韋良臣，楊 琪，曾 暉，翁 鑒，劉 佩，康 斌，鐘華戈，于 斐△

(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科，廣東 深圳 518036；2.骨科生物材料國家地方聯(lián)合工程研究中心，廣東 深圳 518036；3.北京大學(xué)深圳醫(yī)院超聲診斷科，廣東 深圳 518036；4.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胃腸外科，廣西 南寧 530021)

周圍神經(jīng)損傷是指周圍神經(jīng)干及其分支受到直接或間接創(chuàng)傷后發(fā)生的損傷，常見于體力勞動者，致傷原因包括解剖性原因和損傷性原因。解剖性原因是解剖異常引起周圍神經(jīng)的卡壓性損傷；損傷性原因主要由于機械性原因(切割、擠壓)、物理性原因(凍傷、燙傷)、缺血性原因(栓塞)、醫(yī)源性原因(注射、手術(shù))及代謝、腫瘤等造成[1]，可導(dǎo)致軀體的運動、感覺及自主神經(jīng)功能障礙等一系列癥狀。周圍神經(jīng)損傷的治療效果常難以估計，受到損傷部位、損傷原因、機體狀況等多種因素影響，若治療不及時，往往會導(dǎo)致不良后果，嚴重者甚至?xí)?dǎo)致殘疾，這使得周圍神經(jīng)損傷成為骨科醫(yī)生的棘手問題。周圍神經(jīng)損傷可通過藥物、電刺激等非手術(shù)方法和手術(shù)方法治療[2]。隨著醫(yī)學(xué)發(fā)展，越來越多的神經(jīng)相關(guān)因子被證實與周圍神經(jīng)損傷修復(fù)相關(guān)，例如傳統(tǒng)的神經(jīng)生長因子、睫狀神經(jīng)生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子等[3]，均可促進周圍神經(jīng)損傷后的修復(fù)。許多新的因子也能有效實現(xiàn)功能，例如Wnt5a因子[4]。

Wnt5a因子是非經(jīng)典Wnt信號通路的代表性配體，首先于20世紀90年代被發(fā)現(xiàn)，其基因含有5個外顯子，起始的631 bp有很強的啟動子活性[5]。研究顯示，Wnt5a因子可以通過自身所在的非經(jīng)典Wnt信號通路、核因子-κB(NF-κB)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路等[6]，參與到骨科相關(guān)疾病如周圍神經(jīng)損傷、骨關(guān)節(jié)炎、骨缺損修復(fù)等[7]的進程中。雪旺細胞是周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，延神經(jīng)元的突起分布，包裹在神經(jīng)纖維上形成有髓神經(jīng)纖維，是周圍神經(jīng)疾病中研究較多的一種細胞。RSC96細胞是一種細胞系，經(jīng)大鼠原代培養(yǎng)的雪旺細胞長時間培養(yǎng)后自發(fā)轉(zhuǎn)化而形成，呈貼壁樣生長，能夠表達原代雪旺細胞的部分特性，常常用于周圍神經(jīng)損傷相關(guān)的疾病研究中，以代替原代雪旺細胞。

慢病毒載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒為基礎(chǔ)發(fā)展起來的一種病毒載體，對多種細胞均具有感染能力，被廣泛應(yīng)用于表達RNAi的動物及細胞實驗中。該病毒可以將外源性基因穩(wěn)定地整合到宿主細胞的染色體上，從而形成可以傳代且表達穩(wěn)定的外源性基因子代細胞，與只能實現(xiàn)瞬轉(zhuǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體比較有較大優(yōu)勢，也較多地被應(yīng)用于骨科相關(guān)研究中[8]。目前，少見學(xué)者對RSC96雪旺細胞中應(yīng)用Wnt5a基因慢病毒進行感染的細胞模型進行報道。本研究中，作者構(gòu)建出大鼠Wnt5a基因慢病毒，用其感染RSC96雪旺細胞，觀察慢病毒感染情況，檢測細胞中Wnt5a mRNA的表達情況，從而建立相關(guān)細胞模型，為骨科研究周圍神經(jīng)損傷等相關(guān)疾病提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞 RSC96雪旺細胞系(中國科學(xué)院上海細胞庫)；293T細胞(上海細胞所)；Top10感受態(tài)細胞(Genechem公司)。

