賀 毅，楊 鑫，鄒安慶，古麗扎爾·伊里，阿力木·熱合曼，崔 濤，郜 樂，杜 恒，馬 彬

(新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院泌尿外科，新疆烏魯木齊 830063)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是發(fā)生在男性前列腺腺體的上皮性惡性腫瘤，已成為影響全球男性健康的重大難題之一[1-2]。當前，PCa的治療方式有手術治療、內(nèi)分泌治療、放化療及局部治療等，但腫瘤細胞的持續(xù)增殖、遷移和轉(zhuǎn)移導致PCa臨床治療效果不佳，患者生存率下降[3-4]。因此，探尋抑制PCa轉(zhuǎn)移的新方法或者新靶點，對PCa的臨床治療具有重要意義。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤細胞獲得侵襲、遷移能力的重要生物學過程，EMT可促進腫瘤進展，增加腫瘤治療難度[5-6]。GTP酶激活蛋白-Src同源結構域3-結合蛋白1(Ras-GTPase-activating protein SH3 domain binding protein，G3BP1)是一種SH3結構域結合蛋白。已有文獻顯示 G3BP1 在腦部腫瘤、肺癌、前列腺癌、結腸癌等多種癌癥中高表達，其可通過調(diào)節(jié)多種信號通路促進腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移及EMT過程[7-9]。因此，G3BP1可能是防治腫瘤細胞EMT過程、發(fā)生轉(zhuǎn)移的潛在靶點。槲皮素(Quercetin)是一種天然黃酮類化合物，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、降血壓等多種生物活性。近年來多項研究表明，槲皮素對肝癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞均有抑制作用，是頗具研究價值和應用前景的抗癌藥物之一[10-11]。已有研究證實，槲皮素可增加人前列腺癌細胞-3(human prostate cancer cell，PC-3)對化療藥物的敏感性并逆轉(zhuǎn)其對化療藥的耐藥性。但槲皮素對PCa細胞遷移、侵襲及EMT的作用效果及機制尚未完全明確[12]。因此，本研究探討槲皮素對PCa細胞遷移、侵襲及EMT的影響，并探究其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株PC-3細胞株購自上海遠慕生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器主要試劑：槲皮素購自成都德思特生物技術有限公司，純度≥98%；胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國艾德思公司；Transwell小室購自Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、RIPA裂解液、蛋白質(zhì)提取試劑盒、二辛可寧酸(Bicinchoninic acid，BCA)試劑盒均購自上海碧云天生物技術公司；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；NC siRNA和G3BP1 siRNA購自美國Origene公司；真核過表達質(zhì)粒pcDNA3.1-G3BP1及對照質(zhì)粒pcDNA3.1均購自上海吉瑪制藥有限公司；G3BP1及內(nèi)參上下游引物均購自上海生工公司；Trizol試劑盒、TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×SYBR Premix Ex Taq試劑盒均購自日本TaKaRa公司；G3BP1、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、轉(zhuǎn)錄因子Snail、Wnt家族成員3A(Wnt family member 3A，Wnt3α)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶3β(Glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)、磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)等兔抗人單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；小鼠抗人β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔 IgG、HRP標記的山羊抗小鼠IgG 購自Sigma公司；電化學發(fā)光液購自 Millipore 公司。

主要儀器：Forma370細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；Varioskan LUX 多功能酶標儀(美國Thermo公司)；DYC-p32型電泳儀(上海巴玖實業(yè)有限公司)；實時定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；FCM凝膠成像儀(美國Protein Simple公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1細胞培養(yǎng) 解凍、復蘇PC-3細胞，置于加有10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁生長至80%～90%時，以0.25%的胰酶消化傳代，收集生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞制備單細胞懸液。

