陶昱岑，徐淑靜，張續(xù)杰，劉新泳，展鵬

（山東大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)研究所 化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室，山東 濟南 250012）

傳統(tǒng)的藥物發(fā)現(xiàn)來源于多輪的化合物設(shè)計、合成與生物活性評價，需要從超過1060種可能的化合物結(jié)構(gòu)中去發(fā)掘潛在具有生物活性的小分子，該過程需要耗費巨大的人力、物力與時間，已經(jīng)無法滿足當(dāng)前對新藥快速發(fā)現(xiàn)的迫切需求，因此，新方法、新理念亟待發(fā)現(xiàn)[1]。

進入21世紀(jì)后，在高通量合成技術(shù)與生物活性篩選技術(shù)快速發(fā)展的基礎(chǔ)上，藥物發(fā)現(xiàn)的速度得到了極大的提升。其中，微量合成技術(shù)與生物活性篩選技術(shù)的有機結(jié)合極大地增加了先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的概率與速率。微量合成相比于傳統(tǒng)實驗室合成具有極其顯著的優(yōu)點： 1）原料使用量大大降低，節(jié)約了實驗成本的同時也降低了化學(xué)廢料的排放量，更符合綠色化學(xué)的理念； 2）可以在短時間內(nèi)平行合成大量的化合物； 3）微量合成輔以智能反應(yīng)檢測系統(tǒng)與合理的活性篩選方法，可以提高化合物從合成到活性篩選的自動化程度，極大地節(jié)省了人力物力。因此，微量合成技術(shù)在新藥研發(fā)中的應(yīng)用越來越廣泛。微量合成技術(shù)的應(yīng)用主要包括在以下幾方面： 1）基于96或384孔微孔板的微量合成； 2）基于小分子或液滴微陣列的微量合成； 3）基于微流控芯片的微量合成； 4）靶標(biāo)模板誘導(dǎo)的微量合成。本文精選近幾年的研究實例，根據(jù)微量合成的不同類別，從藥物化學(xué)的角度總結(jié)了基于微量合成的藥物研究進展。

1 基于96或384微孔板的微量合成藥物

通過在微孔板上快速構(gòu)建具有結(jié)構(gòu)多樣性的化合物庫，并輔以原位篩選技術(shù)可以極大地提高先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)效率。選擇一種合適的反應(yīng)來生成具有結(jié)構(gòu)多樣性的化合物庫是該策略的核心步驟，其基本特點為：目標(biāo)化合物產(chǎn)率高、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)易于操作。目前，該方法中常用的反應(yīng)有點擊反應(yīng)[2]、酰胺縮合反應(yīng)[3]、多組分反應(yīng)[4]等。除此之外，也有文獻報道了利用氨基與醛基生成亞胺的反應(yīng)來快速構(gòu)建聚焦型化合物庫的方法等[5]。

單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）是一種具有多個結(jié)合位點的酶，主要分布于肝、腎、胰、心等器官。正常情況下，該酶可氧化胺類底物脫氨并產(chǎn)生過氧化氫。因此，MAO的過表達會使得機體內(nèi)過氧化氫、乙醛等過量蓄積，從而導(dǎo)致神經(jīng)元異常和情緒異常[6-8]。2016年，Jia等[9]利用點擊化學(xué)微量合成輔以原位篩選技術(shù)，快速合成并篩選了40個黃酮衍生物。該化合物庫設(shè)計思路為通過點擊化學(xué)在黃酮C6位引入不同片段，伸入毗鄰位點，從而實現(xiàn)潛在的雙位點抑制作用，其中化合物1的活性最好（對MAO-A的IC50為 1.6 μmol · L-1；對MAO-B的IC50為2.1 μmol · L-1）；化合物2的選擇性最高，對MAO-A無活性，對MAO-B的IC50為（71.3±7.6）μmol · L-1，其選擇性指數(shù)（SI）大于14。

溶酶體貯積癥（lysosomal storage diseases，LSD）是一組遺傳性代謝疾病，是由于基因突變致溶酶體中有關(guān)酸性水解酶缺陷，導(dǎo)致機體中相應(yīng)的生物大分子不能正常降解而在溶酶體中貯積，引起細胞組織器官功能障礙[10]。由LSD引發(fā)的戈謝病在世界各地均有報道，然而現(xiàn)在臨床對其缺乏有效的治療手段。2017年，Martínez-Bailén等[11]在吡咯亞氨基糖骨架的基礎(chǔ)上，通過點擊化學(xué)在96孔板上快速構(gòu)建了2類聚焦型化合物庫，并通過后續(xù)生物活性篩選發(fā)現(xiàn)了選擇性β-葡糖腦苷脂酶抑制劑3（IC50= 11 μmol · L-1）和4（IC50= 19 μmol · L-1）。2018年，Carmona等[12]通過點擊反應(yīng)原位篩選技術(shù)發(fā)現(xiàn)了α-巖藻糖苷酶抑制劑二聚體化合物5，β-半乳糖苷酶抑制劑二聚體化合物6，其中化合物5的抑制常數(shù)Ki為0.15 nmol · L-1；化合物6的Ki為5.8 μmol · L-1。

