岳鑫璐，梁 根，李志強(qiáng)，李平東，劉 珍，彭李亞，楊婉瓊，胡茂林

（深圳市農(nóng)業(yè)科技促進(jìn)中心，廣東 深圳 518055）

【研究意義】由野油菜黃單胞菌野油菜致病變種（Xanthomonas campestrispv.campestris（Pam.）Dowson，Xcc）引起的十字花科蔬菜黑腐病是目前蔬菜上重要的種傳細(xì)菌性病害［1］。該病害在幼苗期即可發(fā)病，出苗或出苗后子葉呈水浸狀，根髓部變黑而死亡；成株期發(fā)病一般從葉緣開始，形成“V”字形病斑；受害葉片多數(shù)從葉緣開始出現(xiàn)由外向內(nèi)擴(kuò)展的黃色楔狀斑，黃斑內(nèi)的網(wǎng)狀葉脈呈褐色至紫褐色病變［2-4］，最終至植株腐爛。黑腐病不僅可以通過感染的種子和種苗遠(yuǎn)距離傳播，也可通過風(fēng)、昆蟲、灌溉、雨水、農(nóng)業(yè)設(shè)備及人的活動(dòng)等媒介近距離傳播［5-6］。黑腐病通常適于在25～30 ℃條件下發(fā)生，在多雨濕熱的環(huán)境下更易造成該病害的暴發(fā)［7］。20世紀(jì)50年代末，該病害在我國(guó)華北地區(qū)首次出現(xiàn)，到80年代在全國(guó)普遍發(fā)生，且危害逐年加重，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致蔬菜減產(chǎn)70%左右［8］。十字花科蔬菜黑腐病不僅嚴(yán)重影響十字花科蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)，同時(shí)也危害除十字花科以外的多種蔬菜［9］，做好種傳黑腐病的防控具有現(xiàn)實(shí)意義。

【前人研究進(jìn)展】目前，防治種子傳帶黑腐病等種傳病害除了選用無病種子或耐、抗病品種外，主要是采用種子消毒處理?；瘜W(xué)藥劑消毒及拌種能較快速控制病害，但一些化學(xué)處理種子方法可能對(duì)種子產(chǎn)生傷害，對(duì)于植物、土壤、水體可能會(huì)產(chǎn)生不良影響［10］。與化學(xué)方法相比，種子熱處理方法是利用有效殺菌溫度與種子可能受傷害的溫度存在一定溫差，以此達(dá)到抑制或殺死種子攜帶的病原菌，從而達(dá)到防控病害以及保護(hù)環(huán)境的目的［11］。由于不同作物種子及其攜帶的病原菌對(duì)溫度、時(shí)間的敏感度不同，因而需要針對(duì)特定作物及病原菌設(shè)置特定的干熱處理?xiàng)l件。種子干熱處理可以阻止病原菌在種子表面的進(jìn)一步繁殖，降低種子的帶菌率［12］；孟姍姍對(duì)4 種蔬菜種子進(jìn)行干熱處理技術(shù)研究，表明干熱處理可以有效減少種子上的病原菌，同時(shí)降低種子攜帶病原菌的致病性［13］；張永平等對(duì)甜瓜種子攜帶細(xì)菌性果斑病進(jìn)行干熱處理研究，結(jié)果表明適宜的干熱處理溫度和處理時(shí)間能有效提高種子活力和出苗率，顯著降低甜瓜種子幼苗細(xì)菌性果斑病發(fā)病率［14］。

