郝夢真， 李欣芮， 牟 瑤， 陳 錫， 車會(huì)蓮

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室 北京100083）

樹堅(jiān)果過敏是常見的食物過敏之一， 估計(jì)其全球流行率為0.05%至4.9%， 而且流行率還在增加[1]。 據(jù)美國國家自報(bào)登記處的記錄，樹堅(jiān)果尤其是核桃， 是食物過敏導(dǎo)致致命或接近致命反應(yīng)的主要原因[2]。 Jug r 2 是核桃中的主要過敏原[3]，Jug r 2 為7S 球蛋白， 通過BLAST 搜索發(fā)現(xiàn)，其蛋白序列不僅與黑核桃中7S 球蛋白過敏原Jug n 2 相似，而且與其它植物來源的7S 球蛋白過敏原相似，例如花生Ara h 1 和大豆Gly m 5[4]。 7S 球蛋白由3 個(gè)亞基組成[5]，與其它7S 球蛋白相似，一個(gè)成熟的Jug r 2 蛋白亞基是由約66 ku 前體蛋白在其第173 個(gè)氨基酸位點(diǎn)斷裂而形成的， 其分子質(zhì)量約為44 ku[3]。

食物過敏原線性表位是研究過敏原結(jié)構(gòu)及其致敏性關(guān)系的重要方面。 食物過敏原的線性表位可分為T 細(xì)胞表位和B 細(xì)胞線性表位。 其中T 細(xì)胞僅能識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞（如樹突狀細(xì)胞）的主要組織相容性復(fù)合體分子中出現(xiàn)的抗原衍生肽[6]。由過敏原來源的肽激活2 型CD4+T 細(xì)胞是食物過敏反應(yīng)中的關(guān)鍵步驟，該肽通常至少由13 個(gè)連續(xù)氨基酸組成[7]；過敏原連續(xù)氨基酸序列形成的B 細(xì)胞線性表位可與特異性IgE 結(jié)合， 是食物過敏反應(yīng)中肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞釋放過敏介質(zhì)的關(guān)鍵觸發(fā)點(diǎn)[6]，該肽通常由8～15 個(gè)連續(xù)氨基酸組成[8]。目前， 免疫信息學(xué)方法是一種預(yù)測過敏原B 細(xì)胞線性表位的常見高效方法， 該方法利用過敏原的理化性質(zhì)對(duì)抗原的線性表位進(jìn)行預(yù)測， 例如蛋白質(zhì)局部親水性、表面可及性、可塑性和抗原性等，這極大程度降低了合成試驗(yàn)成本和時(shí)間， 并提示某些連續(xù)氨基酸序列具有與IgE 結(jié)合的可能[9]。

食物過敏是發(fā)生在在胃腸道的免疫反應(yīng)[10]，食物過敏原可通過多種屏障進(jìn)入機(jī)體，例如皮膚、呼吸道、胃腸道，與其它屏障相比胃腸道對(duì)食物蛋白的消化作用會(huì)造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞， 從而影響其生物活性， 食物過敏原內(nèi)在消化穩(wěn)定性和致敏性之間似乎不存在確定的核心關(guān)系[11]。 某些食物過敏原對(duì)消化高度敏感， 其消化產(chǎn)物在到達(dá)腸道黏膜誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)時(shí)仍保持足夠的結(jié)構(gòu)和大小，可以被抗原呈遞細(xì)胞攝取[12]，這依賴于耐消化肽重組成特定結(jié)構(gòu)和腸道免疫系統(tǒng)對(duì)其識(shí)別及攝取的能力， 因此食物過敏原在胃腸道的消化情況以及消化產(chǎn)物是影響過敏原致敏潛能的關(guān)鍵因素[13]。 除此之外，在腸道中耐消化肽具有與腸道部位IgE 結(jié)合的活性， 從而可能引發(fā)過敏反應(yīng)中的胃腸道癥狀。 最近的一項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)胃腸組織中局部IgE 反應(yīng)的重要性， 證明了胃腸道組織是產(chǎn)生IgE+B 系細(xì)胞的重要募集場所[14]。 評(píng)估食物過敏原抗消化肽成為研究食物過敏原在腸道部位致敏性的潛在方法。有研究者[15]對(duì)花生過敏原Cupin 家族的Ara h 1 的胃腸道消化產(chǎn)物進(jìn)行分析， 發(fā)現(xiàn)其消化短肽仍具有與特異性IgE 結(jié)合和致敏活性，而Ara h 1 與Cupin 家族的其它蛋白相似，極易在胃腸道內(nèi)被分解， 因此推測食物蛋白的耐消化性并不是其具備免疫原性或免疫反應(yīng)性的必要條件。目前，在評(píng)估食物過敏原的胃腸道保存能力時(shí)，大部分研究關(guān)注完整蛋白的消化穩(wěn)定性，很少關(guān)注食物過敏原消化肽的穩(wěn)定性、大小及組成。

