陳文瑞，蔣 朝，唐 娜，吳征江，武文莉，戴洪偉，李春鳴，劉慧霞

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州 730030）

紫花苜蓿(Medicago sativa)營養(yǎng)價值高、抗逆性強(qiáng)[1]，被廣泛應(yīng)用于我國北方干旱半干旱地區(qū)栽培草地的建植[2]，現(xiàn)已形成以甘肅河西走廊、寧夏河套灌區(qū)和內(nèi)蒙古科爾沁草地等一批十萬畝以上集中連片的優(yōu)質(zhì)苜蓿種植基地[3-4]，不僅為我國北方地區(qū)現(xiàn)代畜牧業(yè)的發(fā)展提供大量優(yōu)質(zhì)牧草[1]，而且為防風(fēng)固沙和改良土壤提供了助力[5-6]。灌溉是這一地區(qū)紫花苜蓿穩(wěn)定高產(chǎn)的重要保證，適宜的土壤含水量既能保證紫花苜蓿穩(wěn)定高產(chǎn)，又能提高紫花苜蓿的水分利用效率。適宜植物的生長，提高水分利用效率的土壤水分含量與其種植密度緊密相關(guān)，密度過大會增加植物蒸騰量和建植成本[7-8]，過小則會增加地表蒸發(fā)，降低灌溉水分利用效率[9]。因此，只有紫花苜蓿植株密度和土壤含水量處于最佳耦合狀態(tài)時，紫花苜蓿栽培草地才能實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定高產(chǎn)，高效利用灌溉水效率。

紫花苜蓿植株性狀的可塑性，是其適應(yīng)土壤含水量變化和種內(nèi)競爭的重要策略[10]，可用于評價紫花苜蓿個體及種群應(yīng)對環(huán)境變化的狀況[11]，而葉片是應(yīng)答土壤含水量變化和種內(nèi)競爭關(guān)系變化的最敏感器官[12-13]，主要是葉片決定著紫花苜蓿的光合速率和蒸騰速率[14-15]。植株性狀和葉片特征經(jīng)常被用于分析紫花苜蓿生產(chǎn)力形成的兩個重要指標(biāo)[16]。因此，植株密度和土壤含水量互作下紫花苜蓿植株性狀和葉片的變化特征，是查清植株密度和土壤含水量耦合時紫花苜蓿栽培草地穩(wěn)定高產(chǎn)的途徑之一。

土壤含水量和植株密度處于耦合狀態(tài)時，已被證實(shí)能夠提高禾本科植物水稻(Oryza sativa)的光合速率[17]、玉米(Zea mays)的株高和莖粗等植株性狀[18]，然而土壤水分和植物密度互作是否能夠改善豆科牧草紫花苜蓿植株性狀和葉片特征，尚需要科學(xué)試驗(yàn)提供證據(jù)。因此，本研究采用盆栽試驗(yàn)，分析不同土壤含水量和植株密度互作對紫花苜蓿植株性狀和葉片特征的影響，以期完善土壤含水量和植株密度互作影響植物植株性狀和葉片特征的研究內(nèi)容，服務(wù)于紫花苜蓿穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)采用盆栽試驗(yàn)，設(shè)計為雙因素處理，兩個因素分別為土壤含水量和植株密度。土壤含水量設(shè)4 個梯度水平[19]，由于紫花苜蓿適宜生長的土壤含水量為田間飽和含水量的70%[19]，因此4 個土壤水分梯度分別設(shè)為土壤田間飽和含水量的85%～90%(W1濕潤)、75%～80% (W2適宜)、60%～65% (W3輕度干旱脅迫)、35%～40% (W4重度干旱脅迫)。植物密度設(shè)計為3 個水平[12]，分別為10 (D1)、15 (D2)和20 株·盆-1(D3)，相當(dāng)于210、315 和420萬株·hm-2。試驗(yàn)共12 個處理，每處理3 個重復(fù)，共計36 盆。

