王天南，陳 敏，汪陽忠，李 鋼，費(fèi) 婷，吳 達(dá)，陸 捷

上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，上海市浦東新區(qū)秀浦路3733號 201315

多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一類重要的環(huán)境致癌化合物，被美國環(huán)境保護(hù)署（The United States Environmental Protection Agency）列為優(yōu)先控制污染物［1-2］。人體PAHs暴露途徑主要有吸入和攝入兩大類［3］，卷煙抽吸過程中的不完全燃燒會產(chǎn)生PAHs，為吸煙者帶來暴露風(fēng)險(xiǎn)［4-7］。PAHs進(jìn)入人體后會代謝生成多種羥基多環(huán)芳烴化合物（Monohydroxylated polycyclic aromatic hydrocarbons,OHPAHs）并隨尿液排出［3］。尿液中OHPAHs的濃度是評價(jià)多環(huán)芳烴暴露水平的重要指標(biāo)［8］；其濃度通常在ng/L~μg/L水平，量極低且基質(zhì)干擾嚴(yán)重，檢測難度大。目前常用的分析方法有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）［9-10］、高效液相色譜-熒光 檢 測（HPLC-FD）［11］和 液 相 色 譜-串 聯(lián) 質(zhì) 譜（LC-MS/MS）［12-19］法等。GC-MS法需要衍生化處理，過程繁瑣、耗時(shí)長。HPLC-FD法通常用來檢測尿液中濃度較高的羥基芘，難以滿足其他低濃度OHPAHs的分析需求。目前，文獻(xiàn)中報(bào)道以LC-MS/MS法為主，該方法靈敏度高、穩(wěn)定性好，且不需要對樣品進(jìn)行衍生化處理，能夠滿足痕量OHPAHs的檢測需求。但是由于OHPAHs的濃度低、干擾成分多，該方法需要采用液液萃?。?3］、固相萃?。?4］或攪拌棒吸附萃?。?5］等前處理方法對目標(biāo)物進(jìn)行富集濃縮并降低雜質(zhì)的干擾，常需要酶解、多步液液萃取、SPE小柱凈化、吹干、復(fù)溶等復(fù)雜的樣品前處理步驟，操作繁瑣且耗時(shí)長。

因此，采用二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（2DLC-MS/MS）技術(shù)［20-21］，建立了尿液10種PAHs暴露生物標(biāo)志物的新方法。該方法前處理簡單，樣品經(jīng)酶解過濾后直接上機(jī)，無需萃取濃縮，目標(biāo)物經(jīng)一維色譜分離除雜、捕集柱富集濃縮及二維色譜梯度洗脫，實(shí)現(xiàn)了5種羥基菲同分異構(gòu)體的基線分離，可成功應(yīng)用于吸煙者和非吸煙者的尿液分析。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

采集6名吸煙者和6名非吸煙者的晨尿，保存于-80℃冰箱中。

1-羥基萘（1-OHNap）、2-羥基萘（2-OHNap）、2-羥基芴（2-OHFlu）、3-羥基芴（3-OHFlu）、1-羥基菲（1-OHPhe）、2-羥基菲（2-OHPhe）、3-羥基菲（3-OHPhe）、4-羥 基 菲（4-OHPhe）、9-羥 基 菲（9-OHPhe）、1-羥基芘（1-OHPyr）、2-羥基萘-d7（2-OHNap-d7）、13C6-3-羥 基 芴（13C6-3-OHFlu）、13C6-3-羥 基 菲（13C6-3-OHPhe）、1-羥 基 芘-d9（1-OHPyr-d9）（美國Cambridge Isotope Laboratories公司）；β-葡萄糖醛酸酶（美國Sigma公司）；乙腈、甲醇（AR，美國Tedia公司）；乙酸、乙酸銨（AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；人工尿液（東莞創(chuàng)峰科技有限公司）。

1290液相色譜儀（配DAD檢測器）、6495三重四極桿質(zhì)譜儀（配備噴射流技術(shù)電噴霧離子源，AJS-ESI）、二元泵、六通閥、Eclipse PAH色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8μm）、Eclipse PAH色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8μm）（美國Agilent公司）；Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm，美國Waters公司）；LC-20AD單元泵（日本島津公司）；Eppendorf 5810R高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；Milli-Q純水儀（美國Millpore公司）；FiveEasy Plus型pH計(jì)（瑞士Mettler Toledo儀器公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：用甲醇作溶劑，配制1-/2-OHNap的濃度均為5μg/mL、其余8種目標(biāo)物的濃度均為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

內(nèi)標(biāo)溶液：用甲醇作溶劑，配制2-OHNap-d7和1-OHPyr-d9的濃度均為10μg/mL、13C6-3-OHFlu和13C6-3-OHPhe的濃度均為5μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：用甲醇作溶劑，取標(biāo)準(zhǔn)儲備液及內(nèi)標(biāo)溶液配制1-/2-OHNap的濃度分別為0.5、1.0、5.0、10.0、50.0和100.0 ng/mL，其余8種目標(biāo)物的濃度分別為0.2、1.0、2.0、10.0、20.0和100.0 ng/mL，2-OHNap-d7及1-OHPyr-d9的濃度均為50 ng/mL，13C6-3-OHFlu和13C6-3-OHPhe的濃度均為25 ng/mL的6級混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品前處理

