翁 鈺，王 琴，趙玉芬，于 凱，郝紹瑜，于泊洋，杜晨光，蘇布登格日勒，李海軍

(1.內蒙古農業(yè)大學獸醫(yī)學院，呼和浩特 010018；2.內蒙古自治區(qū)基礎獸醫(yī)學重點實驗室，呼和浩特 010018；3.內蒙古醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，呼和浩特 010110)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種高度異質性疾病，也是育齡女性最常見的一種生殖內分泌紊亂性疾病。PCOS被定義為卵巢功能異常綜合征，其最顯著的臨床表現為卵泡發(fā)育障礙、稀發(fā)排卵或不排卵、高雄激素表現和卵巢多囊性改變[1]，同時也與肥胖、2型糖尿病和心血管疾病患病風險的增加密切相關[2]。PCOS造成的排卵障礙機制一直是生殖醫(yī)學的研究熱點之一。盡管PCOS病因迄今仍沒有完全闡明，但是當前理論公認，雄激素異常升高是PCOS病理診斷中最為恒定的特征，也是造成患者卵泡發(fā)育阻滯的核心因素[3-4]。值得注意的是，雄激素對于正常卵巢卵泡發(fā)育也至關重要。研究表明，睪酮可通過刺激卵泡刺激素受體表達及提高顆粒細胞對卵泡刺激素的敏感性，成為發(fā)情周期中正常卵泡募集與優(yōu)勢卵泡選擇發(fā)生的一種關鍵性調控因素[5]。在此過程中，睪酮作為底物，可被芳香化酶催化為雌二醇[6]，后者不僅通過刺激卵泡顆粒細胞與膜細胞的增殖分化，參與對正常卵泡發(fā)育的調控過程，而且優(yōu)勢卵泡合成大量雌二醇也是誘導排卵前促黃體生成素峰出現與排卵發(fā)生的必要前提[7]。臨床研究發(fā)現，PCOS患者血清睪酮水平顯著高于常人，且伴隨著雌二醇水平的顯著下降與排卵失敗[8-9]。因此，從性激素在PCOS發(fā)生過程中的階段性變化入手展開研究，可能是探明其發(fā)病機理的一個新思路。

構建小鼠疾病模型是研究PCOS發(fā)病機制的較佳方式[10]。在眾多建模方式中，脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)最為常用，其作為合成雄激素的前體物質，通過向未性成熟雌鼠長期注射可模擬生成大量的囊性卵泡及造成較高的血清雄激素水平，進而產生PCOS樣小鼠模型[11]。在建模過程中，DHEA常溶解在200 μL油性溶劑中，但對于長時間小鼠皮下注射而言，這種溶解方式可能會出現短時間內藥物溶解不完全或因注射體積過大而易造成藥物外滲與小鼠應激的情況。因此，本研究對現有DHEA建模方式稍作改進，將DHEA(6 mg/100 g)溶解在0.09 mL芝麻油與0.01 mL 95%乙醇混合的溶劑中，嘗試構建3周齡昆明白小鼠的PCOS模型，并對該PCOS模型構建過程中的血清雌二醇和睪酮瞬時水平進行測定，以期從性激素相應變化角度來重新審視PCOS發(fā)病過程。

1 材料與方法

1.1 材料

使用90只3周齡SPF級昆明白小鼠進行建模，在12/12 h循環(huán)的光照條件下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)過程遵循內蒙古農業(yè)大學生物醫(yī)學科研倫理要求(批準編號：NND2021025)。

1.2 主要試劑及儀器

DHEA購自源葉生物公司；結晶紫粉末和多聚甲醛粉末均購自Sigma-Aldrich公司；睪酮ELISA試劑盒購自Cayman Chemical公司；雌二醇ELISA試劑盒購自Enzo公司；其他常用試劑均為國產或進口分析純商品。

Nikon YS100成像系統(tǒng)購自Nikon公司；CM1900型石蠟切片機購自Leica公司；CYT-100多功能酶標儀購自GE Healthcare公司。

1.3 方法

1.3.1 PCOS模型構建 90只昆明白小鼠被隨機均分為3組：對照組、空載組(Vehicle)與DHEA組(DHEA)，對照組注射0.1 mL的生理鹽水；空載組僅注射0.09 mL芝麻油與0.01 mL 95%乙醇的混合溶劑；處理組按體重計算所需注射的DHEA劑量，并將其溶解于等體積的芝麻油+95%乙醇混合的溶劑中。所有組別均連續(xù)皮下給藥20 d。注射后使用75%酒精進行皮膚表面的消毒，隨后放回到籠中，自由活動和采食。建模過程中的昆明白小鼠體重增量數據來自于建模第20與0天的差值(n=9)。

