高韻，司雨柔，解玫瑩，李歡歡，章鵬飛，莊新港，程旺興*

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院/現(xiàn)代中藥安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 合肥 230012；2.中國電子科技集團(tuán)公司 第四十一研究所，安徽 蚌埠 233010

黃精為百合科（Liliaceae）黃精屬（PolygonatumMill.）多年生草本植物。全球黃精屬植物分布有60 多種，其中我國該屬物種資源豐富，種類約占全球的50%。黃精根莖可入藥，具有較豐富的藥用價值，且其味甘，性平，營養(yǎng)價值較高[1-2]?，F(xiàn)代藥理研究顯示，黃精中含有多種活性成分，如甾體皂苷、黃精多糖、醌類、氨基酸及微量元素等，具有止血、抑制腎上腺素引起的血糖升高、抗氧化、抗疲勞和抗病原微生物等藥理作用[3-4]。正是由于藥用價值和食用價值高，黃精的臨床用量較大，目前市場常有偽品混用。而黃精屬內(nèi)的物種比較豐富，性狀特征相似，導(dǎo)致鑒別較為困難，給用藥安全造成隱患。因此，需要可靠的技術(shù)對黃精進(jìn)行鑒別，以保障其使用的安全性和可靠性。目前，黃精的鑒別方法主要包括性狀[5]和顯微鑒別[6]、分子鑒別[7]、指紋圖譜鑒別[8]等。由于鑒別人員的經(jīng)驗及植物樣本的差異，性狀鑒別結(jié)果的正確性難以得到保證。其他儀器分析鑒別技術(shù)發(fā)展迅速，但是中藥化學(xué)成分組成極為復(fù)雜，藥材復(fù)雜的前處理不僅繁瑣而且可能會破壞藥材的成分，不一定能夠反映其真實(shí)信息。

顯微紅外成像技術(shù)是一種新型檢測技術(shù)，能更直接地表達(dá)復(fù)雜物質(zhì)的空間組成成分及空間結(jié)構(gòu)信息[9-10]。該法可以獲得被測物質(zhì)任意部位的紅外光譜圖像，通過對圖像的分析可以得到該位置處所含物質(zhì)的多種信息，如分子結(jié)構(gòu)、主要官能團(tuán)及在該部位的含量分布等。對紅外成像圖進(jìn)行分析時，需選擇某一化學(xué)官能團(tuán)的特定紅外吸收波長，以該波長處的紅外吸收強(qiáng)度特征對應(yīng)相應(yīng)的官能團(tuán)在該部位的空間分布[11]。目前，此項技術(shù)已用于刑事偵查、材料學(xué)[12]、地質(zhì)學(xué)[13]等領(lǐng)域，在生物和醫(yī)學(xué)方面的研究也有一定程度的進(jìn)展，但鮮少應(yīng)用在中藥鑒別研究中。與傳統(tǒng)技術(shù)相比，顯微紅外成像技術(shù)可以簡化樣品制備過程，無分離提取等復(fù)雜處理方法，減少對樣品成分的破壞[14]。因此，本研究使用顯微紅外成像技術(shù)對黃精進(jìn)行鑒別研究。

1 材料

1.1 儀器

Nicolet iS10 MX 型傅里葉紅外光譜儀（Thermo Fisher Scientific公司，包括MCT/A型檢測器）；BaF2窗片（13 mm×2 mm，森瑞科貿(mào)有限公司）；CM1850 UV型冰凍切片機(jī)（Leica 公司）；OMNIC 9.0 紅外光譜分析軟件（Thermo Nicolet公司）。

1.2 樣品

黃精藥材均經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)劉守金教授鑒定，具體信息見表1。

表1 黃精樣品信息

2 方法

2.1 樣品制備與測定

2.1.1紅外光譜 將黃精干燥后粉碎，過80 目篩，取樣品粉末適量，置于紅外光譜-金剛石衰減全反射附件Smart iTR的金剛石表面，攤平，旋轉(zhuǎn)附件旋鈕將樣品固定并壓成透明薄片。紅外光譜波數(shù)為4000～675 cm-1，掃描數(shù)為16次。

2.1.2顯微紅外成像光譜 采用冷凍切片機(jī)對新鮮黃精的根莖進(jìn)行切片，切片厚度為30 μm。切好后轉(zhuǎn)移至BaF2窗片上，將窗片放置載物臺上并優(yōu)化聚光鏡高度。選擇實(shí)驗條件（透射，顯微鏡光欄為50 μm×50 μm，光譜波數(shù)為4000～675 cm-1，光譜分辨率為8 cm-1，掃描次數(shù)2 次），紅外成像對選定的樣品區(qū)域進(jìn)行點(diǎn)對點(diǎn)作圖，進(jìn)而對樣品進(jìn)行掃描。