1.3.2細胞分組與處理 取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期PC-3細胞，分別用20、40、80 μmol/L濃度槲皮素處理48 h的PC-3細胞作為槲皮素低、中、高濃度組，并篩選出槲皮素適宜濃度用于后續(xù)研究；正常培養(yǎng)的PC-3細胞設為空白對照組；將稀釋的LipofectamineTM2000 和 G3BP1 siRNA干擾序列混合液轉(zhuǎn)染至PC-3細胞，培養(yǎng)6 h，然后用適宜濃度的槲皮素處理48 h，記為槲皮素+G3BP1 siRNA組，同時設置槲皮素+si-NC組；將稀釋的pcDNA3.1-G3BP1與LipofectamineTM2000混合液轉(zhuǎn)染至PC-3細胞，培養(yǎng)6 h，然后用適宜濃度的槲皮素處理48 h，記為槲皮素+pcDNA3.1-G3BP1組，同時設置槲皮素+pcDNA3.1組。

1.3.3細胞劃痕試驗檢測細胞遷移能力 取各組PC-3細胞，經(jīng)胰酶消化后制成單細胞懸液，以5×105個/孔的接種密度均勻接種于6孔板進行培養(yǎng)等待貼壁，每孔設6個復孔，細胞貼壁鋪滿孔板底部時棄去培養(yǎng)液，用高溫滅菌的20 μL移液槍頭勻速在6孔板內(nèi)垂直劃痕，用滅菌的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)小心沖洗3次，隨后加入無血清的DMEM培養(yǎng)基，將6孔板放于倒置顯微鏡下觀察拍照，標記初始劃痕距離，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后顯微鏡下再次拍照，計算細胞遷移率，實驗重復3次。細胞遷移率(%)=(初始劃痕距離-24 h劃痕距離)/初始劃痕距離×100%。

1.3.4Transwell小室法測定細胞侵襲能力 各組PC-3細胞用無血清DMEM培養(yǎng)基處理12 h后，重懸并調(diào)整細胞濃度約5×105/mL，取各組細胞懸液200 μL接種于Transwell小室的上室(Transwell小室基底膜預先使用1∶8的matrigel基質(zhì)膠包被)，下室加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基600 μL，每組設置3個復孔，將Transwell小室置入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，無菌棉簽輕輕擦去上層未穿膜細胞，PBS洗滌3次，加入4%多聚甲醛固定20 min，室溫下用0.1%結晶紫染色30 min，棄去染液，PBS沖洗3次，自然晾干，于400倍倒置顯微鏡下隨機選取5個視野進行細胞計數(shù)，結晶紫染色細胞數(shù)即為侵襲細胞數(shù)。實驗重復3次。

1.3.5qRT-PCR檢測G3BP1 mRNA表達水平 收集各組細胞，采用Trizol法提取細胞中的總RNA，以酶標儀檢測RNA濃度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。G3BP1上游引物5′-GTCGCCCAGTTGCAGTGCTG-3′，下游引物5′-CAGTCGGACCTGCTCAGCTG-3′；β-actin上游引物5′-TGCACCAGCTGCTCTTCAGC-3′，下游引物5′-AGCTGGACCTCGGATCAGCAG-3′。以cDNA為模板進行qRT-PCR實驗，反應體系為：10 μmol/L的G3BP1及GAPDH上下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，2×SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL，加滅菌蒸餾水至總反應體系25 μL。反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃預變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進行40次循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算G3BP1 mRNA相對表達量。

1.3.6Western blot法測定細胞內(nèi)G3BP1、EMT、Wnt/β-catenin相關蛋白表達水平 收集各組細胞，胰酶消化處理，加入RIPA細胞裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r/min離心10 min，提取總蛋白，采用BCA法測定總蛋白濃度。聚丙烯酰氨凝膠電泳(Sodium salt-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離蛋白后濕轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride，PVDF)膜上，在含5% 脫脂奶粉的TBST緩沖液中室溫封閉2 h，分別加入G3BP1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Wnt3α、β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β、β-actin單克隆抗體，稀釋比均為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，對應加入HRP標記的山羊抗兔IgG和HRP標記的山羊抗小鼠IgG 1∶2 000，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min，滴加ECL試劑顯色，于暗室中曝光，采集圖像，分析各條帶灰度，計算目的蛋白表達水平。