將預(yù)先收集的尿液樣品解凍至室溫，取5 mL于15 mL離心管中，依次加入30μL內(nèi)標(biāo)溶液、1 mL乙酸銨-乙酸緩沖液（pH=4.02）和10μLβ-葡萄糖醛酸酶，混合均勻后放入恒溫槽中，37℃下避光酶解16 h。樣品經(jīng)0.2μm的PTFE濾膜過濾后上機(jī)分析。分析條件：

A.一維液相色譜條件。色譜柱：Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；A相：水；B相：甲醇；進(jìn)樣量：20μL；流速：0~1.0 min 0.2 mL/min，16.0~26.0 min 0.1 mL/min，30.0 min 0.2 mL/min；梯度洗脫條件：0~5.0 min 5%B，15.0~16.0 min 50%B，25.0~30.0 min 100%B，30.1 min 5%B；柱溫：30℃；DAD檢測波長：280 nm。

B.二維液相色譜條件。色譜柱：Eclipse PAH柱（2.1 mm×100 mm，1.8μm）；A相：水；B相：乙腈；流速：0.3 mL/min；柱溫：30℃；梯度洗脫條件：0~26.0 min 5%B，30.0~65.0 min 33%B，65.1~70.0 min 95%B，70.1 min 5%B。

C.補(bǔ)償流路條件。色譜柱：Eclipse PAH柱（2.1 mm×50 mm，1.8μm）；流動相：水；流速：0.4 mL/min。

D.六通閥切換時(shí)間。0~19.0 min為第一維色譜分離除雜時(shí)間（閥1~閥2），19.0~26.0 min為捕集柱捕集階段（閥1~閥6）；26.0 min后回到初始狀態(tài)（閥1~閥2），為第二維色譜分析時(shí)間。質(zhì)譜流路在30.0 min打開，75.0 min關(guān)閉。

E.質(zhì)譜條件。離子源：噴射流技術(shù)電噴霧離子源（AJS-ESI）；掃描方式：負(fù)離子；監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；干燥氣溫度：230℃；干燥氣流速：15 L/min；霧化器壓力（Nebulizer）：345 kPa；鞘氣溫度（Sheath gas temp）：400℃；鞘氣流速（Sheath gas flow）：12 L/min；毛細(xì)管電壓（Capillary）：負(fù)壓2 000 V；噴嘴電壓（Nozzle voltage）：負(fù)壓2 000 V；RF高壓（High pressure RF）：負(fù)壓210 V；RF低壓（Low pressure RF）：負(fù)壓90 V。各物質(zhì)及內(nèi)標(biāo)的定量離子對、碰撞能量（Collosion energy，CE）見表1。

表1 OHPAHs分析的質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters for OHPAHs analysis

2 結(jié)果與討論

2.1 二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)搭建

建立的反相-反相2DLC-MS/MS系統(tǒng)，兩維間采用不同極性的流動相及固定相，具有良好的正交性。第一維色譜以水-甲醇體系為流動相，C18色譜柱分離除雜；第二維色譜以水-乙腈體系為流動相，PAH色譜柱分離后進(jìn)入質(zhì)譜儀分析；兩維間通過在線稀釋將目標(biāo)流份切割至捕集柱保留。

系統(tǒng)的分析過程由捕集模式和分析模式組成，如圖1所示，轉(zhuǎn)移過程采用“正沖”（即洗脫的方向和富集的方向相同）的方式。捕集柱常采用第二維分析柱的保護(hù)柱（長1 cm），但由于本方法中1 cm的保護(hù)柱難以實(shí)現(xiàn)10種PAHs有效保留，故采用5 cm的分析柱作為捕集柱。由于分析柱有固定的流動相流進(jìn)和流出方向，因此轉(zhuǎn)移過程中采用“正沖”方式。

圖1 2DLC-MS/MS系統(tǒng)中捕集模式（a）及分析模式（b）示意圖Fig.1 Schematic diagrams of the trapping process(a)and analyzing process(b)in 2DLC-MS/MSsystem

2.2 一維液相色譜條件優(yōu)化

標(biāo)準(zhǔn)樣品和尿液樣品中OHPAHs的一維液相DAD色譜圖見圖2?？芍?，通過調(diào)節(jié)一維流動相洗脫梯度，可除去絕大多數(shù)雜質(zhì)，極大地降低尿液分析時(shí)的基質(zhì)干擾和抑制效應(yīng)。根據(jù)目標(biāo)物出峰時(shí)間確定中心切割范圍為19.0~26.0 min。為了平衡捕集效率和系統(tǒng)壓力，實(shí)驗(yàn)中通過優(yōu)化一維目標(biāo)物出峰時(shí)體系流速及相應(yīng)補(bǔ)償泵流速比例，最終確定補(bǔ)償泵流速為0.4 mL/min。

