胞內(nèi)區(qū)的部分。據(jù)報(bào)道,Notch蛋白會(huì)被Kuzbanian酶在其異二聚體的胞外近膜區(qū)1 710位丙氨酸～1 711位纈氨酸殘基之間的位點(diǎn)進(jìn)行切割[13],Notch被裂解為2個(gè)片段,即胞外區(qū)（NECD）和跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)（NTMIC）,N端裂解產(chǎn)物（NECD）被配體表達(dá)細(xì)胞吞噬,而C端裂解產(chǎn)物進(jìn)一步在跨膜區(qū)接受其第2次切割。本次切割位點(diǎn)為1 743位甘氨酸殘基～1 744位纈氨酸殘基之間,酶切釋放出Notch蛋白的活化形式-胞內(nèi)區(qū)（NICD）[13]。NICD從細(xì)胞漿直接進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),與DNA結(jié)合蛋白CSL結(jié)合,將原來(lái)的轉(zhuǎn)錄抑制因子CSL轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)錄激活因子,激活CSL下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[3]。由此可見本次篩選得到的是Notch1基因的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的N端部分。對(duì)得到的Notch基因進(jìn)行同源性和遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)不同動(dòng)物間該基因的同源性在95.13%以上,可見是一個(gè)非常保守的基因,也說(shuō)明其在細(xì)胞分化代謝中的作用的重要性。從遺傳進(jìn)化關(guān)系上看,不同動(dòng)物的該基因分為3個(gè)分支,分別為北非果蝠為1個(gè)分支,親緣關(guān)系上較其他哺乳動(dòng)物較遠(yuǎn),牛、羊、豬、駱駝和白鯨等聚于1個(gè)分支；人及靈長(zhǎng)類動(dòng)物家貓、豹、大熊貓和海狗等聚于1個(gè)分支,親緣關(guān)系相對(duì)較近。這一結(jié)果與目前認(rèn)識(shí)的動(dòng)物進(jìn)化關(guān)系也較相符。

KLP1是位于羊痘病毒基因組側(cè)翼區(qū)域的019基因編碼的蛋白,已有研究證明缺失了KLP1的羊痘病毒的毒性大副降低,說(shuō)明其確實(shí)是一個(gè)毒力因子。雖然這2個(gè)蛋白相互作用的機(jī)制及其生物學(xué)功能目前還不清楚,但作為病毒的一個(gè)毒力因子與宿主細(xì)胞的蛋白發(fā)生相互作用是非常有可能的。因?yàn)镹otch1蛋白是一個(gè)跨膜蛋白,其膜內(nèi)區(qū)是非常重要的活性區(qū),且其上有2個(gè)細(xì)胞核定位區(qū),而本次篩選得到的也只是Notch1蛋白的跨膜區(qū)和靠近膜的胞內(nèi)區(qū)部分,根據(jù)本試驗(yàn)對(duì)其定位的結(jié)果推測(cè),該片段正是Notch1基因的膜內(nèi)區(qū),且至少是一個(gè)核定位區(qū),因?yàn)榕c綠色熒光蛋白GFP的空載體相比,Notch1與GFP融合表達(dá)的蛋白被明顯的定位到細(xì)胞核中,這個(gè)結(jié)果也與盧沐[14]、薛亞軍等[15]和魯照明等[16]的研究結(jié)果一致:他們構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1（＋）-Notch1-GFP轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞之后,與食管癌有關(guān)的EC9706、Eca109細(xì)胞,于低倍鏡下也可見大片視野激發(fā)綠色熒光的細(xì)胞,在胞核處可見更明亮的綠色激發(fā)光,高倍鏡可見綠色熒光主要在胞核部分表達(dá)。

本研究還對(duì)Notch1基因做了與GST標(biāo)簽融合的原核表達(dá),結(jié)果可見能較好地表達(dá),這為進(jìn)一步驗(yàn)證Notch1與KLP1蛋白相互作用和生物功能奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ),也可以為羊痘預(yù)防等相關(guān)研究從分子水平提供理論依據(jù)。