試驗(yàn)在蘭州大學(xué)榆中試驗(yàn)站日光智能溫室進(jìn)行。供試的紫花苜蓿品種為‘直布羅陀’(Gibraltar)，來自甘肅省亞盛田園牧歌草業(yè)集團(tuán)公司，該品種是甘肅河西走廊主要紫花苜蓿品種之一。試驗(yàn)選用頂部直徑為25 cm，底部直徑為20 cm，高為28 cm 的塑料盆。土壤源于甘肅榆中盆地農(nóng)田的耕作層，類型為沙壤土，其土壤田間飽和持水量為20.24% (質(zhì)量含水量)[20]，pH 為7.4，有機(jī)質(zhì)含量為0.66%，全氮含量為0.11%，速效磷和速效鉀含量分別為5 766 和240 mg·kg-1[21]。

首先，用篩孔為0.5 cm 的鐵篩剔除土壤中的植物根、石塊等雜質(zhì)，再將土壤置于180 ℃烘箱中高溫滅菌48 h，后將土壤與尿素(N 含量34.5 kg·hm-2)、過磷酸鈣(P 含量8.0 kg·hm-2)[22]充分?jǐn)嚢杌旌?，最后每盆裝添加肥料的土壤11.3 kg。裝好36 個盆后，于2018年10月14日播種，每盆播種籽粒飽滿、大小均勻的苜蓿種子80 粒，土壤水分維持于70%～75%。2018年11月14日紫花苜蓿出苗至3 葉期時，人工間苗，將每盆的植株密度調(diào)至試驗(yàn)設(shè)計水平，間苗時每個花盆盡量保留長勢良好、生長均一的苗，從人工間苗到紫花苜蓿分枝期，土壤水分依然維持于70%～75%，以利于幼苗的正常生長。分枝期開始，采用增加或減少灌溉水量的策略，將每個花盆的土壤含水量逐漸調(diào)至試驗(yàn)設(shè)計要求，2018年12月4日完成。此后每個花盆土壤含水量均維持于70%～75%。土壤含水量采用稱重法，每隔2 d 根據(jù)需求澆水一次，澆水時間為18：00，盡可能地保持土壤含水量維持于試驗(yàn)設(shè)計的范圍內(nèi)。試驗(yàn)期間每周隨機(jī)調(diào)整花盆位置，便于紫花苜蓿生長的通風(fēng)和光照資源相對均勻，隨時觀察花盆內(nèi)雜草生長，一旦發(fā)現(xiàn)雜草立刻手動清除。

1.2 取樣和指標(biāo)測定

本研究采用株高、分枝數(shù)、根頸直徑、主根長和主根直徑評價植株性狀特征，采用葉綠素、葉面積、葉片干重、比葉面積評價紫花苜蓿葉片特征。取樣時間為紫花苜蓿初花期，具體日期為2019年6月15日。

首先，每個盆中隨機(jī)摘取健康葉片100 片，測定每片葉片的葉寬和葉長，采用曹亦芬等[23]的方法計算單個葉片的葉面積，后將葉片置于鋁盒，放入70℃烘箱中烘48 h 稱重，利用葉片面積和葉片重量計算比葉面積。其次，測定盆中每株紫花苜蓿的株高和一級分枝數(shù)，其平均值作為該盆的紫花苜蓿單株株高和分枝數(shù)，然后人工齊土壤表面收獲地上部分，分離莖葉，其中葉片放入冰盒中保存，于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)采用丙酮提取法測定葉綠素含量[24]。最后，采用整體收獲紫花苜蓿地下部分(包括根頸)，輕輕用手刨開土壤表層，露出根頸，采用游標(biāo)卡尺測定根頸直徑，采用鋼卷尺測定主根長度，然后采用游標(biāo)卡尺測定主根直徑，測定位置為根頸向下2 cm[25]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用 One-Way ANOVA 檢驗(yàn)各個指標(biāo)數(shù)據(jù)的方差齊性，若方差不齊性，則采用對數(shù)轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)，使其滿足方差齊性，若方差還不齊性，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。然后采用 Two-Way ANOVA 檢驗(yàn)土壤含水量與植株密度互作對各個被遴選指標(biāo)的顯著性影響，若植株密度和土壤含水量互作不顯著，則不做進(jìn)一步分析；若植株密度和土壤含水量互作對某一個指標(biāo)的影響顯著，采用Tukey 比較法進(jìn)行多重比較。使用MATLAB 擬合該指標(biāo)與植株密度和土壤含水量之間的關(guān)系，建立二元回歸模型，利用fminsearch 函數(shù)尋優(yōu)，獲取理論最佳值。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤水分和植株密度互作對紫花苜蓿株高、分枝數(shù)和根頸直徑的影響