本研究的目的是通過將核桃過敏原體外胃腸液模擬消化降解產(chǎn)物， 與已知的線性表位和通過生物信息學(xué)預(yù)測得到的線性表位進(jìn)行比較， 并將其定位至模擬Jug r 2 三維結(jié)構(gòu)上，以進(jìn)一步認(rèn)識(shí)Jug r 2 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)， 旨在為評(píng)估核桃過敏原Jug r 2 免疫原性和免疫反應(yīng)性，以及進(jìn)一步研究導(dǎo)致食物過敏的過敏原分子結(jié)構(gòu)條件提供試驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本文所用血清取自6 名對(duì)核桃過敏的患者，具有攝食核桃后產(chǎn)生系統(tǒng)性過敏反應(yīng)的病史，或在醫(yī)院進(jìn)行皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)時(shí)對(duì)核桃產(chǎn)生陽性反應(yīng)。 研究獲得血清提供者的知情同意。

英國核桃購自天津薊縣。 BCA 蛋白定量試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量Marker，Thermo Fisher 公司； 牛血清白蛋白BAS、生物素標(biāo)記的山羊抗人IgE 抗體、胃蛋白酶P7000、 胰蛋白酶P3292，Sigma 公司；HRP 標(biāo)記鏈霉親和素，Thermo Scientific 公司；HRP-TMB 顯色試 劑 盒，Millipore 公 司；0.22 μm 硝酸纖維薄膜，Whatman 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，瑞安市英衡電器有限公司；多功能酶標(biāo)儀，Thermo Scientific 公司；DYY-7C 型電泳儀，北京市六一儀器廠；Geno Sens 1850 凝膠成像分析系統(tǒng)、ChemiScope 3300 mini 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)， 上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；JB-3 磁力攪拌器， 上海富磁新徑儀器有限公司；TGL-16M 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，廣州廣一科學(xué)儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱，寧波萊?？萍加邢薰?；數(shù)顯圓周搖床，Scilogex 公司； CC-K6 加熱制冷型恒溫水浴鍋，德國Huber 公司；漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃粗蛋白的浸提 按姜松松等[16]的方法提取核桃中的粗蛋白。將核桃剝殼，去除核桃外硬殼并去皮，打碎成細(xì)粉末。 稱取10 g 所得核桃粉，加入100 mL 正己烷溶液， 于4 ℃磁力攪拌脫脂2 h，然后于4 ℃、8 000×g 離心30 min，棄上清，將所得沉淀再經(jīng)過上述方法重復(fù)脫脂2 次， 于通風(fēng)櫥內(nèi)將沉淀部分充分晾干，得到脫脂核桃粉末。將脫脂核桃粉于PBS 緩沖液（0.1 mol/L）按質(zhì)量∶體積比1∶10 進(jìn)行混合， 于4 ℃環(huán)境中使用磁力攪拌器攪拌12 h，然后于4 ℃、10 000×g 離心20 min，取上清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 免疫印跡 按照Downs 等[17]的方法進(jìn)行血清IgE 識(shí)別核桃過敏原的免疫印跡試驗(yàn)。 對(duì)蛋白粗提物進(jìn)行SDS-PAGE 電泳后，在80 V 恒壓下電轉(zhuǎn)2 h，將蛋白條帶印跡到硝酸纖維薄膜（NC）上。使用封閉液（5% BSA-TBST）室溫封閉1 h 后，加入用稀釋液（5% BSA-TBST）以1∶10 比例稀釋的過敏患者混合血清作為一抗在4 ℃下孵育過夜。用TBST 洗滌6 次后，加入1∶8 000 稀釋的生物素標(biāo)記山羊抗人IgE 抗體作為二抗室溫孵育1 h。 用TBST 洗滌6 次后，加入1∶500 稀釋的HPR 標(biāo)記鏈霉親和素作為三抗孵育1 h。TBST 洗滌后，使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，成像系統(tǒng)拍照。