1.3.2 性周期鑒定 DHEA連續(xù)注射20 d后，于每天上午11:00-12:00使用20～50 μL生理鹽水對昆明白小鼠的陰道進行沖洗并收集陰道上皮細胞，共持續(xù)8 d。將陰道上皮細胞涂抹在防脫載玻片上用95%乙醇固定10 min，使用0.1%結晶紫染色1 min。待玻片自然風干后，使用Nikon YS100成像系統(tǒng)進行掃描。根據陰道上皮細胞種類(是否角質化)、白細胞占比(主要為淋巴細胞)評估昆明白小鼠所處的性周期階段[12]。

1.3.3 HE染色 使用4%多聚甲醛固定24 h后，自來水沖洗過夜。經乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋與切片等處理，獲取厚度為5 μm的組織切片。利用HE染色對卵巢組織學結構進行觀察，并對昆明白小鼠卵巢是否產生PCOS樣癥狀加以鑒定。

1.3.4 ELISA測定血清睪酮和雌二醇濃度 經眼球采血收集昆明白小鼠血液于非抗凝管中，室溫放置2 h，4 ℃過夜。4 ℃、3 000 r/min多次離心分離血清，隨后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

血清睪酮和雌二醇濃度的測定參照試劑盒說明書進行。使用多功能酶標儀分別在412和405 nm波長下檢測睪酮和雌二醇樣本D值。以標準物濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標建立標準曲線，分別代入待測樣本D值以計算對應濃度。其中，睪酮數據來自DHEA處理的第5、10、15、20及21天(n=45)，而雌二醇數據來自DHEA處理的第5、10、15及20天(n=36)。

1.3.5 統(tǒng)計分析 試驗數據使用GraphPad Prism 7.0進行分析，數據組之間的對比使用方差分析并配合Tukey檢驗共同進行。 結果以平均值±標準誤表示，P<0.05被視為有統(tǒng)計學差異。

2 結 果

2.1 昆明白小鼠性周期鑒定

利用結晶紫染液對昆明白小鼠陰道黏液涂片進行染色，結果顯示，在發(fā)情前期，陰道上皮細胞以有核和角質化上皮為主(圖1A)；發(fā)情期階段則只會出現角質化的上皮細胞(圖1B)；發(fā)情后期則存在有核、無核上皮細胞及一定數目的淋巴細胞(圖1C)；間情期則以大量的淋巴細胞為主，同時散在分布有核和無核上皮細胞(圖1D)。

①A，發(fā)情前期；B，發(fā)情期；C，發(fā)情后期；D，間情期。②NEC，有核上皮細胞；CEC，角質化上皮細胞；L，淋巴細胞

2.2 注射DHEA對昆明白小鼠正常性周期的影響

對照組和空載組均在建模完成后的8 d內經歷了2個完整的性周期循環(huán)(圖2A、2B)，而DHEA組則長時間處于發(fā)情或發(fā)情后期，即產生了性周期停滯現象(圖2C)。值得注意的是，雖然在昆明白小鼠處理的20 d內空載組體重增量顯著高于對照組(P<0.05)，但與DHEA組相比并無顯著變化(P>0.05，圖3)。鑒于芝麻油注射后昆明白小鼠性周期依然正常運轉，提示DHEA所引起的性周期變化與芝麻油引起的肥胖無關，說明注射DHEA使昆明白小鼠出現了PCOS樣的性周期停滯現象，昆明白小鼠的生殖內分泌穩(wěn)態(tài)發(fā)生了顯著改變。

①A，對照組；B，空載組；C，DHEA組。②P，發(fā)情前期；E，發(fā)情期；M，發(fā)情后期；D，間情期

*，差異顯著。圖5～7同

2.3 DHEA對昆明白小鼠卵泡發(fā)育及血清睪酮水平的影響

HE染色結果顯示，對照組和空載組卵巢中卵泡形態(tài)正常，且存在部分黃體細胞(圖4A、4B)；DHEA組卵巢組織切片中出現了帶有巨大空腔的囊狀卵泡，且未見到黃體組織(圖4C)。ELISA結果顯示，隨著建模的進行，0 d對照組與21 d對照組之間的血清睪酮水平無顯著差異(P>0.05)；建模結束后，21 d對照組和21 d空載組昆明白小鼠體內血清睪酮水平無顯著差異(P>0.05)；與對照組相比，DHEA組血清睪酮水平顯著升高(P<0.05)(圖5)。說明昆明白小鼠PCOS模型構建成功。

①A，對照組；B，空載組；C，DHEA組。②TCL，顆粒細胞層；GCL，顆粒細胞層；O，卵母細胞；L，黃體；CF，囊狀卵泡

圖5 昆明白小鼠血清睪酮水平測定

2.4 PCOS建模過程中血清睪酮和雌二醇濃度水平變化

睪酮水平測定結果顯示，自DHEA處理的第5天起，DHEA組昆明白小鼠體內血清睪酮水平顯著升高，且于第15天達到峰值，并持續(xù)至第20天(P<0.05，圖6)。雌二醇水平檢測結果顯示，DHEA處理10 d后，血清雌二醇水平顯著升高(P<0.05)，為同時期對照組的19.723倍；第15天時血清雌二醇水平仍顯著高于對照組(P<0.05)；但在建模的第20天，DHEA組血清雌二醇水平開始下降并低于同時期對照組，但無顯著差異(P>0.05)(圖7)。

