陳愛娟，蔣春波，陳 偉，胡 芳

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215009)

宮頸癌是當(dāng)前第二常見的女性癌癥[1],全球每年有超過53萬的新發(fā)病例和超過20萬的死亡病例[2-3]。近年來,宮頸癌在發(fā)展中國家的發(fā)病率正在逐年上升，且患者越來越年輕化[4-5]。對于大多數(shù)早期宮頸癌患者，普遍可以通過自身免疫、根治性手術(shù)及放化療治愈，而對于預(yù)后仍較差的晚期宮頸癌患者，則將化療方案作為主要治療手段[6]。許多研究者一直在努力尋找更有效的化療藥物來治療宮頸癌。

宮頸癌的發(fā)病因素較多，其中人乳頭瘤病毒(HPV)是主要致病因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，超過70%的病例均與HPV感染相關(guān)[7-10]。細(xì)胞凋亡是一種由基因網(wǎng)絡(luò)控制的細(xì)胞自殺形式，也是包括癌癥在內(nèi)諸多疾病發(fā)病機(jī)制中必不可少的過程和關(guān)鍵因素。通過藥物促進(jìn)細(xì)胞凋亡來抑制惡性細(xì)胞增殖是一種有效的治療手段[11-14]。然而，許多臨床抗癌藥物所引發(fā)的不良反應(yīng)和耐藥性難以解決。因此，需要尋找并開發(fā)更加安全、有效的抗癌藥物來治療宮頸癌。

火炭母是蓼科植物火炭母的地上部分，主要分布在廣東、廣西、福建、海南等地，火炭母在華南地區(qū)通常作為原材料被用于涼茶制作，但其也是一種傳統(tǒng)中藥[15-16]。火炭母含有酚酸類、黃酮類等化學(xué)成分，具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗氧化等[17]。已有的研究表明，植物中的酚酸具有抗腫瘤作用，如四棱草中的有機(jī)酸對人肝癌有抑制作用，水懸鉤子對人乳腺腫瘤有抑制作用，而樺樹皮中的白樺酸則對宮頸上皮腫瘤有抑制作用[18]。

研究發(fā)現(xiàn)，火炭母在肝癌和結(jié)直腸癌中具有抗腫瘤活性[19]，但少見火炭母抗宮頸腫瘤作用的相關(guān)報(bào)道。本研究以宮頸上皮鱗狀癌SiHa細(xì)胞為研究對象，考察火炭母指標(biāo)性酚酸柯里拉京對SiHa細(xì)胞增殖抑制作用及誘導(dǎo)凋亡機(jī)制，以期發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性的新物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 火炭母(蘇州春暉堂中藥飲片有限公司，批號20200926)，柯里拉京(南京金益佰生物科技有限公司，批號20190311)，Cell Counting Kit-8(CCK8，碧云天生物技術(shù)有限公司)，SiHa細(xì)胞(ATCC細(xì)胞庫)，磷酸緩沖鹽溶液(PBS，美國Giboco公司)，DMEM(美國Giboco公司)，胎牛血清(美國Giboco公司)，青霉素/鏈霉素雙抗(美國Giboco公司)，胰蛋白酶(美國Giboco公司)，細(xì)胞凋亡流式試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)，P53、Bax、Bcl2、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、caspase-9、β-actin(英國Abcam公司)，甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、甲酸(美國霍尼韋爾公司)。

1.1.2儀器 Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters 公司)，Triple TOFTM5600質(zhì)譜儀(美國AB 公司),MS105十萬分之一分析天平(瑞士Mettler Toledo)，Milli-Q3超純水系統(tǒng)(美國 Millipore 公司)，HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金怡儀器科技有限公司)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，倒置相差光學(xué)顯微鏡及倒置相差熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，DNM9602A酶標(biāo)分析儀(美國Molecular Devices公司)，超低溫冰箱(青島海爾公司)，移液槍(Eppendorf公司)。

1.2方法

1.2.1火炭母不同溶劑提取物制備 稱取火炭母藥材，打成粗粉，稱取3份，每份 50 g，精密稱定，分別置于圓底燒瓶中，分別加入500 mL水、乙醇、氯仿進(jìn)行提取，均進(jìn)行回流提取，提取2次，每次1 h。提取完畢后分別合并2次提取液，經(jīng)真空濃縮后冷凍干燥，分別得到火炭母水提、醇提、氯仿提的干燥提取物，干燥物分別以DMSO溶解，配制成5、10、25、50、100 μg/mL的溶液。