1.3.3 免疫信息學(xué)預(yù)測Jug r 2B 細(xì)胞線性表位使用免疫信息軟件DNAStar Protean 系統(tǒng)和ABCpred 在線工具，預(yù)測Jug r 2 的線性表位。

在DNAStar Protean 系統(tǒng)中，以氨基酸序列的親水性、柔韌性、可達(dá)性和抗原性4 種性質(zhì)作為表位預(yù)測的參數(shù)。 親水性、柔韌性、表面可及性和抗原性的預(yù)測分別按照Kyte 等[18]、Karplus 等[19]、Emini 等[20]和Jameson 等[21]的方法進(jìn)行。基于以上的方法，用DNAStar 預(yù)測了具有合適的親水性、高柔韌性、 表面可及性和高抗原性的肽段為線性表位。BPAP 系統(tǒng)和BepiPred 1.0 服務(wù)器是基于氨基酸的親水性、柔韌性、接觸性、轉(zhuǎn)角和表面暴露等理化性質(zhì)來預(yù)測線性表位的。

1.3.4 體外模擬胃液消化 模擬胃液和腸液由Toomer 等[22]所述制備，并進(jìn)行了一些調(diào)整。模擬胃液： 在100 mL ddH2O 中溶解131.6 mg 胃蛋白酶和0.2 g NaCl，用HCl 調(diào)節(jié)pH 值至1.2，胃蛋白酶的活性≥2 000 U/mg。模擬腸液：在100 mL ddH2O中溶解1 g 胰蛋白酶和0.7 g KH2PO4，用NaOH 調(diào)整pH 值至7.5，胰蛋白酶的活性需要滿足如下條件：在40 ℃、pH 7.5 時(shí)，60 min 內(nèi)胰蛋白酶水解酪蛋白質(zhì)量是胰蛋白酶質(zhì)量的25 倍。 參照Guo 等[23]的方法進(jìn)行體外胃腸消化試驗(yàn)。

1.3.5 Jug r 2 抗消化肽序列分析 利用納米級(jí)的HPLC 系統(tǒng)Easy-nLC 1000 對(duì)Jug r 2 消化產(chǎn)物進(jìn)行分析。流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液（B）。用95%的A 液平衡色譜柱。樣品通過自動(dòng)取樣器加載到柱前C18 柱（3 mm，0.10 mm×20 mm），然后用C18 分析柱分離（1.9 mm，0.15 mm×120 mm），流速600 nL/min。 用毛細(xì)管高效液相色譜對(duì)樣品進(jìn)行分離， 用Q-Exactive 質(zhì)譜儀對(duì)樣品進(jìn)行裂解。

使用PFind 2.6 軟件對(duì)通過串聯(lián)質(zhì)譜分析得到的Jug r 2 消化產(chǎn)物序列進(jìn)行鑒定，該過程數(shù)據(jù)庫檢索。 數(shù)據(jù)庫檢索參數(shù)如下：胃蛋白酶或胰酶；漏切位點(diǎn)：2；固定修飾：酰甲基化修飾（C）；可變修飾：乙酰化（N）、谷氨酰胺修飾為焦谷酰酸（N 段）、氧化（M）；前體質(zhì)量偏差：±1.5 u；碎片質(zhì)量偏差：±0.5 u；肽段可信度：高；肽段長度：＞4；肽段FDR：≤0.01。

1.3.6 Jug r 2 的同源建模 在Protine Data Bank，使用BLAST 來搜索一個(gè)已知的蛋白質(zhì)作為模板[24]。這個(gè)模板應(yīng)該與Jug r 2 具有高度的序列同源性。 因此， 推測Car i 2 與Jug r 2 約有91.65%的一致性。 利用7S 球蛋白的SWISSMODEL 網(wǎng)站中的比對(duì)模式作為模板，建立了較為準(zhǔn)確的三維模型[25]。 通過分子動(dòng)力學(xué)模擬和能量最小化，得到了Jug r 2 的三維模型。 利用可視化軟件RasMol 查看Jug r 2 預(yù)測B 細(xì)胞線性表位和抗消化肽段在三維結(jié)構(gòu)中的位置。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃主要過敏原Jug r 2 的B 細(xì)胞線性表位的生物信息學(xué)預(yù)測

DNAStar Protean 系統(tǒng)是基于表面可及性、柔韌性和氨基酸親水性對(duì)線性表位進(jìn)行預(yù)測。 如圖1 所示， 表面可及和柔韌區(qū)域出現(xiàn)頻率增高說明這些區(qū)域在Jug r 2 中是柔軟的且易拉伸的，容易暴露在蛋白質(zhì)表面。 完整序列中的高抗原指數(shù)區(qū)域具有形成線性表位的高度傾向。如表1 所示，根據(jù)這些性質(zhì)，使用DNAStar 軟件分析最終得到Jug r 2 的8 個(gè)潛在B 細(xì)胞線性表位。