土壤水分顯著影響了紫花苜蓿的株高、分枝數(shù)和根頸直徑 (P＜0.05)；植株密度和土壤水分與植株密度互作顯著影響了紫花苜蓿的根頸直徑，但對株高和分枝數(shù)沒有顯著影響(P＞0.05) (表1) 。隨土壤含水量增加，紫花苜蓿株高、分枝數(shù)和根頸直徑均呈先增高后降低的趨勢，當(dāng)土壤含水量為飽和含水量的W2(75%～80%) 時3 個指標(biāo)均達(dá)到峰值。隨植株密度增加，紫花苜蓿根頸直徑呈下降趨勢，表現(xiàn)為10 株·盆-1(D1) 和15 株·盆-1(D2)均顯著高于20株·盆-1(D3) (P＜0.05)，但D1和D2間無顯著差異。

表1 土壤水分和植株密度互作對紫花苜蓿株高、分枝數(shù)和根頸直徑的影響Table 1 Effects of soil water and plant density interaction on plant height,branch number and root neck diameter of alfalfa

紫花苜蓿根頸直徑F(X1，X2)與土壤含水量(X1)和植株密度(X2) 間的數(shù)學(xué)擬合方程為F(X1，X2) ＝0.301 38 ＋ 0.030 24X1＋ 0.040 91X2-0.000 007 15X12-0.000 007X22-0.000 068 57X1X2，F(xiàn)檢驗(yàn)時，P=0.038 99，R2＝ 0.640 55，說明土壤含水量、植株密度與紫花苜蓿主頸直徑具有顯著回歸關(guān)系。X1、X2的一次項(xiàng)系數(shù)均為正值，說明土壤含水量和植株密度對根頸直徑表現(xiàn)為正效應(yīng)，且植株密度(X2)系數(shù)大于土壤含水量(X1)系數(shù)，說明一定范圍內(nèi)，植株密度增加對紫花苜蓿根頸直徑效應(yīng)大于土壤含水量的效應(yīng)；X1、X2的二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)數(shù)，表明該面為開口向下的拋物面(圖1) 。fminsearch 尋優(yōu)結(jié)果表明，植株密度為15.1 株·盆-1和土壤含水量為75.6%時，紫花苜蓿根頸直徑最大，約為2.21 mm。

圖1 土壤水分和植株密度互作下紫花苜蓿根莖直徑曲面圖和等高線圖Figure 1 3D response surface of main stem diameter of alfalfa between soil moisture and plant density contour map

2.2 土壤水分和植株密度互作對紫花苜蓿主根長的影響

土壤水分對紫花苜蓿主根長影響顯著(P＜0.01)，而植株密度及土壤水分和植株密度互作對紫花苜蓿主根長均無顯著影響 (表2)。隨土壤含水量的增加紫花苜蓿主根長呈上升趨勢，其中W1(85%～90%)和W2(75%～80%)處理均顯著高于W4(35%～40%)處理(P＜0.05)，其中在W2處理下主根長達(dá)到峰值，為29.87 cm。

表2 土壤水分和植株密度互作對紫花苜蓿主根長的影響Table 2 Effects of soil moisture and plant density interaction on the taproot length of alfalfa

2.3 土壤水分和植株密度互作對紫花苜蓿主根直徑的影響

植株密度對紫花苜蓿主根直徑有顯著影響 (P＜0.05)，但土壤水分、土壤水分與植株密度互作對紫花苜蓿主根直徑無顯著影響(表3)。隨植株密度的增加紫花苜蓿主根直徑呈逐漸降低的趨勢，其中D3顯著低于D1和D2，D1和 D2間無顯著差異 (P＞0.05)。