藍氏賈第鞭毛蟲是一種常見的能引起患者腹瀉的寄生蟲[13-15]。目前治療賈第蟲病的主要藥物是硝基雜環(huán)類藥物，包括咪唑衍生物、甲硝唑、替硝唑、噻唑、硝唑苯胺衍生物等。但這些藥物的治療失敗率仍高達20%，并且有報道其體內(nèi)外的耐藥性[16]。Kim等[17]通過經(jīng)典點擊化學(xué)——銅（I）催化的炔烴-疊氮化物環(huán)加成反應(yīng)[The copper(I)-catalyzed alkyneazide cycloaddition，CuAAC]快速微量合成了442個含有不同側(cè)鏈取代基的氮雜環(huán)衍生物。對該化合物庫直接進行活性篩選，發(fā)現(xiàn)化合物7對代表性的藍氏賈第鞭毛蟲突變株BRIS/83/HEPU/106具有良好的活性（EC50= 0.07 μmol · L-1）。

耐藥性的產(chǎn)生是癌癥治療失敗的主要原因之一。多藥耐藥相關(guān)蛋白1（multidrug resistanceassociated protein 1，MDR1）是一種腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine-triphosphate，ATP）結(jié)合蛋白，其可以將藥物泵出胞外，從而減少藥物在腫瘤細胞中的蓄積，降低藥物對腫瘤細胞的殺傷作用[18-19]，抑制MDR1活性可以減少藥物外排量，從而達到藥物原有的治療效果。據(jù)報道，天然產(chǎn)物中的黃酮類化合物是該靶標(biāo)良好的小分子抑制劑，Wong等[20]選取黃酮結(jié)構(gòu)為基本骨架，通過點擊化學(xué)微量合成的方法在微孔板上高效地構(gòu)建了含有300個二聚體黃酮衍生物的化合物庫，原位篩選技術(shù)發(fā)現(xiàn)35個化合物對加有阿霉素（doxorubicin，DOX）的2008/MRP1細胞表現(xiàn)出較高的抑制率，后續(xù)活性復(fù)篩發(fā)現(xiàn)化合物8活性較好，EC50為（41±3） nmol · L-1，其對加有DOX的2008/MRP1細胞表現(xiàn)出了較好的活性，相比陽性對照MK571（9，EC50= 19 μmol · L-1）活性提升了400多倍。后續(xù)機制研究表明，化合物8在細胞內(nèi)可以有效抑制MRP1細胞活性，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對DOX的外排作用，增強了DOX對耐藥腫瘤細胞株的殺傷力。

谷氨酰胺酶（glutaminase，GLS1）是一種氨基水解酶，是腫瘤細胞生長與增殖的重要調(diào)控蛋白，通過抑制GLS1活性可以有效抑制腫瘤細胞的增殖擴散[21]。因此，基于GLS1的小分子抑制劑研究非常重要。Xu等[22]以CB839（10）和BPTES（11）為先導(dǎo)化合物，通過生物電子等排策略，分別將CB839和BPTES右翼的苯環(huán)替換為三氮唑環(huán)。隨后通過點擊化學(xué)微量合成的方法將該片段與不同的小分子片段連接，在微孔板上高效地合成了200個目標(biāo)化合物。后續(xù)活性篩選發(fā)現(xiàn)化合物12（IC50= 0.041 μmol · L-1）的活性超過陽性對照CB839（IC50= 0.11 μmol · L-1）。

2018年，He等[23]選取O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽（O-benzotriazole-N，N，N'，N'-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate，HBTU）催化的酰胺縮合反應(yīng)，在室溫下僅用12 h便在微孔板中平行合成了4個化合物庫（共768個化合物）。對庫中化合物快速篩選發(fā)現(xiàn)化合物13 ~ 15活性較好，抑酶活性復(fù)篩發(fā)現(xiàn)化合物13 ~ 15對蛋白酪氨酸磷酸酶2（src homology 2 containing protein tyrosine phosphatase 2，SHP-2）具有良好的抑制活性，其中，化合物13的IC50為（1.5±0.1） μmol · L-1；化合物14的IC50為（1.4±0.04）μmol · L-1；化合物15的IC50為（2.3±0.04）μmol · L-1，化合物13的活性是陽性對照藥物頭孢磺啶[IC50=（16.8±2.0）μmol · L-1]的10多倍。藥理機制實驗表明，化合物13在細胞層面可以通過抑制SHP-2介導(dǎo)的信號通路來抑制腫瘤細胞的增殖。