【本研究切入點(diǎn)】目前有關(guān)蔬菜種子熱處理研究大多關(guān)注對(duì)象為葫蘆科及茄果科作物種子，主要研究不同熱處理?xiàng)l件對(duì)作物種子活力及生長(zhǎng)的影響，對(duì)種子攜帶病原菌尤其是十字花科蔬菜種子攜帶病原菌的熱處理研究報(bào)道較少。本研究通過設(shè)置不同的溫度和時(shí)間組合干熱條件，對(duì)黑腐病菌及帶菌白菜種子進(jìn)行處理，綜合評(píng)價(jià)抑菌率及種子活力等指標(biāo)，篩選安全、適宜的干熱處理?xiàng)l件，以期為十字花科蔬菜黑腐病菌防治、病害綠色防控技術(shù)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究旨在探究干熱處理對(duì)十字花科蔬菜種子及其種傳黑腐病菌的影響，篩選出可抑制種傳病菌生長(zhǎng)同時(shí)不影響種子活力的溫度與時(shí)間組合處理?xiàng)l件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2020 年4 月至2021 年6 月在深圳市農(nóng)業(yè)科技促進(jìn)中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試菌株十字花科蔬菜黑腐病菌Xcc 8004，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)種子健康中心實(shí)驗(yàn)室提供。桂柳四季高腳甜白菜種子由柳州市桂柳農(nóng)業(yè)科技有限公司生產(chǎn)，經(jīng)前期檢測(cè)為未攜帶黑腐病菌的健康種子。

LB 固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母粉5 g，瓊脂粉16 g 加蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌21 min 后備用；LB 液體培養(yǎng)基：不含瓊脂粉，其他同LB 固體培養(yǎng)基；改良mCS20ABN 培養(yǎng)基：大豆蛋白胨2 g，細(xì)菌胰蛋白胨2 g，磷酸二氫鉀1.59 g，磷酸氫二銨0.33 g，七水合硫酸鎂0.4 g，谷氨酰胺6.0 g，甲基綠1 mL，可溶性淀粉12.5 g，細(xì)菌瓊脂粉15 g，蒸餾水定容到1 000 mL，121 ℃滅菌21 min，冷卻至55 ℃后迅速加入1 mL 濃度為200 mg/mL 的放線菌酮、1 mL 濃度為20 mg/mL 的新霉素、1 mL 濃度為100 mg/mL 的枯草菌素，充分搖勻后倒入培養(yǎng)皿備用［15］。

儀器：METTLER TOLEDO DL203 電子天平，Eppendorf 5425R 臺(tái)式高速離心機(jī)，F(xiàn)YL-YS-150YLYS-28L 菌株培養(yǎng)箱，知楚ZQTY-70F 臺(tái)式全溫振蕩培養(yǎng)箱，Leica DM400B 生物顯微鏡，WEWO TEM1880 可程式恒溫恒濕試驗(yàn)箱，HiPoint FH-1200 植物生長(zhǎng)培養(yǎng)箱。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黑腐病菌的活化與培養(yǎng) 病原菌活化：用接種環(huán)蘸取凍存的菌株培養(yǎng)液，在LB 固體培養(yǎng)基上劃線，在菌株培養(yǎng)箱內(nèi)于28 ℃、相對(duì)濕度＞60%遮光倒置培養(yǎng)2～3 d。

病菌懸浮液制備：用無菌接種環(huán)挑取LB 固體培養(yǎng)基上的單菌落，接種到裝有200 mL 的LB液體培養(yǎng)基中，150 r/min 培養(yǎng)16 h，制備成濃度為106CFU/mL 的菌液備用。

1.2.2 離體條件下病原菌干熱處理 參照孟珊珊［13］所做濾紙片法進(jìn)行干熱處理試驗(yàn)，將2 張1 cm×1 cm 無菌濾紙片浸入制備好的106CFU/mL 菌懸液中，浸泡5 min 后在超凈工作臺(tái)取出晾干備用。隨后將晾干后的帶菌濾紙片置于直徑5 cm、高3 cm 的敞蓋圓柱體鋁盒內(nèi)，按照溫度（45、50、60、65 ℃）、時(shí)間（0.5、1、2、4、6 h）組成的20 個(gè)處理?xiàng)l件對(duì)帶菌濾紙片進(jìn)行處理。處理完成后將各個(gè)濾紙片分別浸泡在5 mL 無菌水中，180 r/min 搖床振蕩30 min，制備洗脫液，每個(gè)處理的洗脫液稀釋成100、10-1、10-2、10-3、10-4梯度，分別吸取100 μL液體于LB固體培養(yǎng)基上涂板，每個(gè)濃度3 次重復(fù)，以未進(jìn)行熱處理的病原菌為對(duì)照。涂板后將平板倒置于28 ℃、相對(duì)濕度＞60%黑暗倒置培養(yǎng)48 h 后，記錄菌落生長(zhǎng)情況并計(jì)算病原菌抑制率：