表3 土壤水分和植株密度互作對紫花苜蓿主根直徑的影響Table 3 Effects of soil moisture and plant density interaction on taproot diameter of alfalfa

2.4 土壤水分和植株密度互作對紫花苜蓿葉面積、葉片干重和比葉面積的影響

土壤水分顯著影響了紫花苜蓿的葉面積和葉片干重，但沒有顯著影響比葉面積；植株密度顯著影響了紫花苜蓿葉面積、葉片干重和比葉面積；土壤水分和植株密度互作對紫花苜蓿的葉面積、葉片干重和比葉面積均沒有顯著影響 (表4)。

表4 土壤水分和植株密度互作對紫花苜蓿葉面積、葉片干重和比葉面積的影響Table 4 Effects of soil water and plant density interaction on leaf area,leaf dry weight and specific leaf area of alfalfa

隨土壤含水量的增加，紫花苜蓿葉面積和葉片干重呈增加趨勢，其中葉面積表現(xiàn)為W1和W2、W3和W4處理間均無顯著差異(P＞0.05)，葉片干重的W1處理顯著高于W3和W4(P＜0.05)，但W3和W4間差異不顯著 (P＞0.05)。隨植株密度的增加，紫花苜蓿葉片干重呈下降趨勢，但比葉面積呈上升趨勢，其中D1處理下葉片干重達(dá)到最大值，為0.02 g，而D3處理下比葉面積最大，為147.69 mm2·g-1。

2.5 土壤水分和植株密度互作對紫花苜蓿葉綠素的影響

土壤水分和植株密度對紫花苜蓿葉綠素a、b 和a/b 均具有顯著影響(P＜0.05)，但兩者間互作對紫花苜蓿葉綠素a、b 和a/b 影響均不顯著(P＞0.05)(表5)。隨植株密度增加，紫花苜蓿葉綠素a 和b 含量均呈先增加后降低的過程，其中D2處理下葉綠素a 和葉綠素b 含量達(dá)到峰值，分別為14.52 和4.91 mg ·g-1；而此時葉綠素a/b 最低，為3.00%，且顯著低于D1(P＜0.05)，但與D3處理間無顯著差異(P＞0.05)。當(dāng)土壤含水量低于土壤飽和含水量的75%～80%時，紫花苜蓿葉綠素a 和b 含量呈下降趨勢(P＜0.05)，而葉綠素a/b 變化均較為復(fù)雜，其中W4處理顯著高于W2和W3(P＜0.05)，但W1和W4、W2和W3兩組處理間均無顯著差異(P＞0.05)。

表5 土壤水分和植株密度互作對紫花苜蓿葉綠素a、葉綠素b 含量和葉綠素a/b 的影響Table 5 Effects of soil moisture and plant density interaction on chlorophyll a,chlorophyll b content and chlorophyll a/b of alfalfa