近期，筆者所在課題組以細胞分裂周期因子25蛋 白（cell division cycle 25 phosphatase，Cdc25 phosphatase）磷酸酶的代表性抑制劑NSC663284（16）為先導(dǎo)化合物，選取優(yōu)勢萘醌片段，在其右翼通過點擊化學(xué)微量合成的方式引入不同的取代基，發(fā)現(xiàn)了高活性、高選擇性的Cdc25C磷酸酶抑制劑17，其 對Cdc25A的IC50為（0.53±0.03）μmol · L-1；對Cdc25B的IC50為（1.39±0.95）μmol · L-1；對Cdc25C的IC50為（0.09±0.01）μmol · L-1，其對Cdc25C活性相對于先導(dǎo)化合物NSC663284（IC50= 0.76 μmol · L-1）提高了近10倍[24]。此外，筆者所在課題組以二芳基嘧啶（diarylprimidines，DAPY）類化合物為先導(dǎo)，運用基于藥效團模型與靶標(biāo)結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計對DAPY類非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor，NNRTI）進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化[25]。隨后通過點擊化學(xué)微量合成的方法快速合成了234個DAPY衍生物，輔以原位篩選技術(shù)與活性復(fù)篩，短時間內(nèi)發(fā)現(xiàn)了人類免疫缺陷病毒1型（humam immunodeficiency virus-1，HIV-1）抑制劑化合物18，其EC50為3.28 nmol · L-1。同時，化合物18對HIV雙突變株RES056也具有抑制活性，其EC50為481 nmol · L-1。

2021年，Sangouard等[26]將聲學(xué)液滴噴射（acoustic droplet ejection，ADE）技術(shù)與基于微孔板的微量合成相結(jié)合，短時間內(nèi)構(gòu)建了大型組合大環(huán)化合物文庫。隨后通過直接篩選快速發(fā)現(xiàn)了鼠雙微粒體基因-2蛋白和p53蛋白（murine double minute 2-p53，MDM2-p53）蛋白-蛋白相互作用的抑制劑19，其展現(xiàn)出了良好的抑酶活性，IC50為（0.6 ±0.2） μmol · L-1。傳統(tǒng)的基于微孔板的高通量合成受到高成本移液頭和合成所需的毫克級前體化合物等因素的限制。為克服上述缺點，Sangouard等[26]對建庫方法進行了改進，并首次報道了應(yīng)用ADE技術(shù)，將砌塊庫逐步轉(zhuǎn)移到384孔微量滴定板中來合成大型組合大環(huán)化合物文庫的方法。該方法與傳統(tǒng)微孔板合成（反應(yīng)液體積為微升）相比，僅需要納升體積的反應(yīng)液，為基于微孔板的微量合成提供了全新的思路，避免了前體物料的過度消耗，進一步實現(xiàn)了綠色化學(xué)的理念。

需要指出的是，CuAAC是經(jīng)典的點擊化學(xué)反應(yīng)之一，但由于該反應(yīng)中催化所必需的銅離子對生物體系中的酶、細胞等具有毒性，因此易造成假陽性或假陰性結(jié)果。2004年，Agard等[27]提出了無銅催化的炔烴-疊氮環(huán)加成反應(yīng)（strain-promoted azidealkyne cycloaddtion，SPAAC）。通過環(huán)的構(gòu)象限制，可以提高炔烴的反應(yīng)活性，從而使得SPAAC可以在溫和的無銅催化下進行。半胱氨酸蛋白酶（Caspase）是一類非常保守的蛋白酶，其可以調(diào)控細胞的凋亡和促炎細胞因子的成熟，Qian等[28]選擇Vertex公司研發(fā)的口服Caspase-1抑制劑pralnacasan（20）為先導(dǎo)化合物，通過骨架躍遷策略，將pralnacasan分子中的六元和七元并環(huán)結(jié)構(gòu)替換為三氮唑并八元環(huán)，而后通過SPAAC反應(yīng)，在微孔板中快速合成了52個化合物。由于該反應(yīng)液中不含銅離子，因此可以直接用于細胞活性的初步篩選，接著選取抑制率最高的5個化合物對其進行了后續(xù)的活性復(fù)篩。生物實驗結(jié)果表明化合物21活性較好，其對Caspase-1的IC50為（0.899±0.001） μmol · L-1、對Caspase-3的IC50大 于 100 μmol · L-1、對Caspase-7的IC50大于140 μmol · L-1。