1.1.2主要試劑 人類免疫缺陷病毒(HIV)-1 p24 Antigen 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 2.0試劑盒(北京達科為生物技術(shù)有限公司)；蘇木素、伊紅(北京益利精細化學(xué)品有限公司)；Bulge-LoopTMmiRNA 定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR) Primer試劑盒(廣州銳博公司)；Trizol(上海普飛公司)；oligo dT(上海生工公司)；嘌呤霉素(Clontech公司、Sigma公司)；NormalRunTM250 bp-Ⅱ DNA Ladder(GeneRay公司)；限制性核酸內(nèi)切酶(NEB公司)；dNTPs、M-MLV試劑盒、RNA酶抑制劑(Promega公司)；SYBR Master Mixture(TaKaRa公司)；GeneRuler 1 kb DNA Ladder、T4 DNA連接酶(Thermo Scientific公司)；Taq Plus DNA聚合酶(Vazmye公司)。

1.1.3主要儀器 普通光學(xué)顯微鏡(上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司)；倒置顯微鏡(上海蔡康光學(xué)儀器有限公司)；數(shù)顯式穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、凝膠成像儀(上海天能公司)；Blue Pard隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；生物安全柜(上海振樣創(chuàng)空氣凈化設(shè)備有限公司)；超凈工作臺(蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司、Thermo Scientific公司)；熒光顯微鏡(奧林巴斯公司)；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(Applied Biosystems 公司)；反轉(zhuǎn)錄耗材(Axygen公司)；超速離心機(Beckman Coulter公司、Eppendorf公司)；移液器(Eppendorf公司、吉爾森有限公司)；超細勻漿機(FLUKO公司)；細菌搖床(華利達實驗設(shè)備公司)；測序儀(美季生物公司)；細胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司、SANYO公司)；Celigo(Nexcelom公司)；Real time PCR儀器(Roche公司)；高速離心機、Nanodrop分光光度計(Thermo Scientific公司)。

1.2方法

1.2.1RSC96雪旺細胞的HE染色 取適宜量的RSC96雪旺細胞接種于3 cm培養(yǎng)皿，待細胞接近長滿進行染色；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗5 min，2次；4%多聚甲醛固定60 min；PBS沖洗5 min，2次；蘇木素浸染3 min，水洗；伊紅浸染1 min，水洗；普通光學(xué)顯微鏡下拍照。

1.2.2Wnt5a基因慢病毒載體構(gòu)建 根據(jù)大鼠Wnt5a基因序列設(shè)計一條Wnt5a-RNAi靶點序列GGG TGA TGC AAA TAG GCA G，其中GC含量為52.63%，起始位點為614。采用吉凱基因GV248載體構(gòu)建Wnt5a基因慢病毒框架-a和Wnt5a基因慢病毒框架-b，見表1。引入AgeI和EcoRI作為酶切位點酶切載體，合成單鏈引物后退火形成雙鏈DNA，后用DNA連接酶將雙鏈DNA與酶切后的載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞后挑選陽性克隆的菌落進行PCR鑒定(見表2)，測序測通后抽提合格質(zhì)粒進行后續(xù)實驗。

表1 Wnt5a基因慢病毒框架

表2 陽性克隆PCR鑒定引物

1.2.3Wnt5a基因慢病毒包裝 取293T細胞。離心管中加入含有GV載體質(zhì)粒20 μg、pHelp1.0載體質(zhì)粒15 μg、pHelp2.0載體質(zhì)粒10 μg的各DNA溶液，并與吉凱轉(zhuǎn)染試劑混合調(diào)節(jié)成1 mL，室溫溫育15 min。細胞與溫育后的液體混勻，37 ℃及CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h；PBS洗滌后用10%胎牛血清(FBS)再次于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3 d；上清液于4 000 g及4 ℃條件下離心10 min；濾器過濾后在25 000 r/min及4 ℃條件下離心2 h；棄上清液后用病毒保存液重懸離心沉淀物；10 000 r/min條件下離心5 min分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4Wnt5a基因慢病毒感染RSC96雪旺細胞 采用適宜量的RSC96雪旺細胞鋪12孔板，細胞密度為20%時用Wnt5a基因慢病毒進行感染，重復(fù)感染3次，每次感染3個復(fù)孔，感染復(fù)數(shù)(MOI)為10，感染條件為Eni.S，感染16 h換液，感染72 h進行觀察。