圖6 PCOS模型構建過程中昆明白小鼠血清睪酮水平變化

圖7 PCOS模型構建過程中昆明白小鼠血清雌二醇水平變化

3 討 論

PCOS患者常伴隨著高雄激素水平和較低的雌二醇水平，但目前對于PCOS發(fā)生過程中睪酮和雌二醇的變化卻鮮有研究。本研究在對常規(guī)DHEA溶解方式進行改良的基礎上，選擇昆明白小鼠進行DHEA注射；隨后對各試驗組進行性周期鑒定、卵巢組織形態(tài)觀察及血清睪酮水平測定，以判定PCOS模型構建是否成功，并在此基礎上探討了PCOS建模過程中的睪酮與雌二醇水平的變化規(guī)律。

對于小鼠而言，除非處于懷孕、假孕或性成熟前，其發(fā)情周期通常包括4個階段：發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期和間情期，并以每4～5 d為一次循環(huán)[12]。現已證明，PCOS小鼠模型的特征之一為性周期的停滯與異常[13]。 本試驗將常規(guī)200 μL芝麻油注射改為100 μL混合溶劑(90 μL芝麻油+10 μL 95%乙醇)，以便更好地溶解DHEA并減少試驗動物的皮下注射應激。與對照組相比，DHEA注射能夠成功使昆明白小鼠性周期停滯在發(fā)情或發(fā)情后期，且長期注射DHEA(20 d)沒有影響到其體重指標。PCOS的另一個典型特征為卵巢的囊泡樣變化[11]。通過20 d的DHEA處理，昆明白小鼠卵巢呈現出比對照組更大的囊泡樣卵泡，提示其卵巢發(fā)生PCOS樣改變。此外，研究者將DHEA刺激動物模型后產生的高水平睪酮作為判斷PCOS模型構建成功的“金標準”[14-16]。本研究發(fā)現，DHEA處理組昆明白小鼠血清睪酮水平高達116.633 ng/mL，顯著高于對照組(0.805 ng/mL)。綜上，DHEA處理不僅造成了昆明白小鼠發(fā)情周期的停滯，而且卵巢卵泡也呈現出PCOS樣典型特征，同時也伴隨著血清睪酮濃度的顯著升高。表明改良后的DHEA處理方式能夠成功構建昆明白小鼠PCOS模型。

DHEA作為雄激素的前體物質，可體內轉化為睪酮[17]?，F已證明，PCOS患者體內的睪酮水平顯著高于對照組的年輕女性[18]；同時長期暴露于高雄激素環(huán)境下的動物易形成PCOS樣病變[19]。本研究發(fā)現，DHEA注射20 d后，未性成熟的昆明白小鼠血清睪酮濃度顯著升高，這與Singh等[11]關于PCOS模型小鼠體內高水平睪酮的報道相一致。另外，連續(xù)注射5～20 d，昆明白小鼠體內睪酮持續(xù)處于較高水平，驗證了異常升高的睪酮水平是誘導PCOS發(fā)生的一個核心因素的觀點；同時建模成功后的血清睪酮濃度為對照組的200倍以上，可以為PCOS患者的臨床鑒定提供參考。

在正常生理狀態(tài)下，DHEA刺激所增加的睪酮會經由芳香化酶途徑被轉化為雌二醇，進而促使血清雌二醇水平升高[20]。此外，PCOS患者或動物模型的臨床特征為卵巢發(fā)育活動停滯在大量囊泡狀卵泡時期，該時期卵泡顆粒細胞較為活躍，但雌二醇水平較低[21]。本研究發(fā)現，DHEA組昆明白小鼠血清雌二醇水平在第10和15天顯著高于對照組，且第10天出現了血清雌二醇濃度最大值，約為同時期對照組的19.723倍，推測雌二醇水平升高可能來自高濃度睪酮轉化。值得注意的是，在高水平雄激素誘導的PCOS卵泡內，雌二醇水平遠遠低于同期卵泡的正常水平[22-23]。本研究也發(fā)現，DHEA注射10 d以后，昆明白小鼠血清雌二醇水平迅速降低，20 d后雌二醇水平降至正常水平以下，與上述報道相一致。研究證明，在PCOS模型小鼠中，高水平雄激素通過激活抗繆勒管激素轉錄，抑制芳香化酶P450活性，促使雌激素水平下降[24-26]。推測本研究發(fā)現的建模后期雌二醇水平降低的現象可能與睪酮向雌二醇轉化途徑受阻有關，但是建模過程中雌二醇瞬時升高是否具有其他病理意義，還需進一步探討。

4 結 論

皮下注射混合溶劑溶解的6 mg/100 g DHEA可成功構建昆明白小鼠PCOS模型，該過程中睪酮水平在5 d后顯著升高并持續(xù)至20 d，雌二醇水平整體呈現先升后降趨勢，但雌二醇在建模中期瞬時升高的病理意義還需進一步研究。