在96或384微孔板上進行的微量合成除了上述的點擊反應(yīng)外，還包括多組分反應(yīng)。2020年，Osipyan等[29]報道了利用微量多組分反應(yīng)制備亞胺基吡咯烷聚焦庫的方法。該方法核心是利用即時噴點移液（immediate drop on demand technology，I-DOT）技術(shù)將載有原料的溶液準(zhǔn)確加入到384孔板中，并控制每孔所含反應(yīng)液為660 nL。反應(yīng)16 h后，將反應(yīng)液注入質(zhì)譜（mass spectra，MS）中進行檢測，結(jié)果顯示大部分微孔（66%）中目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率都在中等及偏上水平（≥ 50%）。接著，Osipyan等[29]又隨機選擇了12個微孔中的反應(yīng)進行毫摩爾級的擴大量合成以驗證其產(chǎn)率。結(jié)果顯示，反應(yīng)底物有環(huán)酮時，反應(yīng)具有不錯的產(chǎn)率（82% ~ 83%），然而當(dāng)酮類底物為環(huán)丁酮時，反應(yīng)產(chǎn)率僅有34%。醛基底物中，脂肪醛相比于芳香醛，更有利于目標(biāo)化合物的生成。該方法的報道豐富了微孔板合成技術(shù)的反應(yīng)類型，為后續(xù)基于微孔板的微量合成提供了新的反應(yīng)類型。同時，I-DOT技術(shù)的出現(xiàn)使得微量合成反應(yīng)中加料量的精確度進一步提升，更加有利于微孔板中反應(yīng)的進行。

2021年，Gao等[30]通過聲學(xué)傳感移液技術(shù)將3組分反應(yīng)液快速固定在微孔板中，短時間內(nèi)合成了1 536個化合物，后續(xù)通過原位篩選和抑酶活性復(fù)篩實驗發(fā)現(xiàn)化合物22，其對多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤1型基因編碼蛋白（Menin）表現(xiàn)出了微摩爾級的活性，其IC50為2.8 μmol · L-1。除此之外，Gao等[30]通過共晶進一步探討了化合物22與Menin蛋白的結(jié)合模式（見圖1A）。2021年，Sutanto等[31]通過Ugi多組分反應(yīng)和Passerini多組分反應(yīng)分別在96和384微孔板上快速構(gòu)建了具有結(jié)構(gòu)多樣性的化合物庫，由于終產(chǎn)物水溶性較差，當(dāng)反應(yīng)完成時，大部分終產(chǎn)物在微孔中直接析出，核磁氫譜顯示，該類析出化合物純度較高（純度大于 80%），而未析出的化合物可以通過快速柱層析迅速純化。隨后的高通量蛋白-小分子共晶實驗發(fā)現(xiàn)，4個苗頭化合物23 ~ 26與活性位點的氨基酸殘基Cys145形成共價結(jié)合，通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）實驗測定以上4個苗頭化合物對2019新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的主蛋白酶（3CL-Pro）的活性，其IC50分別為3.96、139.1、9.39及2.36 μmol · L-1，其結(jié)合模式如圖1B所示。

圖1 化合物22 ~ 26的結(jié)構(gòu)式及其與靶蛋白的結(jié)合模式Figure 1 Structures and binding modes of compounds 22 ~ 26

綜上，基于微孔板的高通量合成技術(shù)可以在短時間內(nèi)平行合成大量化合物，極大地提高了苗頭化合物/先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的概率。同時，微量的條件下，反應(yīng)溶劑及試劑的消耗量極小，節(jié)約原料的同時，也減少了有毒廢棄物的排放，更符合綠色化學(xué)理念。除此之外，基于微孔板的微量合成技術(shù)由于其操作的簡便性、方法的實用性等優(yōu)點，越來越多的實驗室將該方法運用到了新藥研發(fā)中[32-33]。

2 基于小分子或液滴微陣列的藥物

1995年，Schena 等[34]發(fā)明DNA微陣列技術(shù)，將已知序列的寡核苷酸固定在固體表面上，同時將待檢測的探針核酸序列與上述已知的核苷酸序列進行雜交，從而實現(xiàn)基因信息的快速檢測。隨著化學(xué)的發(fā)展，微陣列技術(shù)不再局限于DNA分子，蛋白質(zhì)分子、化學(xué)合成小分子等也相繼被固定到固相表面用于微陣列分析。小分子微陣列技術(shù)（small molecule microarray，SMM）是指將目標(biāo)化合物有序地固定到固體表面，從而實現(xiàn)快速、平行的活性篩選的技術(shù)[35]。SMM技術(shù)包含：化合物庫的合成、化合物的固定等，與傳統(tǒng)有機溶劑中的合成相比，SMM技術(shù)中的固相合成技術(shù)具有以下顯著優(yōu)點：自動化程度高、反應(yīng)產(chǎn)率高，因此，其應(yīng)用越來越廣泛[36-38]。