之后利用了ABCpred 在線工具對(duì)Jug r 2 的B 細(xì)胞線性表位進(jìn)行預(yù)測，閾值設(shè)置為0.8，其結(jié)果如表1 所示。 兩種工具所預(yù)測的B 細(xì)胞線性表位存在很多重疊的部分， 以兩種工具預(yù)測的線性表位作為最終結(jié)果，不考慮存在爭議的結(jié)果。如表1 所示，最終通過兩種生物信息學(xué)預(yù)測得到8 條B細(xì)胞線性表位， 分別為AA186～199、AA226～230、AA257 ～263、AA284 ～289、AA373 ～382、AA389 ～398、AA408～414、AA472～487。 利用DNAStar 聯(lián)合ABCpred 預(yù)測得到的Jug r 2 的8 條B 細(xì)胞線性表位在Jug r 2 模擬三維模型中的定位。如圖2 所示，預(yù)測得到的8 條線性表位均位于Jug r 2 表面的β 折疊、轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲處，這些區(qū)域的可變程度更大，可能具有更強(qiáng)的IgE 結(jié)合活性。

表1 DNAStar 和ABCpred 兩種免疫信息學(xué)工具預(yù)測的B 細(xì)胞線性表位Table 1 B cell linear epitopes predicted by two immunoinformatics tools of DNAStar and ABCpred

圖2 兩種免疫信息學(xué)預(yù)測得到的B 細(xì)胞線性表位在Jug r 2 模擬三維結(jié)構(gòu)上的定位Fig.2 Location of B cells linear epitopes analyzed by two combined immunoinformatics tools in the tertiary structure of Jug r 2

2.2 核桃蛋白粗提物的SDS-PAGE 的電泳分析

核桃蛋白粗提物的SDS-PAGE 電泳結(jié)果如圖3 所示。 核桃總蛋白在17 ku 和10 ku 處有明顯的條帶， 經(jīng)灰度值分析分別占總蛋白含量的28%和26%，其中分子質(zhì)量為17 ku 的蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)于核桃中另一主要過敏原Jug r 1。 分子質(zhì)量為10 ku 左右的蛋白條帶對(duì)應(yīng)于7S 球蛋白Jug r 2 前體蛋白翻譯后修飾所切除的6～9 ku 小親水性肽段[3]。 該肽段經(jīng)過質(zhì)譜鑒定確實(shí)為Jug r 2 的產(chǎn)物。成熟的Jug r 2 單亞基分子質(zhì)量位于44 ku 處， 占總蛋白含量的16%，此證明了本次核桃中過敏原Jug r 2提取成功。 提取的總蛋白經(jīng)過BCA 試劑盒測定其質(zhì)量濃度為20.66 mg/mL。

圖3 核桃總蛋白電泳分析Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis analysis of walnut proteins

2.3 核桃蛋白粗提物與核桃過敏患者血清池IgE結(jié)合情況

使用6 名核桃過敏患者血清建立血清池，通過免疫印跡試驗(yàn)檢測其中與血清IgE 結(jié)合的主要的核桃過敏原。 如圖4 所示，患者血清池與44 ku處的Jug r 2 有明顯的結(jié)合，強(qiáng)度顯著高于其它蛋白質(zhì)。

圖4 核桃蛋白粗提物的免疫印跡分析Fig.4 Western blot analysis of walnut proteins crude extracts

2.4 核桃蛋白粗提物抗胃蛋白酶和胰蛋白酶消化肽段的質(zhì)譜分析

將核桃蛋白粗提物經(jīng)胃蛋白酶或胰蛋白酶消化60 min 后的產(chǎn)物進(jìn)行HPLC-MS/MS 檢測以確定屬于過敏原Jug r 2 的抗消化肽段。核桃蛋白粗提物經(jīng)過60 min 的胃蛋白酶消化后， 經(jīng)HPLCMS/MS 檢測共產(chǎn)生了4 953 個(gè)二級(jí)質(zhì)譜。 根據(jù)Uniprot 數(shù)據(jù)庫提供的核桃過敏原氨基酸序列構(gòu)建檢索數(shù)據(jù)庫，使用pFind 軟件搜索，鑒定出來源于Jug r 2 的4 條肽段 （如表2 所示）， 覆蓋其11%的氨基酸序列。 核桃蛋白粗提物經(jīng)過60 min的胰蛋白酶消化后，經(jīng)HPLC-MS/MS 檢測共產(chǎn)生了6 493 個(gè)二級(jí)質(zhì)譜，據(jù)Uniprot 數(shù)據(jù)庫提供的核桃過敏原氨基酸序列構(gòu)建檢索數(shù)據(jù)庫，使用pFind軟件搜索，鑒定出來源于Jug r 2 的13 條肽段（如表3 所示），覆蓋其46%的氨基酸序列。