2 結 果

2.1 槲皮素抑制PC-3細胞遷移、侵襲及EMT細胞劃痕實驗結果顯示，與空白對照組相比，槲皮素低、中、高濃度組PC-3細胞遷移能力均顯著下降(P<0.05)，且細胞遷移能力降低程度呈濃度依賴性(圖1A)；Transwell小室法實驗結果顯示，與空白對照組相比，槲皮素低、中、高濃度組PC-3細胞侵襲能力均顯著下降(P<0.05)，且細胞侵襲能力降低程度呈濃度依賴性(圖1B)； Western blot法檢測結果顯示，與空白對照組相比，槲皮素低、中、高濃度組PC-3細胞E-cadherin表達量均顯著上調(diào)(P<0.05)，N-cadherin、Vimentin、Snail表達量均顯著下調(diào)(P<0.05)，且上述蛋白表達量變化呈濃度依賴性(圖1C)。由于槲皮素對PC-3細胞的作用效果呈濃度依賴性，故本研究后續(xù)實驗選用高濃度槲皮素處理PC-3細胞。

A：細胞劃痕試驗檢測PC-3細胞遷移能力柱狀圖；B：Transwell小室法檢測PC-3細胞侵襲能力柱狀圖；C：Western blot法檢測EMT相關蛋白表達水平及柱狀圖。*與空白對照組比較，P<0.05；#與槲皮素低濃度組比較，P<0.05；&與槲皮素中濃度組比較，P<0.05。

2.2 槲皮素抑制PC-3細胞G3BP1 mRNA和蛋白表達與空白對照組相比，槲皮素低、中、高濃度組PC-3細胞G3BP1 mRNA和蛋白表達水平均顯著下降(P<0.05)，且G3BP1 mRNA和蛋白表達水平下降程度呈濃度依賴性(圖2)。圖2顯示W(wǎng)estern blot法檢測G3BP1、qRT-PCR法檢測G3BP1 mRNA表達水平電泳圖及柱狀圖。

* 與空白對照組比較，P<0.05；#與槲皮素低濃度組比較，P<0.05；&與槲皮素中濃度組比較，P<0.05。

2.3 沉默G3BP1聯(lián)合槲皮素抑制PC-3細胞遷移、侵襲及EMT槲皮素+G3BP1 siRNA組PC-3細胞內(nèi)G3BP1 mRNA表達水平顯著低于槲皮素+si-NC組和空白對照組(P<0.05)，槲皮素+si-NC組和空白對照組PC-3細胞內(nèi)G3BP1 mRNA表達水平無顯著性差異(P>0.05)，說明G3BP1 siRNA轉(zhuǎn)染成功(圖3A)。與空白對照組比較，槲皮素+si-NC組和槲皮素+G3BP1 siRNA組PC-3細胞遷移、侵襲能力均顯著下降(P<0.05)(圖3B、C)；與槲皮素+si-NC組比較，槲皮素+G3BP1 siRNA組PC-3細胞遷移、侵襲能力均顯著下降(P<0.05)(圖3B、C)。Western blot法檢測結果顯示，與空白對照組比較，槲皮素+si-NC組和槲皮素+G3BP1 siRNA組PC-3細胞E-cadherin表達量均顯著上調(diào)(P<0.05)，N-cadherin、Vimentin、Snail表達量均顯著下調(diào)(P<0.05)；與槲皮素+si-NC組比較，槲皮素+G3BP1 siRNA組PC-3細胞E-cadherin表達量顯著上調(diào)(P<0.05)，N-cadherin、Vimentin、Snail表達量均顯著下調(diào)(P<0.05)(圖3D)。