乳腺癌相關(guān)基因1編輯蛋白（breast cancer 1 protein，BRCA1）是一種包含有磷酸化絲氨酸結(jié)合域的細胞調(diào)控蛋白，其可以抑制細胞的癌變，在DNA損傷的修復(fù)中發(fā)揮重要作用。在多種腫瘤細胞中均發(fā)現(xiàn)了突變型的BRCA1，因此針對BRCA1突變型的小分子抑制劑研發(fā)非常重要[39]。Na等[40]通過SMM技術(shù)，將優(yōu)勢氨基酸片段固定于活化玻璃板上，通過微量的酰胺縮合反應(yīng)，快速合成了101個擬肽類化合物。接著Takaoka等[39]使用N，N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷對玻璃板進行多輪的清洗，快速除掉殘留的反應(yīng)液和催化劑，從而對玻璃板上的化合物進行準(zhǔn)確的活性篩選。該方法極大地縮短了化合物合成到先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的時間，Takaoka等[39]利用該方法成功地發(fā)現(xiàn)BRCA1抑制劑27（IC50= 0.31 μmol · L-1）（見圖2）。

圖2 先導(dǎo)化合物27的發(fā)現(xiàn)過程及結(jié)構(gòu)式Figure 2 Discovery and structure of compound 27

2017年，Peng等[41]針對多聚ADP-核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）進行合理藥物設(shè)計，利用SMM技術(shù)，通過CuAAC點擊反應(yīng)在樹脂板上微量合成了1 120個化合物，后續(xù)的活性篩選發(fā)現(xiàn)化合物28是PARP14雙位點抑制劑（IC50= 0.49 μmol · L-1）。為了探討化合物28與PARP14的具體結(jié)合模式，Peng等[41]進行了共晶的培養(yǎng)，結(jié)果顯示化合物28同時結(jié)合于2個空腔中，并與Ser1700、Ser1688、Thr1684、Ser1722等多個氨基酸殘基形成了氫鍵作用（見圖3）。

圖3 化合物28的設(shè)計、合成過程及其與PARP14蛋白的結(jié)合模式圖（PDB ID：5LYH）Figure 3 The design and synthesis of compound 28 and its mode of binding with PARP14（PDB ID：5LYH）

RNA是體內(nèi)重要的遺傳信息載體，其中微小核糖核酸21型（microRNA-21，miRNA-21）在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了過表達的現(xiàn)象。敲除腫瘤細胞中的miRNA-21后可以誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡。2010年，Medina等[42]通過小鼠模型確證了miRNA-21的過表達與前體B細胞淋巴瘤的發(fā)生直接相關(guān)。然而，針對RNA的高親和力小分子抑制劑鮮有報道。2017年，Connelly等[43]通過微量合成將20 000個小分子固定于γ-氨基丙基硅烷 （γ--aminopropyl silane，GAPS）玻璃板上，接著將其與熒光標(biāo)記的premiRNA-21共孵育1 h后，通過熒光成像的不同判斷小分子與miRNA-21的結(jié)合力強弱（評分Z-score＞3即被認為是苗頭化合物）。其中，19個化合物（Z-score＞3）表現(xiàn)出了對miRNA-21較好的親和力。后續(xù)活性復(fù)篩發(fā)現(xiàn)化合物29和30活性最好，其中，化合物29的解離常數(shù)（Kd）為（2.3±0.5） μmol · L-1；化合物30的Kd為（0.8±0.2）μmol · L-1。

2019年，Rosenfeld等[44]報道了在納米聚合材料上微量合成多肽的方法，其開發(fā)的納米聚合材料上有序地分布著親水性微孔，孔內(nèi)含有活化的光敏性鏈接基團，從而有效地支持孔內(nèi)肽段的固相合成。Rosenfeld等[44]還證實該方法除了支持肽段合成以外，還可以在微孔中加入反應(yīng)液進行微量的小分子化合物合成。后續(xù)通過特定波長的紫外光照射光敏性鏈接基團，使其斷裂，從而釋放出目標(biāo)產(chǎn)物。通過改變光線照射時長與光線強度等因素，可以有效控制目標(biāo)化合物釋放的數(shù)量和時間等。該技術(shù)實現(xiàn)了目標(biāo)化合物的微量合成與光誘導(dǎo)的控制釋放，輔以后續(xù)的原位篩選技術(shù)可以極大地提高化學(xué)合成到活性篩選的效率，增加苗頭化合物的發(fā)現(xiàn)機率。