病原菌抑制率（%）=（對(duì)照病原菌菌落數(shù)量-處理病原菌菌落數(shù)量）/對(duì)照病原菌菌落數(shù)量×100

1.2.3 種子攜帶黑腐病菌干熱處理 帶菌種子制備：每組處理隨機(jī)選取1 000 粒種子于3%NaClO溶液中消毒5 min 后用無菌水沖洗3 次，濾紙吸干種子表面水分，隨后將種子放入鋪有兩層無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，于超凈工作臺(tái)中風(fēng)干。將風(fēng)干的種子置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，加入5 mL 濃度為106CFU/mL 菌懸液，浸泡30 min 后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)吸出菌液，風(fēng)干后置于直徑5 cm、高3 cm 的敞蓋圓柱體鋁盒內(nèi)于恒溫恒濕箱進(jìn)行干熱處理。

種子攜帶黑腐病菌的抑制率計(jì)算：每組樣品干熱處理完成后取2 g（1 000 粒）種子按照種子質(zhì)量∶無菌純凈水=1∶4 的比例置于10 mL 試管中，于180 r/min 搖床振蕩30 min，制備洗脫液。隨后分別稀釋成100、10-1、10-2、10-3梯度，分別吸取100 μL 菌液于改良mCS20ABN 培養(yǎng)基上涂板，每個(gè)處理3 次重復(fù)。將平板倒置于28 ℃、相對(duì)濕度＞60%黑暗培養(yǎng)48 h 后，在4 組稀釋梯度平板中選取菌落數(shù)在30～300 個(gè)之間、無蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)，統(tǒng)計(jì)單粒種子帶菌量，計(jì)算病原菌抑制率：

單粒種子帶菌量（個(gè)/粒）=3 皿平板菌落總數(shù)/0.3 mL×稀釋倍數(shù)×8 mL/1 000 粒

病原菌抑制率（%）=（對(duì)照單粒種子帶菌量-處理單粒種子帶菌量）/對(duì)照單粒種子帶菌量×100

式中，0.3 mL 表示3 皿平板內(nèi)菌液總量，8 mL 為制備種子洗脫液的量。

1.2.4 種子攜帶黑腐病菌的活力評(píng)價(jià) 參照GB/T 3543.4-1995《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程-發(fā)芽試驗(yàn)》，將熱處理后的種子置于19 cm×13 cm×8 cm 發(fā)芽盒中，每個(gè)發(fā)芽盒鋪兩層無菌發(fā)芽紙保濕，每盒擺放100 粒種子，3 次重復(fù)。將發(fā)芽盒置于植物生長(zhǎng)培養(yǎng)箱中，在20 ℃、相對(duì)濕度＞70%黑暗條件下發(fā)芽，待種子出芽后，于20 ℃、相對(duì)濕度＞70%、L//D=12 h//12h 條件下培養(yǎng)。以健康的種子為對(duì)照。分別測(cè)定發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)［16］，綜合評(píng)價(jià)種子活力。

發(fā)芽率（%）=第7 天發(fā)芽種子數(shù)/處理種子數(shù) ×100

發(fā)芽指數(shù)（GI）=∑（Gt/Dt）

活力指數(shù)（VI）=GI×S

式中，Dt為發(fā)芽日數(shù)，Gt為與Dt相對(duì)應(yīng)的每天發(fā)芽數(shù)，S 為第7 天正常幼苗鮮重（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 十字花科蔬菜黑腐病菌生物學(xué)特性

