童凱，李素峰，賴鑫，趙佳，鐘偉萍，田孟良，張?chǎng)?，李東*

1.四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院/釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130；3.巴中市綠色農(nóng)業(yè)創(chuàng)新研究院，四川 巴中 636000；4.四川省中醫(yī)藥發(fā)展服務(wù)中心，四川 成都 610011

川牛膝Cyathula officinalisKuan是我國(guó)常見(jiàn)川產(chǎn)道地中藥材之一，也是原中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)可以用于保健食品生產(chǎn)的中藥材原料之一，具有逐瘀通經(jīng)、通利關(guān)節(jié)、利尿通淋的功效。截至2017年10 月，全國(guó)已注冊(cè)的含“牛膝”類（川牛膝或懷牛膝Achyranthes bidentataBl.）的保健食品共44 個(gè)，涉及的功能主要包括增強(qiáng)免疫力、增加骨密度、緩解疲勞等，涉及的劑型有膠囊劑、酒劑、片劑、顆粒劑等，其中酒類劑型約占總數(shù)的18%，是繼膠囊劑后的最常見(jiàn)劑型[1]。在中藥藥品生產(chǎn)或中藥保健食品生產(chǎn)中，川牛膝通常需要經(jīng)過(guò)酒制處理以達(dá)到增進(jìn)功效的目的[2]。中醫(yī)認(rèn)為，藥材經(jīng)酒制處理后可增加或增強(qiáng)其上行、行散的功效，以及祛寒、去腥、助溶、減少不良反應(yīng)等作用[3]。但是關(guān)于酒制處理對(duì)川牛膝化學(xué)成分譜的具體影響尚不明確，這限制了川牛膝酒制工藝的改進(jìn)和產(chǎn)品質(zhì)量控制水平的提升[4]。近年來(lái)，從化學(xué)成分角度的研究發(fā)現(xiàn)，酒制后川牛膝中除阿魏酸含量略有升高外[5]，其他已知的功效成分，如杯莧甾酮、大豆苷元、葛根素等含量均未出現(xiàn)顯著提升[6]。這提示酒制處理對(duì)川牛膝成分譜的影響研究還需要進(jìn)一步篩選鑒定新的質(zhì)量控制指標(biāo)成分。因此，本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜法（GCMS）聯(lián)合主成分分析（PCA）、偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）及系統(tǒng)聚類分析多變量統(tǒng)計(jì)分析方法，對(duì)川牛膝酒制前后的化學(xué)成分進(jìn)行測(cè)定和分析，以期篩選出更多差異性成分，為含酒制川牛膝的中藥藥品或保健食品的深入開(kāi)發(fā)和質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

7890型氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；Heraeus Fresco 17 型冷凍離心機(jī)（美國(guó)賽默飛科技有限公司）；JXFSTPRP-24 型研磨儀（上海凈信科技有限公司）；D24 UV 型純水儀（德國(guó)密理博有限公司）；PS-60AL 型超聲儀（深圳市雷德邦電子有限公司）；DHG-9023A 型烘箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；LNG-T98 型真空干燥儀（太倉(cāng)市華美生化儀器廠）。

1.2 試藥

川牛膝藥材采集自四川省雅安市寶興縣蜂桶寨鄉(xiāng)，經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)田孟良教授鑒定為莧科植物川牛膝Cyathula officinalisKuan的根。

色譜純甲醇（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；色譜純乙醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；色譜純?nèi)燃淄?、吡啶（上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司）；甲氧胺鹽酸鹽[梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司]；三氟乙酰胺（BSTFA，含1%氯三甲基硅烷，美國(guó)Regis公司）；對(duì)照品核糖醇（貨號(hào)：A5502-5G，純度≥99%，美國(guó)Sigma公司）。

2 方法

2.1 藥材處理

取川牛膝新鮮根，除去雜質(zhì)和蘆頭，洗凈、潤(rùn)透、切薄片，于65 ℃烘干即得生川牛膝。取生川牛膝50 g，按1∶5 加入無(wú)水乙醇，參照《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020 年版（四部）附錄（炮制通則）制成酒川牛膝[7]。合計(jì)制備生川牛膝和酒川牛膝各6批，分別編號(hào)C1～C6（生品）和P1～P6（酒制品），烘干后粉碎過(guò)20 目篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 分析樣品的制備