除了上述小分子微陣列技術(shù)以外，液滴微陣列也同樣是一種常見的微陣列技術(shù)。液滴微陣列技術(shù)是指將含有目標(biāo)化合物的甘油溶液有序滴加在固相表面，從而直接進行活性篩選的技術(shù)。該技術(shù)有著諸多優(yōu)勢： 1）無需將溶液蒸干，液滴即為合成反應(yīng)的微環(huán)境； 2）與小分子微陣列相比，液滴微陣列技術(shù)無需通過化學(xué)反應(yīng)將化合物共價結(jié)合于平板表面，甘油自帶的表面張力與附著力保證了液滴有序地排列在固相表面； 3）甘油的微環(huán)境可以使得多種酶在體外環(huán)境中變得穩(wěn)定，同時，甘油也是一種極佳的液體介質(zhì)，其與二甲亞砜、水等常見溶劑完全互溶[45-47]。

由于干細胞的自我更新能力和高度分化能力[48-49]，使其在過去的幾十年中引起了醫(yī)學(xué)生物學(xué)家們越來越廣泛地關(guān)注。通過基于干細胞的高通量篩選發(fā)現(xiàn)對自身組織具有促進更新與修復(fù)能力的小分子化合物是一項極有意義的研究[50-52]。但該研究的實施面臨著諸多問題，其中最主要的問題是干細胞在培養(yǎng)時會自發(fā)地細胞分化，從而使得實驗失敗。2017年，Tronser等[53]證明了液滴微陣列技術(shù)可以成功阻止干細胞的自發(fā)性細胞分化。實驗中，Tronser等[53]發(fā)現(xiàn)液滴中的鼠源干細胞狀態(tài)趨于穩(wěn)定，自發(fā)的細胞分化作用停止了72 h。后續(xù)機制實驗表明，該現(xiàn)象可能歸因于固相載體表面的孔隙率和粗糙程度。雖然該實驗僅短時間內(nèi)抑制了干細胞的自發(fā)分化作用，但為后續(xù)干細胞藥物研發(fā)提供了全新的思路與方法。

2020年，Brehm等[54]在之前研究基礎(chǔ)之上報道了光控釋放目標(biāo)產(chǎn)物的液滴微陣列技術(shù)。他們在玻璃薄片上覆蓋一層多孔的納米聚合物材料，該材料每個微孔中都含有1個光敏連接鏈用以誘導(dǎo)微孔中的反應(yīng)進行。當(dāng)反應(yīng)完成時，通過多次洗滌該玻璃板，將殘留的反應(yīng)液清除干凈，之后在納米微孔中滴加溶劑，并同時使用365 nm的紫外光照射來控制產(chǎn)物按需釋放入微孔液滴中。后續(xù)通過在液滴中直接加入細胞，從而進行快速的活性篩選。Brehm等[54]在該技術(shù)基礎(chǔ)之上，使用Ugi四組分反應(yīng)，在微滴中快速合成了588個化合物。

3 基于微流控芯片的藥物

從中世紀(jì)的煉金術(shù)開始，人們習(xí)慣于在玻璃器皿（燒瓶、燒杯）中操縱反應(yīng)原料，獲得產(chǎn)物。然而，面對人類對新物質(zhì)、新規(guī)律的不斷需求，傳統(tǒng)玻璃器皿的劣勢日漸凸顯：集成化、自動化程度低，資源浪費，選擇性、重現(xiàn)性差，以及安全隱患等。在此背景下，微流控芯片反應(yīng)器應(yīng)運而生，并以其獨特優(yōu)勢，在合成方法學(xué)、藥物篩選以及大規(guī)模應(yīng)用等諸多領(lǐng)域扮演著重要角色。

微流控芯片反應(yīng)器一般是指微加工和精密加工技術(shù)制造的小型反應(yīng)系統(tǒng)，內(nèi)部微通道尺寸在亞微米到亞毫米數(shù)量級。常見的微流控芯片反應(yīng)器從材質(zhì)上分，有玻璃/石英/硅芯片、聚合物芯片和金屬芯片3類[55-57]。

玻璃和石英芯片因具有優(yōu)異的電滲、光學(xué)和表面性質(zhì)，其刻蝕加工方法和表面改性的化學(xué)方法比較成熟[33,58]。但由于玻璃芯片不耐強酸，因此其應(yīng)用也具有一定局限性。

有機聚合物類芯片由于其種類較多、加工方便，是玻璃和石英芯片不錯的替代品。聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）芯片具有良好的光學(xué)性能，價格便宜易加工，應(yīng)用比較廣泛。PDMS的化學(xué)性質(zhì)大部分情況趨于穩(wěn)定，但遇到丙酮等會發(fā)生形變，并且這類芯片散熱不及玻璃和石英[59]。