表2 胃蛋白酶消化質(zhì)譜與Jug r 2 匹配的肽段Table 2 Peptide matched with Jug r 2 by pepsin digestion through mass spectrometry

表3 胰蛋白酶消化質(zhì)譜與Jug r 2 匹配的肽段Table 3 Peptide matched with Jug r 2 by trpsin digestion through mass spectrometry

（續(xù)表3）

2.5 抗消化肽在Jug r 2 一級(jí)序列和三維結(jié)構(gòu)上的分布情況

為了進(jìn)一步觀察這些抗消化肽在過敏原Jug r 2 一級(jí)序列上的分布情況，從NCBI 數(shù)據(jù)庫中獲取了Jug r 2 的序列。 如圖5 所示，這些抗消化肽段主要分布于Jug r 2 的C 端區(qū)域， 覆蓋了AA428～572 位點(diǎn)，約占74%的序列。 其中，經(jīng)胃蛋白酶消化后，在AA515～528 處產(chǎn)生了兩條重疊肽段 （3 號(hào)和4 號(hào)）， 經(jīng)胰蛋白酶消化后分別在AA470～483 （6 號(hào)和7 號(hào)）、AA488～513 （8 號(hào)和9號(hào)）和AA545～572（12 號(hào)和13 號(hào)）處產(chǎn)生重疊肽段，證明了這些區(qū)域具有較強(qiáng)的抗消化性。相比胃蛋白酶，Jug r 2 經(jīng)過胰蛋白酶消化可獲取更多的肽段， 這可以提高耐消化肽預(yù)測B 細(xì)胞線性表位的效率。 值得注意的是抗胃蛋白酶消化肽段與8～11 號(hào)抗胰蛋白酶消化肽段存在重合區(qū)域，進(jìn)一步說明Jug r 2 經(jīng)過連續(xù)的胃腸道主要消化酶的消化， 肽段AA494～513、AA515～526、AA519～528 可以得以保留。最終篩選得到11 條抗消化的非重疊肽段， 分別為AA215～220，AA250～260，AA323～337，AA351～356，AA363～388，AA428～438，AA470～483，AA488～513，AA514～526，AA527～541，AA545～572。11 條抗消化肽段在Jug r 2 模擬三維模型中的定位如圖6 所示，11 條抗消化肽段中有2 條僅位于α 螺旋處，2 條同時(shí)存在α 螺旋和轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，3 條同時(shí)存在β 折疊和轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，2 條位于無規(guī)卷曲處。 相比預(yù)測得到的8 條B 細(xì)胞線性表位的定位特點(diǎn)，11 條抗消化肽段中出現(xiàn)了更多的α 螺旋結(jié)構(gòu)， 盡管α 螺旋的結(jié)構(gòu)可能會(huì)降低與IgE 結(jié)合能力[23]，然而11 條抗消化肽段所處的α 螺旋均處于Jug r 2 表面， 并且部分消化肽段同時(shí)位于α螺旋和轉(zhuǎn)角處， 即認(rèn)為這些抗消化肽段可能位于α 螺旋的連接處。 按照Ktye 等[18]的原則，對(duì)11 條抗消化肽段在Jug r 2 中的疏水性分析如圖7 所示， 本研究發(fā)現(xiàn)11 條抗消化肽段處于Jug r 2 親水性區(qū)域的比例較高。李平等[26]對(duì)Cupin 家族的食物過敏原的B 細(xì)胞線性表位的特點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)，發(fā)現(xiàn)其B 細(xì)胞線性表位具有處于高度暴露于溶劑的區(qū)域；含有親水性側(cè)鏈；有一定的柔韌性的3 個(gè)特點(diǎn)。在本研究中所得到的11 條抗消化肽段均位于Jug r 2 的表面，親水性良好，且這些肽段所處轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)具有可變性， 會(huì)提高其與IgE的結(jié)合活性。