A：qRT-PCR法檢測G3BP1 mRNA表達水平柱狀圖；B：細胞劃痕試驗檢測PC-3細胞遷移能力柱狀圖；C：Transwell小室法檢測PC-3細胞侵襲能力柱狀圖；D：Western blot法檢測EMT相關蛋白表達水平及柱狀圖。*與空白對照組比較，P<0.05；# 與槲皮素+si-NC組比較，P<0.05。

2.4 過表達G3BP1拮抗槲皮素促進PC-3細胞遷移、侵襲及EMT槲皮素+pcDNA3.1-G3BP1組PC-3細胞內(nèi)G3BP1 mRNA表達水平顯著高于槲皮素+pcDNA3.1組和空白對照組(P<0.05)，槲皮素+pcDNA3.1組和空白對照組PC-3細胞內(nèi)G3BP1 mRNA表達無顯著性差異(P>0.05)，說明pcDNA3.1-G3BP1轉(zhuǎn)染成功(圖4A)。與空白對照組比較，槲皮素+pcDNA3.1組和槲皮素+pcDNA3.1-G3BP1組PC-3細胞遷移、侵襲能力均顯著下降(P<0.05)；與槲皮素+pcDNA3.1組比較，槲皮素+pcDNA3.1-G3BP1組PC-3細胞遷移、侵襲能力均顯著升高(P<0.05)(圖4B、C)。Western blot法結果顯示，與空白對照組比較，槲皮素+pcDNA3.1組和槲皮素+pcDNA3.1-G3BP1組PC-3細胞E-cadherin表達量均顯著上調(diào)(P<0.05)，N-cadherin、Vimentin、Snail表達量均顯著下調(diào)(P<0.05)；與槲皮素+pcDNA3.1組比較，槲皮素+pcDNA3.1-G3BP1組PC-3細胞E-cadherin表達量顯著下調(diào)(P<0.05)，N-cadherin、Vimentin、Snail表達量均顯著上調(diào)(P<0.05)(圖4D)。

2.5 沉默/過表達G3BP1聯(lián)合槲皮素影響PC-3細胞Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達Western blot法結果顯示，與空白對照組比較，槲皮素組、槲皮素+G3BP1 siRNA組、槲皮素+pcDNA3.1-G3BP1組PC-3細胞Wnt3α、β-catenin、p-GSK-3β表達量均顯著下調(diào)(P<0.05)，GSK-3β表達量顯著上調(diào)(P<0.05)；與槲皮素組比較，槲皮素+G3BP1 siRNA組PC-3細胞Wnt3α、β-catenin、p-GSK-3β表達量均顯著下調(diào)(P<0.05)，GSK-3β表達量顯著上調(diào)(P<0.05)，槲皮素+pcDNA3.1-G3BP1組PC-3細胞Wnt3α、β-catenin、p-GSK-3β表達量均顯著上調(diào)(P<0.05)，GSK-3β表達量顯著下調(diào)(P<0.05)(圖5)。

A:qRT-PCR法檢測G3BP1 mRNA表達水平柱狀圖；B:細胞劃痕試驗檢測PC-3細胞遷移能力柱狀圖；C:Transwell小室法檢測PC-3細胞侵襲能力柱狀圖；D:Western blot法檢測EMT相關蛋白表達水平電脈圖及柱狀圖。*與空白對照組比較，P<0.05；#與槲皮素+si-NC組比較，P<0.05。