不銹鋼芯片相比于以上3種芯片的穩(wěn)定性較高。這類芯片一般為多模塊組裝而成，易拆卸可清洗，避免了微通道發(fā)生堵塞而使整個反應(yīng)器報廢。但由于該類芯片的特殊材質(zhì)和各模塊的精密加工，不銹鋼芯片成本非常高，對微加工技術(shù)的要求也很高[60-61]。

不同材質(zhì)的微流控反應(yīng)器都具有擴散距離短、傳質(zhì)更快的優(yōu)點?；瘜W(xué)反應(yīng)的實質(zhì)在于分子的碰撞從而反應(yīng)生成新的化學(xué)鍵，因此合成中反應(yīng)物的混合情況是提高反應(yīng)效率的關(guān)鍵之一。其次，微流控芯片反應(yīng)器相比傳統(tǒng)圓底燒瓶等反應(yīng)容器在比表面積上有了飛躍。微流控芯片反應(yīng)器比表面積通常可以達到5 000~50 000 m2· m-3，超大的換熱面積使微反應(yīng)器的熱傳導(dǎo)系數(shù)與常規(guī)反應(yīng)器相比高出10倍，無論是對反應(yīng)的加熱還是反應(yīng)本身釋放的熱量都可以快速傳遞，從而使反應(yīng)溫度更穩(wěn)定，反應(yīng)過程的控溫更容易[62]。

以上幾大優(yōu)勢使得微反應(yīng)器在有機合成中的應(yīng)用越來越廣泛，這方面的研究也在不斷深入。

Grisoni等[63]將人工智能輔助藥物設(shè)計與微流控反應(yīng)器有機結(jié)合，極大地提高了苗頭化合物發(fā)現(xiàn)的效率。他們首先針對肝X受體（liver X receptor，LXR）利用人工智能深度學(xué)習(xí)的方法對所獲得化合物庫進行虛擬篩選，同時對篩選所得分子進行合成可行性分析，最后得到了44個具有全新結(jié)構(gòu)的可合成化合物。其中，41個化合物通過自動化的微流控反應(yīng)儀合成，3個化合物從試劑公司購買所得。接著Grisoni等[63]對其進行了活性測試，發(fā)現(xiàn)化合物31和32分別是LXRα和LXRβ型的激動劑，其EC50分別為 （0.183±0.006）和（0.34±0.02） μmol · L-1。該結(jié)果進一步證明了微流控合成在藥物合成領(lǐng)域的可行性。同時，將微流控反應(yīng)儀與人工智能深度學(xué)習(xí)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）等分子設(shè)計與反應(yīng)實時監(jiān)測的方法整合，加快了苗頭化合物發(fā)現(xiàn)速率。

4 基于靶標(biāo)模板誘導(dǎo)的合成策略

靶標(biāo)模板誘導(dǎo)的合成（target-guided synthesis，TGS）是藥物發(fā)現(xiàn)中一種極其重要的策略，該策略以蛋白質(zhì)靶標(biāo)為模板誘導(dǎo)與其結(jié)合的小分子片段相互連接。該策略主要分為2類： 1）動態(tài)組合化學(xué)（dynamic combinatorial chemistry，DCC），其目的在于建立可變通的適合新藥開發(fā)的組合庫，其途徑類似于分子水平上的達爾文進化論。通過“適者生存”的方法，在組合庫重組的過程中，與模板無關(guān)的化合物或結(jié)合比較弱的配體逐漸“死亡”減少，解離成原來的“分子單元”，而這些分子單元在模板的引導(dǎo)下重新組合、反應(yīng)，形成新的活性配體，它們以此方式“繁殖”增加。組合庫的分子單元作為“生存”的競爭者，依賴于單元之間的可逆反應(yīng)，與模板牢固結(jié)合的分子將產(chǎn)生新分子，然而，與模板結(jié)合較弱的分子將作為原料留在母液中。2）不可逆的蛋白模板誘導(dǎo)合成（kinetic target-guided synthesis，KTGS），該方法與DCC唯一不同的是，KTGS中的片段鏈接是不可逆的[64-66]。目前，2種方法均已被成功運用在多種靶標(biāo)的苗頭化合物的發(fā)現(xiàn)中[67]。