圖5 抗消化肽段在Jug r 2 氨基酸序列中的定位Fig.5 Positioning of anti-digestive peptides in Jug r 2 amino acid sequences

圖6 11 條抗消化肽段在Jug r 2 模擬三維結(jié)構(gòu)上的定位Fig.6 Location of 11 digestion-resistant peptides in the tertiary structure of Jug r 2

圖7 11 條抗消化肽段的疏水分析Fig.7 Hydrophobicity analysis of 11 anti-digestible peptides

2.6 Jug r 2 抗消化肽段與Jug r 2 線性表位重合程度分析

胞 線 性 表 位[27]，在AA250 ～260、AA363 ～388 和AA470～483 位置的抗消化肽均與預(yù)測的線性表位存在部分氨基酸序列的交叉， 說明B 細(xì)胞線性表位可能具有一定的抗消化性。 除此之外，在

如圖8 所示，Jug r 2 的抗消化肽段在蛋白質(zhì)全序列的AA545～572 位置附近含有已知的B 細(xì)AA215 ～220、AA250 ～260、AA323 ～337、AA363 ～388、AA428～438、AA470～483、AA545～572 位置的抗消化肽段與已知的T 細(xì)胞表位交叉，核桃Jug r 2 的T 細(xì)胞表位可能是誘導(dǎo)核桃過敏患者外周血T 細(xì)胞向Th2 中樞記憶表型分化的因素[28]，Th2 細(xì)胞驅(qū)動(dòng)IgE 類轉(zhuǎn)換和過敏效應(yīng)細(xì)胞的擴(kuò)大是引發(fā)過敏反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[29]。

圖8 抗消化肽段和預(yù)測表位在Jug r 2 氨基酸序列中的定位Fig.8 Position of anti-digestive peptides and predicted epitopes in amino acid sequence of Jug r 2

食物過敏原進(jìn)入機(jī)體的主要途徑是消化道黏膜表面， 過敏原在消化道內(nèi)所具有的特定分子特性與腸道駐留免疫細(xì)胞相互作用所必需的， 這些特定分子特性包括食物過敏原的消化特性[30]。 某些食物過敏原經(jīng)過模擬胃腸道消化后形成的蛋白片段仍保持與IgE 結(jié)合活性，例如花生過敏原Ara h 1[15]、Ara h 3[31]和獼猴桃蛋白[32]。 在本研究中同樣也發(fā)現(xiàn)了核桃主要過敏原Jug r 2 的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶消化短肽， 與預(yù)測和實(shí)際得到的B細(xì)胞線性表位存在重疊，因此Jug r 2 抗消化肽段成為篩選B 細(xì)胞線性表位的方法。 除此之外，Jug r 的抗消化肽段與實(shí)際T 細(xì)胞表位存在重疊，這進(jìn)一步指出胃腸道消化對(duì)核桃主要過敏原Jug r 2 消化后引起腸道黏膜免疫細(xì)胞反應(yīng)的作用機(jī)制可能與抗消化肽段有關(guān)。

本研究中核桃蛋白所處的體外消化環(huán)境較為簡單， 所采用的體外胃腸模擬消化并不能完全反映核桃蛋白在核桃整個(gè)食物基質(zhì)中的消化行為，特別是由于腸道不同部位發(fā)揮作用的消化酶種類的不同[33]，可能導(dǎo)致該研究結(jié)果具有一定的局限性。 除此之外，核桃主要過敏原Jug r 2 抗消化肽是否具有與IgE 結(jié)合能力仍需更多的核桃過敏患者血清來進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 結(jié)論

盡管固相肽合成法是研究Jug r 2 線性表位的金方法，但是由于合成成本高且盲目性大，因此目前尋找相關(guān)輔助方法以提高Jug r 2 線性表位的識(shí)別效率是重要的研究方向。 本研究發(fā)現(xiàn)了Jug r 2 抗消化肽段具有B 細(xì)胞線性表位所具備的親水性和柔韌性的特點(diǎn)， 并且通過一級(jí)序列和三維定位分析發(fā)現(xiàn)了Jug r 2 抗消化肽段與預(yù)測和真實(shí)的B 細(xì)胞線性表位以及T 細(xì)胞線性表位重疊?；贘ug r 2 抗消化肽段的一級(jí)序列和三維定位的分析可能是預(yù)測Jug r 2 線性表位的有效策略，并且本研究也有助于研究核桃主要過敏原Jug r 2 在胃腸道致敏機(jī)制。