3 結(jié)果與討論

3.1 不同產(chǎn)地多花黃精的顯微紅外圖像研究

采用傳統(tǒng)的傅里葉紅外光譜法對不同產(chǎn)地的黃精進(jìn)行分析，見圖1。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地多花黃精的主要吸收峰波數(shù)在3370、2920、2550、2150、1620、1410、1240、1018、930、860、811 cm-1附近，其中3400～3200 cm-1的強(qiáng)寬吸收峰是分子間以氫鍵O-H結(jié)合而產(chǎn)生的伸縮振動吸收峰[15]；2920 cm-1附近出現(xiàn)的中等強(qiáng)度信號峰為飽和C-H伸縮振動峰[16]；1410 cm-1附近為C-H 彎曲振動[17]；1300～550 cm-1為糖類、皂苷類等物質(zhì)的特征性信號吸收區(qū)[18]。以上特征吸收峰的存在說明多花黃精中含有豐富的多糖及甾體皂苷類物質(zhì)。《中華人民共和國藥典》2020年版以葡萄糖作為對照品測定黃精中的多糖含量[19]，1018 cm-1附近的吸收峰為葡萄糖四氫吡喃環(huán)的C-O-C振動吸收峰，所以將1018 cm-1附近的吸收峰強(qiáng)度作為黃精化學(xué)成分中糖類含量的判斷。由圖1 可以看出，不同產(chǎn)地多花黃精均在1018 cm-1附近有明顯吸收峰，僅有部分位置和形狀發(fā)生變化，特征峰變化不明顯，表明其主要化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)無明顯區(qū)別，但成分含量可能有所差異。

圖1 不同產(chǎn)地多花黃精紅外光譜

采用紅外光譜法僅能定性研究不同產(chǎn)地多花黃精的差異，靈敏度不高，不能直觀體現(xiàn)其化學(xué)成分的差異。采用顯微紅外成像光譜測定7 個不同產(chǎn)地多花黃精樣品，見圖2。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地黃精樣品多糖含量和分布有明顯差異。不同產(chǎn)地多花黃精的多糖類成分在皮層均有所分布，以貴州省銅仁市樣品的多糖含量最高，且主要分布在下部中心位置；其次為黃山市祁門縣和湖北省赤壁縣樣品，多糖類成分分布較為均勻；浙江省天目山樣品的多糖類成分主要分布在皮層，由皮層至內(nèi)部含量逐漸減少；湖南省懷化市和江西省瑞昌市樣品多糖類成分總體分布較為均勻，且在外皮層有所積累；貴州省六盤水市樣品多糖類成分含量最低，僅在外皮層有少量分布。不同地方地理形貌不同，受到不同地勢的地理位置、經(jīng)緯度、水肥、光照等環(huán)境因素的影響，使得不同產(chǎn)地的同一藥材化學(xué)成分含量可能存在差異。吳其國等[20]發(fā)現(xiàn)，環(huán)境因子中活動積溫與黃精多糖含量呈顯著相關(guān)，故不同產(chǎn)地的溫度差異也是造成多糖含量差異的因素。

圖2 不同產(chǎn)地多花黃精顯微紅外圖像

3.2 不同種黃精的顯微紅外圖像研究

由圖3 可知，不同種黃精的紅外光譜主要吸收峰與不同產(chǎn)地多花黃精紅外吸收峰類似，且黃精屬各種之間吸收峰也大致類似，不能直觀地看出其化學(xué)成分的差異。

圖3 不同種黃精紅外光譜

由圖4 可知，不同黃精的多糖類成分含量具有差異。黃精中多糖類成分主要在皮層積累較多，內(nèi)部也有分布，自皮層向內(nèi)部逐漸減少；長梗黃精中多糖類成分大量積累在皮層位置，內(nèi)部組織也有少量分布；輪葉黃精和滇黃精中多糖類成分主要分布在外皮層，內(nèi)部基本組織也有分布，分布均勻但含量較少；多花黃精中多糖類成分含量較少，且主要分布在外皮層。程銘恩等[6]發(fā)現(xiàn)黃精屬植物中僅黏液細(xì)胞里含有多糖類化合物，由于黏液細(xì)胞在不同屬的黃精根狀莖中分布和數(shù)目不等，所以黃精屬植物的多糖類成分有明顯差異。

圖4 不同種黃精顯微紅外圖像

4 結(jié)論

本研究通過顯微紅外成像光譜法，以多糖物質(zhì)作為評價指標(biāo)，對7種不同產(chǎn)地的多花黃精和5個不同黃精屬植物進(jìn)行鑒別研究。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地多花黃精及不同黃精屬植物之間多糖類成分有明顯的差異。與傳統(tǒng)傅里葉紅外光譜技術(shù)和普通顯微鑒別技術(shù)相比，顯微紅外成像技術(shù)可研究黃精主要成分在不同掃描微區(qū)的分布情況，既能對黃精植物根莖橫切面的局部形狀面貌進(jìn)行顯微成像，也能顯示出根莖橫切面空間各位置的紅外光譜信息，使其不同形貌和含量分析表達(dá)更加直觀，具有圖譜合一、可視性高和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)[21]。顯微紅外成像技術(shù)對中藥材的研究具有直觀、無損、快速的特點(diǎn)，使其在中藥研究領(lǐng)域有很高的潛力和可實(shí)現(xiàn)性，也為中藥材的鑒別和含量分析提供了新的思路。由于樣品收集時間有限，故本實(shí)驗研究的樣本較少，在今后的工作中將加大樣本量，并增加量化指標(biāo)的檢測，為本方法的應(yīng)用提供更加充足的依據(jù)。