3 討論與結(jié)論

植株性狀和葉片特征是解讀紫花苜蓿對干旱區(qū)環(huán)境適應(yīng)性的重要途徑之一，也是評價紫花苜蓿種植栽培草地維持產(chǎn)量的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，土壤含水量和植株密度互作并未顯著影響紫花苜蓿株高、分枝數(shù)、主根直徑和主根長，但顯著影響了根頸直徑；土壤含水量和植株密度分別顯著影響了紫花苜蓿的株高、分枝數(shù)、主根長和主根直徑。紫花苜蓿株高、分枝數(shù)、根頸直徑、主根直徑和主根長均隨土壤含水量增加表現(xiàn)為先增高后降低過程，主要是由于土壤水分過少時，減少了植物細(xì)胞的擴(kuò)張生長，進(jìn)而抑制植物生長[26]。土壤水分過多時，不利于紫花苜蓿根系垂直生長[9]，植物主根直徑和長度降低，對紫花苜蓿吸收土壤養(yǎng)分有負(fù)面效應(yīng)，從而一定程度上抑制了紫花苜蓿地上部生長，導(dǎo)致株高降低。隨紫花苜蓿植株密度增加，紫花苜蓿的根頸直徑和主根直徑均呈下降趨勢，主要是隨著植株密度增加，植株個體間競爭資源的能力加劇，每個單株個體獲得資源的能力相對降低，導(dǎo)致根頸直徑和主根直徑降低。苜蓿根頸不僅是紫花苜蓿一級分枝枝條的重要部位[27-28]，也是紫花苜蓿吸收、運(yùn)輸、儲存養(yǎng)分和水分的重要器官，直接影響紫花苜蓿的再生性[27,29]和抗旱性[30]，關(guān)系紫花苜蓿的生產(chǎn)性能和可持續(xù)利用[27,31]。根頸直徑越粗，越有利于形成更多的一級分枝數(shù)。本研究表明，植株密度和土壤含水量互作對根頸直徑具有最優(yōu)理論值，說明當(dāng)土壤含水量和植物密度達(dá)到耦合狀態(tài)時，紫花苜蓿根頸直徑最大，而不是植株密度越大或土壤含水量越高，其根頸直徑越大。植株密度和土壤含水量處于耦合狀態(tài)時，根頸直徑最大，理論上此時紫花苜蓿潛在的一級分枝數(shù)應(yīng)最大，但研究結(jié)果卻表明植株密度和土壤含水量互作對紫花苜蓿一級分枝數(shù)沒有理論最大值，說明紫花苜蓿一級分枝數(shù)的潛力，要變?yōu)樯a(chǎn)實(shí)際，還存在諸多的機(jī)制過程，因此，今后應(yīng)該加強(qiáng)土壤含水量和植株密度互作對紫花苜蓿植株性狀不同指標(biāo)影響機(jī)制的研究。

土壤含水量和植株密度互作均未顯著影響紫花苜蓿葉面積、葉片干重、比葉面積和葉綠素含量，但土壤含水量和植株密度卻分別顯著影響了紫花苜蓿葉面積、葉片干重、比葉面積和葉綠素含量。紫花苜蓿葉面積和葉片干重隨土壤含水量的增加呈逐漸增高的趨勢；葉綠素a、葉綠素b 呈先增高后降低的過程，主要是土壤水分較大時，紫花苜蓿長勢較好，主要能量用于擴(kuò)展葉面積，而不是積累葉綠素[32]，而土壤水分較少時，影響了細(xì)胞的擴(kuò)大和增殖，極大地限制了紫花苜蓿葉片的擴(kuò)展，進(jìn)而使紫花苜蓿葉片的葉面積減小，葉綠素含量降低，紫花苜蓿群體葉片光合性能下降[32]。隨植株密度的增加，紫花苜蓿的葉面積，葉片干重呈逐漸下降的趨勢；葉綠素a 和葉綠素b 呈先增高后降低的過程，說明植株密度過大不利于葉片展開，導(dǎo)致葉面積降低，同時加劇了紫花苜蓿個體植株根系競爭地下土壤資源的強(qiáng)度，客觀上不利于葉片葉綠素含量增加，這會減少葉片吸收光能的能力[33]。植株密度過高時葉片葉綠素含量下降，主要是高密度時紫花苜蓿群體內(nèi)通風(fēng)和透光率差，個體間營養(yǎng)和生存空間競爭激烈，且呼吸消耗增多，最終因單株獲取光照資源能力不充分，形成葉綠素含量較低的現(xiàn)象[34]。

紫花苜蓿植株性狀和葉片特征對土壤含水量和植株密度互作的影響存在不一致，其中土壤含水量和植株密度互作沒有明顯影響紫花苜蓿葉片特征，而對植株性狀指標(biāo)的影響不一致。本研究所選的植株性狀指標(biāo)中，土壤含水量和植株密度互作僅顯著影響了根頸直徑，未影響其他指標(biāo)，說明需要采用更多的植株性狀指標(biāo)去分析土壤含水量和植株密度互作對植株性狀的影響。從根頸直徑對土壤含水量和植株密度的響應(yīng)分析，植株密度為15.1 株·盆-1和土壤含水量為75.6%時，根頸分枝能力較佳，有利紫花苜蓿生長。