圖2 尿液樣品（a）和標(biāo)準(zhǔn)樣品（b）中OHPAHs的一維液相DAD色譜圖Fig.2 DAD chromatograms of the first dimensional LC of OHPAHs in urine sample(a)and standard sample(b)

2.3 二維液相色譜條件優(yōu)化

5種羥基菲同分異構(gòu)體的分離是檢測的難點(diǎn)，目前文獻(xiàn)報(bào)道的方法均無法對5種同分異構(gòu)體分別準(zhǔn)確定量［12-19］。本研究中通過捕集柱和二維色譜柱的選擇，以及二維流動相梯度洗脫條件的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了5種羥基菲同分異構(gòu)體的基線分離及準(zhǔn)確定量。標(biāo)準(zhǔn)樣品及吸煙者尿液樣品中10種OHPAHs的MRM色譜圖如圖3所示。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)樣品（a）及吸煙者尿液樣品（b）中10種OHPAHs的MRM圖Fig.3 MRM chromatograms of 10 OHPAHs in standard sample(a)and smoker’s urine sample(b)

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

對標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行分析，以O(shè)HPAHs與對應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，濃度比為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果如表2所示，決定系數(shù)均大于0.99，線性關(guān)系良好。

表2 分析OHPAHs的線性方程、檢出限及定量限Tab.2 Linear equations,LODs and LOQs for OHPAHs analysis

本方法的檢出限和定量限分別為0.001~0.021和0.005~0.070 ng/mL，與文獻(xiàn)［13-14，16］中報(bào)道的其他方法的檢出限和定量限一致（表3），可滿足尿液樣品中痕量OHPAHs的檢測需求。

表3 本方法與其他方法檢出限和定量限的比較Tab.3 Comparisons of LODs and LOQs between this method and other methods

對樣品進(jìn)行加標(biāo)回收及日間和日內(nèi)精密度考察，結(jié)果見表4?？芍?，尿液樣品中目標(biāo)物的回收率為87.9%~129.1%，樣品的日內(nèi)和日間RSD分別為1.1%~4.1%和1.4%~4.8%。表明方法的重復(fù)性好、穩(wěn)定性高，滿足日常檢測需要。

表4 方法的精密度和回收率Tab.4 Precisions and recoveries of this method

2.5 尿液樣品分析

采用本方法分別對6名吸煙者、6名非吸煙者的尿液樣品及5個(gè)人工尿液加標(biāo)樣品進(jìn)行分析，結(jié)果見表5?？芍?，該方法能夠滿足不同類型尿液樣品分析的需要。

由表5可知，吸煙者的分析結(jié)果存在明顯的個(gè)體差異，可能與其吸煙習(xí)慣及個(gè)體代謝差異有關(guān)。此外，由于PAHs廣泛存在于食品、環(huán)境、煙氣及汽車尾氣等中，因此非吸煙者尿液中也能檢測到OHPAHs［15］。由吸煙者和非吸煙者尿液中10種OHPAHs檢測結(jié)果可知，2-OHNap、1-OHNap和1-OHPry的濃度相對較高，4-OHPhe和9-OHPhe的濃度相對較低，且吸煙者與非吸煙者之間存在一定差異。本研究中吸煙者尿液中OHPAHs的濃度明顯高于非吸煙者，以1-OHNap、2-OHFlu、3-OHFlu、4-OHPhe和9-OHPhe的差異最為顯著。但是考慮到樣本數(shù)量太少以及并未采用肌酐進(jìn)行個(gè)體差異矯正，因此對吸煙者和非吸煙者尿液中OHPAHs的差異仍需進(jìn)一步研究。本方法所測樣品中OHPAHs的濃度范圍與文獻(xiàn)［12-15］的報(bào)道一致，可滿足吸煙人群和非吸煙人群尿液中痕量OHPAHs準(zhǔn)確測定的需求。

表5 （續(xù)）

表5 尿液樣品分析結(jié)果Tab.5 Analytical results of urine samples （ng·mL-1）

3 結(jié)論

①建立了人尿液中痕量多環(huán)芳烴暴露生物標(biāo)志物的二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，尿液樣品僅需酶解過濾后可直接上機(jī)分析。②本方法無需萃取濃縮即可滿足檢測需求，同時(shí)有效解決了5種羥基菲同分異構(gòu)體準(zhǔn)確定量的難題，可用于吸煙者和非吸煙者尿液中OHPAHs的準(zhǔn)確測定。③方法簡單便捷、儀器全自動、結(jié)果可靠，可為煙氣暴露風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)提供更為高效、準(zhǔn)確的技術(shù)手段，為吸煙與健康的深入研究提供有力支撐。