A:Western blot法檢測各組相關蛋白表達水平電泳圖;B：各組相關蛋白表達水平柱狀圖。*與空白對照組比較，P<0.05；△與槲皮素組比較，P<0.05。

3 討 論

PCa是常見且發(fā)病率高的男性惡性腫瘤之一，早期癥狀輕但卻易發(fā)生轉(zhuǎn)移，臨床確診時許多患者已處于晚期，雖然臨床上有手術、化療、內(nèi)分泌治療等手段可改善PCa患者生存率，然而腫瘤細胞遠端轉(zhuǎn)移仍然是影響患者存活率和預后的主要不良因素[13]，因此，探究PCa發(fā)生、轉(zhuǎn)移的分子機制，尋找治療PCa的分子靶點極為必要。槲皮素是一種具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用的天然多醇羥基黃酮類化合物，大量的臨床研究證實槲皮素可抑制多種腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[14-15]。本研究考察槲皮素對PCa細胞侵襲、遷移的影響，結果顯示，槲皮素能顯著抑制PC-3細胞遷移、侵襲，并呈現(xiàn)濃度依賴性關系。

G3BP1是一種RNA結合蛋白，具有調(diào)節(jié)壓力顆粒形成和mRNA代謝及穩(wěn)定性等多種生物學功能。近年來，越來越多的研究證據(jù)表明G3BP1可以參與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移[21]。但G3BP1在PCa中的功能作用尚不清楚。本研究采用qRT-PCR和Western blot實驗檢測G3BP1 mRNA和蛋白表達水平，結果顯示槲皮素處理PC-3細胞后，PC-3細胞中G3BP1 mRNA和蛋白表達水平明顯降低，提示G3BP1可能參與了槲皮素抗PCa的過程。為進一步明確G3BP1在槲皮素治療PCa中的功能作用，本研究通過沉默和過表達G3BP1，分析G3BP1對PC-3細胞遷移、侵襲及EMT的影響，結果發(fā)現(xiàn)，沉默G3BP1能夠增強槲皮素對PC-3細胞遷移、侵襲及EMT的抑制效果，過表達G3BP1能夠逆轉(zhuǎn)槲皮素對PC-3細胞遷移、侵襲及EMT的抑制效果。該結果表明槲皮素可通過靶向G3BP1抑制PC-3細胞遷移、侵襲及EMT進程。

Wnt/β-catenin信號通路是一條高度保守的信號通路，參與正常干細胞的增殖、凋亡與遷移。當Wnt/β-catenin信號通路被異常激活時，Wnt3α作為一種激活Wnt/β-catenin通路的Wnt同源物，可促進一系列蛋白活化，導致GSK3β磷酸化失活和β-catenin蛋白聚積。胞內(nèi)大量聚積的β-catenin轉(zhuǎn)移進入細胞核中會激活轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性，促進靶基因轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控腫瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生理活動[22-23]。大量臨床研究證實Wnt/β-catenin信號通路在PCa的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[24-25]。WEI等[26]報道漢黃芩苷通過調(diào)節(jié) Wnt/β-catenin 通路和EMT抑制PCa細胞生長和轉(zhuǎn)移。WU等[27]研究表明2’-羥基黃酮通過抑制 Wnt/β-catenin信號通路進而抑制PCa細胞EMT過程和細胞遷移、侵襲。LI等[28]研究報道，過表達G3BP1通過激活 β 連環(huán)蛋白信號通路促進結腸癌的進展。ZHANG等[29]研究發(fā)現(xiàn)G3BP1基因沉默通過抑制 Wnt/β-catenin 和 PI3K/AKT 信號通路抑制食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲，而G3BP1基因過表達則對食管癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生相反作用。本研究探究槲皮素、G3BP1與Wnt/β-catenin通路的關系，結果發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠顯著下調(diào)PC-3細胞Wnt3α、β-catenin、p-GSK-3β表達量，上調(diào)PC-3細胞GSK-3β表達量；沉默G3BP1能夠增強槲皮素對Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的調(diào)控作用，過表達G3BP1可逆轉(zhuǎn)槲皮素對Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的調(diào)控作用。該結果提示槲皮素通過G3BP1調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮抗PCa的作用。

綜上所述，槲皮素能夠抑制PCa細胞EMT進程，進而抑制PCa細胞侵襲、遷移，槲皮素抑制EMT的作用機制可能與靶向G3BP1調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路相關。本研究為PCa的治療提供了潛在的靶點和候選藥物。