申奔龍，薛寶寶，孟德龍，沈和定

(上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，海洋動物系統(tǒng)分類與進化上海高校重點實驗室，上海 201306)

縊蟶()是中國四大海水養(yǎng)殖貝類之一，養(yǎng)殖歷史悠久、分布廣泛，因其肉多殼薄、味道鮮美、營養(yǎng)豐富、醫(yī)用價值等優(yōu)點深受沿海居民的喜愛。

因近年來全球氣候變暖且未來還將持續(xù)，這對海洋無脊椎動物尤其是潮間帶灘涂貝類的生長、發(fā)育、免疫、生存等帶來不同程度的影響。如櫛孔扇貝()在高溫下導(dǎo)致生理代謝失常、抗逆力下降，其免疫系統(tǒng)更易受病原的侵襲，最終導(dǎo)致大規(guī)?；疾『退劳觥Ｔ诩毙詼囟却碳は?，紫貽貝()與翡翠貽貝()的耗氧率和排氨率均隨溫度升高而升高，這也與縊蟶的表現(xiàn)相似。在高溫條件下還會導(dǎo)致部分雙殼貝類產(chǎn)生強烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)，自由基活性氧(ROS)水平上升，機體過氧化損傷加劇，影響正常的新陳代謝及功能的維持，從而導(dǎo)致其體質(zhì)活力下降及抗逆性降低。為使體內(nèi)的ROS保持在正常水平，生物必須及時清除過量的ROS。還原性谷胱甘肽(GSH)和過氧化物酶(POD)就是ROS清除系統(tǒng)中的重要成員，具有清除氧自由基、維持細(xì)胞膜完整性及DNA合成等多種生物功能，是衡量機體抗氧化能力的重要因素。

縊蟶作為中國一種重要的海水灘涂養(yǎng)殖貝類，2019年產(chǎn)量869 251 t，在養(yǎng)殖過程中同樣會受到夏季高溫的制約。尤其是在夏季退潮后，沿海灘涂養(yǎng)殖區(qū)或河口存有少量海水的情況下，縊蟶會被暴曬后沿著出入水口進入蟶穴的海水燙傷或燙死。為提高縊蟶的抗逆性，迫切需要開展縊蟶耐高溫性狀新品系的選育工作。

家系選育是選擇育種中一種重要手段，近年來，已有對貝類的抗逆性、生長等性狀選育的報道，如在生長方面，Evams等通過家系選育對4種不同養(yǎng)殖環(huán)境下的長牡蠣的平均體重、存活率和產(chǎn)量等指標(biāo)進行了篩選；閆喜武等通過建立家系對菲律賓蛤仔()的卵徑、受精率、孵化率及生長、存活和變態(tài)的相關(guān)指標(biāo)進行了分析，為其后續(xù)挑選生長優(yōu)良品種提供了理論支持。在抗逆性方面，劉項峰等驗證了蝦夷扇貝()的高溫耐受性可以通過表型進行選育；王慶志等發(fā)現(xiàn)，早期篩選的蝦夷扇貝耐高溫家系的成活率明顯高于普通家系。

同時，利用家系選育已獲得了不少貝類新品系，如中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所培育的馬氏珠母貝()南珍1號，中國海洋大學(xué)研究團隊培育的長牡蠣()海大2號，遼寧省海洋水產(chǎn)研究所選育的蝦夷扇貝明月貝等。本研究是在本實驗室經(jīng)5代連續(xù)選育得到的縊蟶快長新品種申浙1號的基礎(chǔ)上，繼續(xù)進行耐高溫抗逆性狀的家系選育，通過監(jiān)測各家系生長數(shù)據(jù)、分析特定家系的耐熱性及抗氧化能力等情況，為種質(zhì)改良、培育出生長快、耐高溫的縊蟶新品系奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

從浙江省三門縣水產(chǎn)養(yǎng)殖基地采集性腺成熟的一齡縊蟶新品種申浙 1 號，并在浙江省三門縣東航水產(chǎn)育苗科技公司進行暫養(yǎng)。

半致死溫度的測定、控溫裝置由若干500 W 石英加熱管、1 000 W 電子繼電器、40 L泡沫保溫箱、水銀觸點溫度計(0.1 ℃)、500 mL燒杯以及氣管氣石等組成，所有溫度計均經(jīng)過嚴(yán)格的校準(zhǔn)后使用，整套裝置控溫精度0.1 ℃。

1.2 方法

1.2.1 親貝的篩選與暫養(yǎng)

選擇活動力強、性腺飽滿、表面無損傷、大小相似的新品種縊蟶申浙1號300枚暫養(yǎng)在水泥池，池底鋪設(shè)30 cm 左右泥沙，砂濾海水，海水比重在1.009～1.016，pH為7.8，海水溫度在28～33 ℃。暫養(yǎng)期間，池壁氣管持續(xù)微充氣。為保證水中餌料充足，定時投喂牟氏角毛藻()、亞心型扁藻()等混合單細(xì)胞藻類和蝦塘水。每2 d全換水一次。