將活化的病原菌在LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h，稀釋成103CFU/mL 后均勻涂布于LB 固體培養(yǎng)基和改良mCS20ABN 固體培養(yǎng)基上（28 ℃、相對(duì)濕度＞60%，黑暗倒置培養(yǎng)）。病原菌在LB 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d 后，菌落生長(zhǎng)至1～2 mm，前期呈淡黃色，后期呈蠟黃色，圓形、黏稠狀、微凸起（圖1A、B）；病原菌在改良mCS20ABN 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d，菌落生長(zhǎng)到0.5～1 mm，呈淡綠色或半透明、圓形、黏稠狀、稍隆起且有光澤，菌落周圍被水解淀粉圈包圍（圖1C、D）。

圖1 Xcc 在LB 培養(yǎng)基和改良mCS20ABN 培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)形態(tài)Fig.1 Morphologies of Xcc cultured on LB and modified mCS20ABN media

2.2 干熱處理對(duì)離體條件下病原菌的抑制作用

采用濾紙片法，按照溫度（45、50、60、65 ℃）、時(shí)間（0.5、1、2、4、6 h）組成的20 個(gè)處理?xiàng)l件對(duì)病原菌進(jìn)行處理，結(jié)果（表1）顯示，當(dāng)干熱處理溫度為45 ℃，處理時(shí)間為4 h 及以上，病原菌抑制率達(dá)100%。當(dāng)干熱處理溫度分別為50、60、65 ℃時(shí)，處理時(shí)間為0.5 h 及以上，病原菌抑制率均可達(dá)到100%。

表1 干熱處理對(duì)離體條件下Xcc 病原菌的抑制作用Table 1 Inhibition effects of different dry heat treatments on Xcc pathogens in vitro

2.3 干熱處理對(duì)種子攜帶黑腐病菌的抑制作用

根據(jù)上述干熱處理對(duì)病原菌的抑制結(jié)果，選取溫度為45、50 ℃，時(shí)間為0、4、8、10 h 的組合條件對(duì)帶菌種子進(jìn)行干熱處理（0 h 處理表示帶菌種子未進(jìn)行熱處理）。

帶菌種子干熱處理后，制備洗脫液涂板并在改良mCS20ABN 培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d 后，統(tǒng)計(jì)病原菌在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，并計(jì)算抑制率，結(jié)果顯示，同一溫度條件下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，平板上菌落數(shù)量隨之減少（圖2），當(dāng)溫度為50 ℃，持續(xù)干熱處理8 h 及以上時(shí)，平板上菌落數(shù)為0，病原菌抑制率達(dá)100%（表2）。

表2 不同干熱處理對(duì)種子攜帶Xcc 的影響Table 2 Effects of different dry heat treatments on seeds with Xcc

圖2 不同干熱處理種子攜帶Xcc 分離情況Fig.2 Xcc isolated from seeds under different dry heat treatments

2.4 干熱處理對(duì)帶菌種子活力的影響

將帶菌種子選取50 ℃與0、8、10 h 組合條件進(jìn)行干熱處理（0 h 處理表示帶菌種子未進(jìn)行熱處理），以未經(jīng)處理的健康種子為對(duì)照。結(jié)果顯示，在50 ℃條件下干熱處理8 h，對(duì)種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)以及活力指數(shù)沒有顯著影響，且活力高于未進(jìn)行干熱處理的帶菌種子；在50 ℃條件下干熱處理10 h，對(duì)發(fā)芽率影響顯著。

表3 不同干熱處理對(duì)種子活力的影響Table 3 Effects of different dry heat treatment on seed vigor