1.2.2柯里拉京溶液制備 稱取柯里拉京對照品適量，精密稱定，置于容量瓶中，加入DMSO溶解，配制成1 mg/mL的對照品儲備液。以DMSO依次稀釋配制成5、10、25、50、100 μg/mL的溶液，備用。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮中取出裝有宮頸上皮鱗狀癌SiHa細(xì)胞的凍存管，置于37 ℃的水浴環(huán)境中解凍，待細(xì)胞融化完全，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，1 000 r/min離心10 min，小心去除上清液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至25T培養(yǎng)瓶中。加入含10%胎牛血清青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL的DMEM完全培養(yǎng)液，將細(xì)胞在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每天在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞變圓或間隙增大時棄去原有培養(yǎng)液，更換新的DMEM培養(yǎng)液，待細(xì)胞長至80%進(jìn)行傳代培養(yǎng)[20]。

1.2.4CCK8檢測SiHa細(xì)胞的增殖抑制 取對數(shù)生長期細(xì)胞，采用0.25%的胰酶消化輕吹單細(xì)胞懸浮后計(jì)數(shù)，以5 000個/孔的細(xì)胞濃度接種于96孔板，每孔100 μL，同時設(shè)空白孔。過夜待細(xì)胞貼壁。在顯微鏡下對細(xì)胞進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞完全貼壁生長后，小心吸棄培養(yǎng)基，再向每個孔中加入20 μL不同水平的柯里拉京溶液處理SiHa細(xì)胞，水平梯度設(shè)置為0(DMSO)、10、25、50、75、100 μmol/L,另設(shè)空白對照組。每組平行設(shè)置5個復(fù)孔，置于37 ℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h。隨后去除原有培養(yǎng)基，隨后每孔加入90 μL完全培養(yǎng)基和10 μL CCK8試劑，37 ℃環(huán)境下孵育1 h。使用酶標(biāo)儀于450 nm處檢測吸光度(A值)，實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次，計(jì)算抑制率。其中，抑制率=(A加藥-A空白)/(A0給藥-A空白)×100%；A加藥為細(xì)胞溶液、CCK8溶液和藥物溶液的A值；A0給藥為有細(xì)胞溶液、CCK8溶液，但沒有藥物溶液孔的A值；A空白為培養(yǎng)基、CCK8溶液、無細(xì)胞空白孔的A值。

1.2.5火炭母水提液液質(zhì)聯(lián)用色譜分析 對火炭母水提取物進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用色譜分析。取火炭母水提取物干粉，DMSO溶解，經(jīng)0.25 μm微孔濾膜過濾，調(diào)整進(jìn)樣濃度為1 mg/mL。采用0.2%(v/v)甲酸水(A)-乙腈(B)為流動相進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫條件見表1，流速為1.0 mL/min，檢測波長為365 nm。進(jìn)樣量為2 μL，柱溫為30 ℃。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)；正離子模式檢測；質(zhì)量掃描范圍m/z為50～2 000；噴霧電壓為5 500 V；解簇電壓為100 V；去簇電壓為40 V；裂解電壓為20 V；離子源溫度為600 ℃；霧化器為60 psi(1 psi=6.895 kPa)；輔助加熱器為60 psi；氣簾氣為40 psi。

表1 梯度洗脫程序

2 結(jié) 果

2.1火炭母對SiHa細(xì)胞增殖的抑制作用 火炭母水提液對SiHa細(xì)胞增殖的抑制作用較強(qiáng)，見圖1。

圖1 火炭母不同溶劑提取物對SiHa細(xì)胞增殖的抑制作用

2.2火炭母水提液液質(zhì)聯(lián)用色譜分析 火炭母不同溶劑提取物經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用分析發(fā)現(xiàn)，三氯甲烷中的提取成分最少；其次為乙醇，乙醇提取物色譜峰與水提成分重疊，且水提液中色譜峰的豐度遠(yuǎn)高于乙醇提取物。對火炭母的水提液進(jìn)行液質(zhì)分析，經(jīng)數(shù)據(jù)庫與文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，火炭母水提液中解析出了12種成分，其中主要為酚酸類物質(zhì)(訶子酸、檸檬酸、沒食子酸、綠原酸、短葉蘇木酚酸、柯里拉京、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、鞣花酸、二氫楊梅素、槲皮素、Enyssoside、3,3-二甲基鞣花酸)，見圖2、表2。