分別精密稱取生川牛膝和酒川牛膝樣品50 mg，加入75%甲醇450 μL，加入核糖醇（內(nèi)標(biāo)物）10 μL，瓷珠研磨儀處理4 min（45 Hz），冰水浴條件下超聲提取5 min（40 kHz，600 W），4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min（離心半徑為10 cm），取上清液，置于真空濃縮器中干燥。然后在干燥后的提取物中加入甲氧胺鹽試劑（20 mg·mL-1，甲氧胺鹽酸鹽溶于吡啶）80 μL，輕輕混勻后，放入烘箱中80 ℃孵育30 min。向每個(gè)樣品中加入BSTFA 100 μL，將混合物于70 ℃孵育1.5 h；冷卻至室溫，即得供試品溶液。從各批次樣品中等比例取適量樣品混勻，即得質(zhì)量控制樣品（QC1～QC3）。

2.3 檢測(cè)條件

色譜 柱：Agilent DB-5MS（30 m × 250 μm，0.25 μm）；載氣：氦氣；進(jìn)樣量：1 μL，不分流進(jìn)樣；隔墊吹掃流速：3 mL·min-1；柱流速：1 mL·min-1；柱箱升溫程序：起始溫度50 ℃，保持1 min，以10 ℃·min-1速度升高至310 ℃，保持8 min；前進(jìn)樣口溫度：280 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；離子源溫度：250 ℃；電離電壓：-70 eV；質(zhì)量范圍：m/z50～500。

2.4 數(shù)據(jù)處理

使用Chroma TOF 4.3x 軟件對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對(duì)齊等分析。使用LECO-Fiehn Rtx 5 數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)質(zhì)譜匹配及保留時(shí)間指數(shù)匹配對(duì)檢出物質(zhì)進(jìn)行初步定性。使用MetaboAnalyst 5.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理和PCA、PLS-DA和系統(tǒng)聚類分析等。

3 結(jié)果與分析

3.1 檢測(cè)結(jié)果質(zhì)量控制分析

3 個(gè)QC 樣品按上述方法進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（核糖醇）在3 個(gè)QC 樣品中的峰面積RSD 為6.67%，計(jì)算3 個(gè)QC 樣品所有峰面積的數(shù)據(jù)相關(guān)系數(shù)，平均為0.97，以上提示檢測(cè)數(shù)據(jù)重現(xiàn)性較好，儀器運(yùn)行和數(shù)據(jù)采集穩(wěn)定，進(jìn)一步說(shuō)明整個(gè)方法穩(wěn)定性較好，數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，可以用于后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析。

3.2 酒制前后成分譜輪廓比較

經(jīng)GC-MS 檢測(cè)后，從總離子流圖（圖1）可以看出，川牛膝生品和酒制品的化學(xué)成分譜輪廓總體相似，難以從直觀上判別兩者的區(qū)別。圖中未明顯觀察到有新成分的大量生成或原成分的大量消失，但部分離子峰強(qiáng)度可能發(fā)生了顯著的變化，提示需要更加細(xì)致的數(shù)據(jù)分析。

圖1 川牛膝樣品GC-MS總離子流圖

因此，對(duì)各色譜峰進(jìn)行掃描后，從12 個(gè)供試樣品和3 個(gè)QC 樣品中共提取出646 個(gè)物質(zhì)信號(hào)。采用無(wú)監(jiān)督分析模式的PCA，對(duì)所有樣品酒制前后的全部物質(zhì)峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分析提取出的前2 個(gè)主成分PC1 和PC2 共表征了原始數(shù)據(jù)集39%的變異信息。在PC1 和PC2 構(gòu)成的二維得分圖上，來(lái)自于同一組別的樣本具有相對(duì)集中的分布趨勢(shì)，而C 組和P 組之間有較明顯的分離分布趨勢(shì)（圖2），這說(shuō)明酒制處理對(duì)川牛膝的總體成分輪廓具有明顯的影響，而且這種影響并不僅針對(duì)少數(shù)指標(biāo)成分，而是針對(duì)多成分的總體影響。因此，有必要采用更細(xì)致的分析方法進(jìn)一步篩選造成炮制前后成分譜差異的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)。除此之外，在主成分得分圖上，3 個(gè)QC 樣品的分布相對(duì)集中，這進(jìn)一步說(shuō)明所建立的檢測(cè)方法穩(wěn)定可靠。

圖2 酒制前后川牛膝樣品差異成分的PCA

3.3 酒制前后差異變化成分篩選

根據(jù)質(zhì)譜匹配相似度及保留時(shí)間指數(shù)匹配對(duì)檢出物質(zhì)進(jìn)行初步定性，一共初步鑒定60 個(gè)化學(xué)成分（表1），主要涉及有機(jī)酸、脂肪酸、糖類、氨基酸類等，根據(jù)酒制前后峰面積進(jìn)行相對(duì)定量比較，有18 個(gè)成分顯示升高，42 個(gè)成分顯示下降，其中山梨醇、氧化脯氨酸、4-氨基丁酸、丙氨酸、丙三醇峰面積發(fā)生顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 川牛膝酒制前后GC-MC檢出成分及其峰面積變化趨勢(shì)