1.2.2 家系建立

2019年9月，親貝性腺基本成熟，從暫養(yǎng)池中挖出經(jīng)簡單清洗后，陰干刺激12 h再放入遮光曝氣的水中3 h后，開始觀察到親貝出水管產(chǎn)卵排精。將正在排精(霧狀)的雄性和正在產(chǎn)卵(顆粒狀)的雌性挑出來，用干凈的沙濾海水清洗后分別放入盛有新鮮海水的2 L燒杯中，海水比重1.009。最終選取雌雄各16枚，建立了16個全同胞家系。將排好的精卵倒入盛有沙濾海水的50 L白色塑料桶中均勻攪拌，充氣孵化。精卵結(jié)合后進行卵裂，首先發(fā)育為擔(dān)輪幼蟲，約18 h后發(fā)育成“D”形幼蟲。整個操作過程中各實驗組嚴(yán)格隔離，不受外來精卵干擾。

1.2.3 室內(nèi)幼蟲培養(yǎng)

浮游幼蟲培育。受精卵孵化18 h后，用300目尼龍網(wǎng)袋過濾出“D”形幼蟲，目的是將死卵剔除。幼蟲培育在50 L白桶中進行。2 d后全換水1次。在第一次換水過程中會對幼蟲密度進行調(diào)整，以消除養(yǎng)殖密度對生長速度的影響，使每個家系保持一致，調(diào)整密度為8～10 mL。第2、3日投喂湛江等邊金藻()，每天投喂3次，第4日開始投喂湛江等鞭金藻和牟氏角毛藻，投喂量視幼蟲攝食情況而定。為防止換水過程中各家系間出現(xiàn)混雜，換水工具單獨使用。浮游期海水比重初始為1.009，后幾日比重由1.009逐漸降至1.006。pH為7.8，水溫在28～30 ℃。

稚貝室內(nèi)培育。幼蟲在第8天培育后基本變態(tài)為可附著生長的匍匐幼蟲。在附著前兩日往桶中投放適量的50目篩網(wǎng)過濾的無菌泥土。每5 d全換水一次，主要投喂牟氏角毛藻和蝦塘水，每天兩次。海水比重1.006，pH為7.8，水溫在26～28 ℃。其他操作同前。

1.2.4 半致死溫度

幼蟲培育到稚貝期后，從3個殼長最長的家系和3個殼長最短的家系中隨機挑選180只稚貝，再隨機分為6組，分別放入一個常溫實驗組(室溫約26～28 ℃)和5個高溫實驗組中(30、32、34、36、37 ℃)。為盡量避免快速升溫對稚貝造成的影響，各高溫組先后以每2 h升高1 ℃的速率緩慢升溫，使各高溫組同時達到預(yù)定溫度，定期觀察并記錄各組稚貝死亡數(shù)，死亡的判定標(biāo)準(zhǔn)為兩殼張開，外套膜無收縮能力。至所有組合不再出現(xiàn)死亡時實驗結(jié)束。餌料經(jīng)加溫后再投喂，每天換水1/2，其他同前。實驗持續(xù)8 d。設(shè)3組重復(fù)。溫度設(shè)計參考文獻[18]。

1.2.5 抗氧化能力測定

耐高溫實驗在加溫前以及加溫第1、3、7天每個溫度下的每個家系隨機挑取6只活力良好的縊蟶放入1.5 mL凍存管并立即放入液氮中冷凍，放入-80 ℃冰箱長期保存。實驗時，首先稱量算出凈重，按質(zhì)量體積比1∶9加入0.9 %的生理鹽水并用勻漿機冰浴研磨。將研磨好的組織液放入低溫離心機中，2 500×離心10 min，取上清液用于總蛋白(total protein，TP)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、過氧化物酶(peroxidase，POD)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)的測定。測定使用南京建成公司試劑盒，測定原理、實驗步驟和計算方法均參照試劑盒說明書。

1.2.6 指標(biāo)測定與數(shù)據(jù)分析

測量各家系縊蟶幼蟲殼長。浮游期幼蟲(殼長<300 μm)在顯微鏡下用目微尺(100×)測量，300 μm≤殼長<3.00 mm 的稚貝測量在體視顯微鏡下用目微尺(25×)進行，殼長>3.00 mm的幼貝用游標(biāo)卡尺測量。每個家系用相同方法重復(fù)測量3次，每組隨機測定30只幼蟲。