1.2.5感染后RSC96雪旺細胞中Wnt5a mRNA含量檢測 以GAPDH為內(nèi)參(表3)，按照各目的基因退火溫度選擇二步法完成擴增，通過熔解曲線判斷擴增產(chǎn)物特異性，用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析。

表3 Wnt5a及GAPDH引物

2 結(jié) 果

2.1測序測通結(jié)果 根據(jù)測序可見，ccg gca GGG TGA TGC AAA TAG GCA Gct cga gCT GCC TAT TTG CAT CAC CCt gtt ttt g可測通。

2.2構(gòu)建及鑒定Wnt5a基因慢病毒載體 陽性克隆片段及空載體克隆片段在PCR電泳圖中可以清晰看到，見圖1。

1為陰性對照(加入ddH2O)；2為陰性對照(空載自連對照)；3為Marker(自上而下依次為5 kb、3 kb、2 kb、1.5 kb、1 kb、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp)；4～8為Wnt5a基因慢病毒轉(zhuǎn)化子鑒定。

2.3包裝Wnt5a基因慢病毒并進行滴度鑒定 重組的Wnt5a基因慢病毒質(zhì)粒感染293T細胞，倒置熒光顯微鏡下觀察可以看到感染后的293T細胞表達綠色熒光，表示病毒包裝成功(圖2)。

A～H為明場圖片；I～P為熒光場圖片；A～H及I～P的慢病毒量分別為10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6 μL。

2.4RSC96雪旺細胞的形態(tài)學(xué)觀察 普通光鏡下觀察，可以看到RSC96雪旺細胞貼壁后呈梭形、三角形或多角形，細胞擁擠處呈鋪路石樣外觀(圖3A)；蘇木-伊紅(HE)染色后可以看到，RSC96雪旺細胞的細胞核呈較深的粉紅色或紫色，形態(tài)主要為圓形；RSC96雪旺細胞的細胞質(zhì)呈較淺的粉紅色或紫色，形態(tài)與光鏡下觀察類似，呈梭形、三角形或多角形(圖3B)。

A為普通光鏡下觀察；B為HE染色后觀察。

2.5Wnt5a基因慢病毒感染RSC96雪旺細胞 用滴度為109TU/mL的Wnt5a基因慢病毒感染12孔板中生長密度為20%的RSC96雪旺細胞，MOI為10，感染后在Celigo細胞成像分析儀下觀察可以看到，感染后的RSC96雪旺細胞表達綠色熒光，并且可以看到細胞的狀態(tài)較好，沒有污染，見圖4。

2.6感染后RSC96雪旺細胞中Wnt5a基因mRNA表達情況 分別用Wnt5a基因慢病毒感染3次RSC96雪旺細胞，RSC96雪旺細胞中Wnt5a mRNA的表達量分別為0.211±0.028、0.259±0.027、0.148±0.005，平均表達量為0.206±0.056。

A為明視野下的RSC96雪旺細胞；B為熒光視野下的RSC96雪旺細胞。

3 討 論

Wnt基因最早于1982年的乳腺癌相關(guān)研究中被發(fā)現(xiàn)，被學(xué)者命名為Int1基因。之后，學(xué)者在果蠅的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)了與Int基因高度同源的無翅基因(Wingless)，后將兩者合稱為Wnt基因[9]。由Wnt基因調(diào)控的通路即為Wnt信號通路，該通路可分為經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路和非經(jīng)典的Wnt/PCP信號通路、Wnt/Ca2+信號通路。其中，Wnt5a主要屬于非經(jīng)典的Wnt信號通路。Wnt5a基因定位于染色體3p14.2-p21.1區(qū)，人的Wnt5a蛋白與鼠99%同源[10]。Wnt5a基因在細胞增殖、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持、器官發(fā)育中具有重要作用，并可以通過PTEN、MAPK、NF-κB等信號通路影響周圍神經(jīng)、中樞神經(jīng)損傷修復(fù)或功能重塑[4]。周圍神經(jīng)損傷是臨床上的棘手問題，尤其是損傷嚴重及大段缺損條件下，由于周圍神經(jīng)損傷及修復(fù)機制不明確，臨床無法對其有效干預(yù)。雪旺細胞是周圍神經(jīng)中非常重要的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，對周圍神經(jīng)損傷修復(fù)機制的研究意義重大。RSC96細胞是一種能夠多次傳代并表達雪旺細胞特性的大鼠來源細胞系，可以部分代替原代雪旺細胞用于周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的研究。