表2 火炭母水提液解析成分表

2.3柯里拉京對SiHa細(xì)胞增殖的抑制作用 不同濃度的柯里拉京均對SiHa細(xì)胞增殖具有抑制作用(圖3)，隨著柯里拉京濃度與作用時間的增加，其對SiHa細(xì)胞增殖的抑制作用加強(qiáng)，呈量效依賴關(guān)系。柯里拉京對SiHa細(xì)胞增殖的抑制作用在72 h時最強(qiáng)，24 h的IC50為(42.50±0.38)μmol/L，48 h的IC50為(33.20±0.21)μmol/L，72 h的IC50為(26.30±0.15)μmol/L。因此，可選擇48 h作為給藥孵育時間并用于后續(xù)的凋亡研究。

圖3 柯里拉京對SiHa細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)

2.4柯里拉京誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞凋亡結(jié)果 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的柯里拉京(0、25、50、75 μmol/L)作用于SiHa細(xì)胞48 h后，SiHa細(xì)胞凋亡率顯著增加，75 μmol/L的柯里拉京誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞凋亡率增加到55.73%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與柯里拉京0 μmol/L組比較，SiHa細(xì)胞凋亡率表現(xiàn)出劑量依賴性，隨濃度上升而顯著升高，呈現(xiàn)時效與量效關(guān)系。柯里拉京誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在G2阻滯期，見圖4。

圖4 流式細(xì)胞檢測柯里拉京誘導(dǎo)SiHa凋亡

3 討 論

據(jù)估計(jì)，30%～40%的癌癥可以通過飲食和生活方式預(yù)防。目前，臨床上使用的某些抗癌藥物，如紫杉醇和喜樹堿，均是從天然產(chǎn)物中提取。由于天然產(chǎn)物的多樣性和獨(dú)特的作用機(jī)制，尋找具有抗癌活性的天然產(chǎn)物成為一個值得探索的領(lǐng)域。植物酚酸廣泛存在于中草藥中，是一類具有潛在抗腫瘤活性的化合物，例如茶葉中的茶多酚已被多次證實(shí)具有抗腫瘤效應(yīng)。

本研究發(fā)現(xiàn)，火炭母水提液對宮頸癌細(xì)胞的體外抑制作用最佳。對其進(jìn)行液質(zhì)色譜分析，發(fā)現(xiàn)火炭母水提液中主要為酚酸性物質(zhì)，柯里拉京是多羥基酚酸的代表性成分。本研究選取了火炭母中的柯里拉京為研究對象，發(fā)現(xiàn)其對人宮頸上皮鱗狀癌SiHa細(xì)胞具有潛在的抗增殖活性。通過流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)，柯里拉京可以將SiHa阻滯在G2期，從而抑制SiHa細(xì)胞增殖?？吕锢┑目鼓[瘤活性可能通過2個方面來實(shí)現(xiàn)：(1)抑制細(xì)胞無序增殖的關(guān)鍵蛋白(例如P21)；(2)重新激活細(xì)胞正常凋亡通路關(guān)鍵蛋白(例如P53)，重新引導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡，但具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究確定。

火炭母中富含酚酸類物質(zhì)，其中多羥基酚酸具有類似的骨架結(jié)構(gòu)。但是作者未研究柯里拉京對正常宮頸細(xì)胞的細(xì)胞毒性，后續(xù)還需要明確柯里拉京是通過何種通路誘導(dǎo)SiHa凋亡?；鹛磕杆嵋褐械目吕锢╇m然對SiHa細(xì)胞有較好的體外抑制作用，然而柯里拉京是否可以聯(lián)合應(yīng)用于手術(shù)、放化療中，在臨床輔助治療宮頸癌，還需要進(jìn)一步的離體、在體試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)。此外，仍需要分析火炭母中其他類似結(jié)構(gòu)的酚酸，以及火炭母中與柯里拉京骨架結(jié)構(gòu)類似的化合物是否具有相應(yīng)的活性。