真正存活率()=實驗結(jié)束時存活數(shù)/實驗開始總數(shù)；相對存活率()=真正存活率/對照組存活率。

使用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件及Excel 2016對文章數(shù)據(jù)進行分析處理，采用單因素方差(ANOVA)分析不同家系間的數(shù)據(jù)，溫度效應(yīng)間的顯著性差異采用Duncan多重法比較，差異顯著性水平設(shè)置為<0.05。使用Logistic模型確定半致死溫度。GraphPad Prism 8.02、Excel 2016作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 浮游期和稚貝期生長

實驗共建立了16組全同胞家系(編號1-16)，每組分別選取雌雄各1枚，共32枚親本。家系1、2、9因浮游期成活率太低被淘汰。

浮游期第二日齡的殼長除家系8最長外，其他組合無顯著差異(<0.05)。浮游期結(jié)束時，家系1、2、9因成活率太低被剔除。其中家系6、8、10、12、14、15、16殼長和殼高顯著大于其他家系，其中家系14最大。稚貝期結(jié)束時，家系3、4、5的殼長顯著低于其他家系。家系8、14、15、16的殼長和殼高顯著大于其他家系(<0.05)(表1)。

表1 縊蟶不同家系在浮游期和稚貝期的殼長和殼高

2.2 稚貝期存活率

家系6、14在稚貝期的成活率顯著高于其他家系，其中家系14的成活率最高，達到83.17%±0.85%，家系7的成活率最低，僅54.00%±2.64%(圖1)。

不同處理間沒有相同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 半致死溫度

在6個實驗家系中，家系16的半致死溫度最高，達到了36.64 ℃。家系3、4、5、14、15的半致死溫度分別為34.79、34.71、34.23、36.55、35.73 ℃，殼長較長的家系與殼長較短的家系半致死溫度差異顯著(<0.05)(圖2)。

殼長較短的家系編號為3、4、5，殼長較長的家系編號為14、15、16。

2.4 抗氧化能力測定

2.4.1 POD活性測定

實驗組溫度為30、32、34 ℃時，各家系POD活性隨溫度增高而增高，但之后開始下降，37 ℃時活性反而低于常溫狀態(tài)下的活性；隨著高溫的持續(xù)刺激，各家系1、3、7天的活性有一個緩慢下降的趨勢。從3組殼長家系(家系14、家系15、家系16)與殼短家系(家系3、家系4、家系5)來比較，殼長各家系在32、34、36 ℃下的平均酶活性顯著高于殼短家系的(<0.05)(圖3)。

橫坐標(biāo)代表每個家系分別在0、1、3、7天不同溫度下取樣。數(shù)據(jù)以蛋白質(zhì)質(zhì)量計。下同。

2.4.2 GSH含量測定

GSH含量顯示，各家系GSH的含量隨溫度升高而逐漸升高，并在37 ℃時達到最高。從三組殼長家系與殼短家系來比較，36、37 ℃下殼長各家系的GSH平均值顯著高于殼短家系(<0.05)(圖4)。

圖4 溫度對縊蟶家系還原性谷胱甘肽含量的影響

2.4.3 T-AOC測定

T-AOC趨勢與POD活性趨勢相似，同樣是在34 ℃時達到最高，并且各家系在1、3、7天的T-AOC值有一個緩慢下降的趨勢。但在36、37 ℃時T-AOC急劇降低且低于常溫對照組。三組殼長家系在34 ℃時的平均T-AOC顯著高于殼短家系(<0.05)(圖5)。

圖5 溫度對縊蟶家系總抗氧化酶的影響

3 討論

3.1 各家系選育指標(biāo)分析

家系選育是指以家系為單位進行的選擇育種，其中水產(chǎn)生物通過對高表型值親本的選擇和選配可獲得較好的選育效果，在魚類、甲殼動物上均有報道。應(yīng)用家系選育技術(shù)在貝類上的報道主要集中在提高貝類的生長速率、抗逆性等方面。本研究采用家系選育的方法來挑選耐高溫家系后代。采用快長新品種申浙1號為基礎(chǔ)群體，先期對親貝篩選后，利用家系選育技術(shù)構(gòu)建家系，測量各家系的生長數(shù)據(jù)。

在實驗過程中家系1、2、9初期因死亡率較高已挑除外，家系6、14在稚貝期的成活率顯著高于其他家系(<0.05)。稚貝室內(nèi)培育期結(jié)束時，家系3、4、5殼長顯著低于其他家系(<0.05)；家系8、14、15、16殼長顯著高于其他家系(<0.05)，其中家系14最大，殼長和殼高分別為(7.04±0.72)mm，(2.83±0.29)mm。