續(xù)表1

利用上述60 個(gè)已鑒定成分的峰面積數(shù)據(jù)，并將各供試川牛膝樣本的分組信息納入分析模型，建立有監(jiān)督的PLS-DA 模型。交叉檢驗(yàn)顯示，模型擬合度（R2）=0.94，預(yù)測(cè)度（Q2）=0.54，說(shuō)明建模效果良好。在此基礎(chǔ)上，提取前2 個(gè)主成分繪制得分圖顯示（圖3），C 組和P 組樣本的空間分布仍然可以被明顯地區(qū)分為2 個(gè)集群，說(shuō)明這60 個(gè)已鑒定的成分中包含了可以反映川牛膝酒制前后主要差異的物質(zhì)成分信息。在PLS-DA 模型中，第一主成分的變量重要性投影（VIP）值是篩選差異貢獻(xiàn)成分的常用參數(shù)[8-9]，VIP 值＞1 則可視為對(duì)于樣本分組具有顯著作用（表1）。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)分析各成分的VIP值最終篩選得到20個(gè)差異貢獻(xiàn)成分，其中包括6個(gè)氨基酸類成分、6 個(gè)糖類成分、4 個(gè)有機(jī)酸類成分、2個(gè)醇類成分、2個(gè)含氮化合物。采用這20個(gè)差異成分的峰面積數(shù)據(jù)對(duì)各樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析（圖4），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C組和P組樣品被分別聚為一組，這提示篩選出的20 個(gè)差異變化成分可以作為區(qū)別川牛膝生品與酒制品的潛在化學(xué)標(biāo)記。

圖3 酒制前后川牛膝樣品差異成分的PLS-DA

圖4 川牛膝酒制前后20個(gè)差異貢獻(xiàn)成分相對(duì)含量變化

4 討論

中藥飲片是中成藥和中藥保健食品的直接原料。2019 年針對(duì)全國(guó)中藥飲片質(zhì)量的抽檢結(jié)果表明，炮制不規(guī)范、加工不到位的問(wèn)題較多，進(jìn)而對(duì)中藥產(chǎn)品的安全性和有效性形成潛在威脅，這與中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究滯后密切相關(guān)[10]。在《中國(guó)藥典》2020 年版中，川牛膝無(wú)論酒制與否均以杯莧甾酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于0.03%作為含量測(cè)定項(xiàng)的質(zhì)量控制指標(biāo)，缺乏針對(duì)酒制飲片的專屬質(zhì)量控制指標(biāo)?？紤]到中藥產(chǎn)品化學(xué)成分的復(fù)雜性，以及中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑作用的特點(diǎn)，以揭示中藥化學(xué)成分總體輪廓特征為目標(biāo)的化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)被廣泛用于中藥加工品的鑒別研究[11-12]。本研究建立的GC-MS從成分整體特征角度將生品與酒制品區(qū)分開(kāi)來(lái)，可以為評(píng)價(jià)川牛膝酒制品提供參考。

酒制法作為一種常用的中藥材加工方法，在中醫(yī)臨床上通常用以達(dá)到引藥上行，增強(qiáng)祛風(fēng)通絡(luò)、矯味矯臭的作用，其原理一般可從藥性、成分、藥理等方面進(jìn)行闡釋[13]。相關(guān)研究表明，酒制可以顯著影響藥材中有機(jī)酸、糖苷、氨基酸、生物堿、黃酮、萜類等多種成分的轉(zhuǎn)化和積累[14-16]，藥材中的氨基化合物（蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸等）和羰基化合物（還原糖、不飽和脂肪酸、醛、酮等）在炮制時(shí)經(jīng)縮合、聚合等復(fù)雜反應(yīng)而生成類黑精物質(zhì)的過(guò)程，即美拉德反應(yīng)，可能在中藥的品質(zhì)形成和調(diào)控中發(fā)揮重要作用[17]。美拉德反應(yīng)不僅能改變中藥的色澤、香味，延長(zhǎng)中藥的貨架期和保質(zhì)期，還可能產(chǎn)生新的活性物質(zhì)[18]。在本研究中，利用GC-MS 結(jié)合PLSDA等分析方法，分析川牛膝酒制前后化學(xué)成分的變化，一共篩選鑒定了20 個(gè)主要的差異變化成分，其中多數(shù)為美拉德反應(yīng)底物（如糖類和氨基酸類），這提示美拉德反應(yīng)可能是酒制川牛膝品質(zhì)形成的重要因素。