研究證實，Wnt5a基因可以通過調(diào)控雪旺細胞的功能，進而影響周圍神經(jīng)的損傷修復(fù)。PAN等[11]發(fā)現(xiàn)，Long non-coding RNA NONMMUG014387可以通過靶向激活Wnt/PCP通路,促進損傷部位周圍雪旺細胞的增殖，這一過程中Wnt5a蛋白的表達量明顯升高，其可能影響了雪旺細胞的去分化和增殖，在周圍神經(jīng)再生中起重要作用。SHARMA等[12]認為，Wnt5a在自體骨髓間充質(zhì)干細胞分化為雪旺細胞的過程中發(fā)揮作用，從而在一定程度上提高了周圍神經(jīng)損傷修復(fù)及神經(jīng)元軸突再生的臨床細胞生物利用度。TIONG等[13]則認為，褪黑素可以通過Wnt信號通路中的Wnt5a因子，影響糖尿病周圍神經(jīng)病變中雪旺細胞的凋亡。SIMONETTI等[14]通過動物模型證實，阻斷脊髓背根神經(jīng)元Wnt5a-Ryk/Ror2軸可阻止活動依賴性樹突棘重塑，顯著降低外周損傷和炎癥引起的機械性超敏反應(yīng)，從側(cè)面證實了Wnt5a基因在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用。

慢病毒是在HIV基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種病毒載體，對分裂及非分裂的細胞均具有較強的感染力。本研究團隊早期利用SIRT1基因慢病毒感染了ATDC5軟骨細胞，以及利用PTEN基因慢病毒感染了RSC96雪旺細胞[15-16]，并發(fā)現(xiàn)敲減ATDC5細胞中的SIRT1基因可以引起該細胞的退變[17]。PARK等[18]通過VEGF基因慢病毒感染胃癌細胞，發(fā)現(xiàn)感染后可影響胃癌細胞增殖和腫瘤生長。MA等[19]發(fā)現(xiàn)通過IARS2基因慢病毒感染人黑色素瘤A375細胞，證明該慢病毒可調(diào)控A375細胞的增殖及凋亡。CUI等[20]發(fā)現(xiàn)CRAD慢病毒感染人肺癌細胞，可通過claudin4調(diào)節(jié)人肺癌細胞生長及凋亡。由此可知，慢病毒感染技術(shù)在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)研究中應(yīng)用廣泛。但是，Wnt5a基因慢病毒感染RSC96雪旺細胞的相關(guān)模型少有報道，因此本研究團隊構(gòu)建出大鼠Wnt5a基因慢病毒，并用其感染了RSC96雪旺細胞，通過綠色熒光的表達觀察到慢病毒感染情況。細胞中Wnt5a mRNA的平均表達量為0.206±0.056。

當然，本研究也存在一定的不足之處。首先，本研究是一個描述性、觀察性研究，僅僅介紹了構(gòu)建Wnt5a基因慢病毒的方法及其感染RSC96雪旺細胞后的mRNA表達情況，缺乏對照組，也缺少蛋白層面的檢測。其次，細胞模型只能在離體條件下證明Wnt5a基因的作用，仍需要動物模型進一步證明其與細胞實驗中的一致性，這些也是作者需要繼續(xù)研究的內(nèi)容。

綜上所述，本研究構(gòu)建出大鼠Wnt5a基因慢病毒，并成功利用其感染了RSC96雪旺細胞，檢測了其Wnt5a mRNA表達量。通過建立相關(guān)細胞模型，可為周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的相關(guān)研究提供參考。