3 討論

種子干熱處理利用干熱空氣對(duì)種子進(jìn)行高溫處理，利用熱力及有效殺菌溫度與種子耐受溫度的差距來殺滅病菌［17］。前人利用不同作物品種及種傳病原菌為試驗(yàn)材料，探究熱處理對(duì)種子活力及殺菌的影響，已有相關(guān)成果。劉永勝研究了不同干熱處理對(duì)油菜種子發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)的影響，得出50 ℃處理是油菜種子較為理想的干熱處理溫度［18］。劉正魯?shù)忍骄扛蔁崽幚淼牟煌瑴囟群蜁r(shí)長(zhǎng)對(duì)黃瓜種子發(fā)芽及植株生長(zhǎng)發(fā)育的影響，得出干熱溫度75 ℃、時(shí)長(zhǎng)24 h 處理的種子育苗，黃瓜的莖粗、植株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均顯著高于對(duì)照，且未發(fā)生病毒?。?9］。宋順華等研究了干熱處理對(duì)不同種類葫蘆科瓜菜種子活力的影響，結(jié)論為干熱處理會(huì)降低種子的活力，其影響程度會(huì)因不同作物種類及同一種類不同品種而異［20］。本研究在前人的研究基礎(chǔ)上，設(shè)置干熱處理對(duì)黑腐病菌及人工拌菌白菜種子進(jìn)行處理，綜合評(píng)價(jià)病原菌抑制率、帶菌種子苗期發(fā)病率及種子活力。

從試驗(yàn)結(jié)果看，本研究對(duì)桂柳四季高腳甜白菜種子攜帶黑腐病菌所篩選能有效抑制黑腐病菌同時(shí)顯著提高帶菌種子活力的處理?xiàng)l件為50 ℃持續(xù)干熱8 h。宋順華等研究表明，80 ℃處理3 d能完全抑制帶菌種子上的黑腐病菌，并對(duì)不帶菌的京春白、京春黃和新奶白品種的種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)沒有影響［21］。本研究結(jié)果驗(yàn)證了宋順華等的觀點(diǎn)，即同一種作物種子不同品種對(duì)高溫的敏感度不一樣，針對(duì)不同的品種應(yīng)選擇適宜的高溫［21］。

從試驗(yàn)條件上分析，宋順華等［21］的試驗(yàn)，干熱條件預(yù)設(shè)35 ℃ 24 h、55 ℃ 24 h 對(duì)白菜種子進(jìn)行前置處理，目的在于控制種子含水量低于4%，而本研究未對(duì)種子進(jìn)行前置處理，種子含水量變化致使不同條干熱條件對(duì)種子活力的影響有待進(jìn)一步研究。

從試驗(yàn)對(duì)象上看，宋順華等［21］對(duì)帶菌京春白種子干熱處理，其種子在65、70、75、80 ℃干熱處理72 h，單粒種子上病原細(xì)菌的帶菌量比對(duì)照分別減少92%、99%、99%和100%，推測(cè)其種子為內(nèi)外部均攜帶黑腐病菌的自然種子。而本研究則對(duì)健康種子進(jìn)行人工拌菌，從而模擬種子表面帶菌，干熱處理后180 r/min 搖床振蕩30 min，可將種子表面攜帶病原菌洗脫，統(tǒng)計(jì)單粒種子帶菌量種子；結(jié)果顯示50 ℃持續(xù)干熱處理8 h 病原菌抑制率達(dá)100%，其結(jié)果基于種子表面攜帶病原菌進(jìn)行探究，種子內(nèi)部攜帶病菌相關(guān)分析有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)黑腐病菌及帶菌白菜種子進(jìn)行干熱處理，對(duì)比分析了不同熱處理?xiàng)l件對(duì)病原菌抑制效果、種子的滅菌效果以及種子活力指標(biāo)。篩選出溫度為45 ℃持續(xù)干熱處理4 h 及以上或溫度為50、60、65 ℃持續(xù)干熱處理0.5 h 及以上的干熱處理?xiàng)l件能使離體黑腐病菌失活；溫度為50℃持續(xù)干熱處理8 h 能完全抑制帶菌種子攜帶病原菌，且能提高種子的活力。綜合研究結(jié)果表明，50 ℃持續(xù)干熱處理8 h 能有效抑制黑腐病菌生長(zhǎng)，對(duì)種子具有滅菌效果，同時(shí)能提高種子的活力。