選擇殼長最長(家系14、家系15、家系16)和最短(家系5、家系3、家系4)的各3組家系進行半致死溫度測定以確定殼長是否與溫度耐受性相關(guān)。實驗結(jié)果表明，三組殼長較長的家系半致死溫度與三組較短的家系差異顯著(<0.05)，即殼長較長的個體對溫度的耐受性要強于殼長較短的，由此推斷個頭較大的個體耐受性較好，這與劉志剛等對墨西哥灣扇貝()高溫的耐受性的研究相似，不同規(guī)格貝對高溫的耐受性為中貝=小貝>稚貝。同時，各家系對高溫的耐受性可能不僅限于個體大小，同時還可能會受各家系的耐熱基因型和遺傳力的影響，如劉項峰等和王慶志等證實了蝦夷扇貝在耐熱性上遺傳力的表現(xiàn)，同時還證明了早期篩選對養(yǎng)成階段的重要性。該實驗進程中保證了各家系培育條件相同：適宜的溫度、新鮮且充足的餌料、氧氣以及沙濾海水等，盡可能為各家系能充分展現(xiàn)其生長性能，避免外部環(huán)境等客觀因素干擾提供了條件。

3.2 抗氧化能力分析

海洋貝類的研究表明，提高環(huán)境溫度會顯著影響海洋雙殼貝類機體生理化過程，進而影響呼吸率、食物攝取、消化吸收速率以及排泄率等。Abele等對海洋貝類細(xì)胞水平研究表明，海水溫度升高時會導(dǎo)致細(xì)胞代謝率上升，ROS水平上升，DNA、蛋白及脂質(zhì)大分子的過氧化損傷加劇，細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡。以上研究表明，環(huán)境溫度的提升會導(dǎo)致機體氧化損傷加劇，影響其抗氧化能力，還會使機體代謝率上升。

在對縊蟶各家系的耐熱實驗中，在非致死高溫(30～34 ℃)刺激下，縊蟶各家系的總抗氧化能力與POD活性上升，而當(dāng)在更高的溫度(36～37 ℃)持續(xù)刺激下，其抗氧化能力下降甚至達不到常溫水平。這表明機體在耐受范圍內(nèi)可將體內(nèi)ROS維持在正常水平，而一旦超過其耐受極限就會導(dǎo)致穩(wěn)態(tài)失衡、抗性下降。這與Gueera等對大肚海扇貝()的研究結(jié)果相似，過高的溫度反而會導(dǎo)致貝的代謝率由升高轉(zhuǎn)為下降；當(dāng)高溫脅迫后的櫛孔扇貝死亡率達到62%時，其外套膜、鰓和腎臟的抗氧化酶基因、的表達水平對比常溫對照組顯著下降，這也與本文的結(jié)果相似。GSH含量在各家系均呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，作為一種清除ROS的重要底物，其通過還原活性氧來保護細(xì)胞，機體為努力維持過氧化物和自由基的平衡而不斷的產(chǎn)生GSH。

橫向比較來看，殼長較長組與較短組的差異明顯，直觀表現(xiàn)為各家系的存活情況也就是半致死溫度的差異，內(nèi)在表現(xiàn)為三種抗氧化指標(biāo)的變化。在受到高溫持續(xù)刺激且超過機體耐受范圍情況下，抗氧化能力會受到顯著影響，機體無法維持正常的新陳代謝，組織氧化損傷急劇上升，甚至造成個體死亡?？v向來看，各家系在同一溫度持續(xù)刺激下，第1、3、7天的抗氧化能力基本呈現(xiàn)小幅下降趨勢，推測縊蟶體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)即使在非致死高溫環(huán)境下也難以長時間維持最初的水平。

與正常溫度相比，高溫脅迫下各家系個體的抗氧化能力受到顯著影響，且殼長較長的縊蟶個體的綜合體質(zhì)狀態(tài)及抗逆性明顯好于較短的。因此，本研究推測夏季高溫期，縊蟶自身體質(zhì)及抗性的下降是誘發(fā)其死亡的根本原因。在實際生產(chǎn)中，廣東、福建等地由于縊蟶性腺成熟較早，8月份就會有工廠開始縊蟶育種，此時應(yīng)注意將水溫控制在幼蟲適宜的范圍內(nèi)。同時幼蟲在轉(zhuǎn)移至土池中間暫養(yǎng)后也應(yīng)注意大潮換水時存蓄的少量海水的溫度，避免暴曬太久而使水溫過高。

采用新品種申浙1號構(gòu)建家系并評估子一代的殼長、存活率和耐熱性等差異，在保留快長的基礎(chǔ)上，利用家系選育和高溫實驗挑選具有抗逆性的耐高溫后代，并通過抗氧化能力的測定在生理生化的角度證明了家系挑選的必要性。其中家系14生長最快、存活率高且耐熱性較好，最終確定家系14是適合生產(chǎn)的最優(yōu)家系，家系15、16可用作備選家系。同時為后續(xù)縊蟶抗逆性新品系的篩選提供了理論依據(jù)。