2017年，Wang等[68]在DCC策略的指導(dǎo)下，通過點擊化學(xué)原位合成技術(shù)將低活性（IC50＞1 mmol · L-1）的不同小分子片段拼接，發(fā)現(xiàn)了2個具有透膜性的化合物33和34（見圖4A），其IC50分別為139和66.7 μmol · L-1。同年，Bhardwaj等[69]以2型環(huán)氧化酶（cyclooxygenase-2，COX-2）蛋白為模板，通過原位點擊反應(yīng)發(fā)現(xiàn)化合物35和36（見圖4B）（化合物35：IC50= 0.09 μmol · L-1；化合物36：IC50= 0.05 μmol · L-1）展現(xiàn)出了與陽性藥物塞來昔布（IC50= 0.07 μmol · L-1）相當(dāng)?shù)囊置富钚?。后續(xù)動物模型實驗發(fā)現(xiàn)化合物35和36在小鼠體內(nèi)活性明顯優(yōu)于陽性藥物塞來昔布，其半數(shù)有效量（median effective dose，ED50）分別為0.44 和0.12 mg · kg-1，而塞來昔布ED50為10.8 mg · kg-1。構(gòu)效關(guān)系分析表明，在引入甲磺?；幮F后，化合物的活性有所提高。

圖4 化合物33 ~ 36的發(fā)現(xiàn)過程及其結(jié)構(gòu)式Figure 4 The discovery and structures of compounds 33 ~ 36

靶標(biāo)模板誘導(dǎo)的合成中除了常見的點擊反應(yīng)以外，2020年，Mancini等[70]首次報道了蛋白模板誘導(dǎo)的原位四組分Ugi反應(yīng)。Mancini等[70]利用endothiapepsin蛋白為模板，選取羧基砌塊庫、氨基砌塊庫、氰基砌塊庫和醛基砌塊庫合成了48個化合物，其中化合物37和38對endothiapepsin蛋白表現(xiàn)出了微摩爾級的活性，其IC50分別為（1.3±0.03）和（3.5±0.1） μmol · L-1。隨后，Mancini等[70]又將原位四組分反應(yīng)成功應(yīng)用在了細菌β-滑動鉗DnaN蛋白模板上，并發(fā)現(xiàn)了化合物39和40可以與靶標(biāo)蛋白相結(jié)合，其Kd分別為650和510 μmol · L-1。原位四組分反應(yīng)在2種蛋白模板上的成功豐富了TGS策略中的反應(yīng)類型。除此之外，Mancini等[70]觀察到Ugi反應(yīng)中的副反應(yīng)（Pictet-Spengler環(huán)合反應(yīng)）也在原位合成實驗中同時發(fā)生，因此，基于該類副反應(yīng)的蛋白模板誘導(dǎo)合成或許又是一種全新的嘗試。

值得注意的是，在大多數(shù)靶標(biāo)模板誘導(dǎo)的小分子片段組裝中，對酶的純度要求較高，這也限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。2018年，Antti等[71]報道了在細胞內(nèi)的蛋白模板誘導(dǎo)合成，為那些難以純化的蛋白模板提供了新的思路。

綜上所述，雖然TGS展現(xiàn)出了其在苗頭化合物發(fā)現(xiàn)中的高效性，但該技術(shù)依舊存在諸多限制。比如對蛋白質(zhì)與目標(biāo)小分子復(fù)合物的分析技術(shù)還未完全成熟，雖然現(xiàn)階段可通過共晶、核磁共振以及HPLC-MS等技術(shù)對蛋白質(zhì)-小分子復(fù)合物進行分析，但這幾類技術(shù)需要耗費大量的時間。除此之外，文獻中報道的能用于TGS方法的反應(yīng)比較匱乏，常見的反應(yīng)有：點擊反應(yīng)、酰胺縮合反應(yīng)、環(huán)氧乙烷的開環(huán)反應(yīng)等。因此，新的反應(yīng)類型和新型檢測技術(shù)亟需被發(fā)現(xiàn)。

5 結(jié)語與展望

在新藥研發(fā)中，藥物化學(xué)家們通過微量合成將優(yōu)勢片段、優(yōu)勢結(jié)構(gòu)進行重組裝，在保證藥物設(shè)計合理性與結(jié)構(gòu)新穎性的同時，加速了化合物庫的構(gòu)建，解決了新藥研發(fā)中“如何快速獲得大量目標(biāo)化合物”的難題。隨著分析檢測技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建化合物庫的同時也能對其進行結(jié)構(gòu)鑒定，如微量合成與LC-MS技術(shù)的聯(lián)用等。

同時，在多樣性導(dǎo)向合成理念的指導(dǎo)下，通過微量合成將現(xiàn)有小分子砌塊庫排列組合，進一步豐富了化合物庫的結(jié)構(gòu)多樣性，為藥物化學(xué)家們闡明靶標(biāo)與化合物的潛在構(gòu)效關(guān)系提供了有力保障。除此之外，生物活性篩選技術(shù)的發(fā)展，使得對化合物庫的活性篩選更加準(zhǔn)確，假陽性/假陰性結(jié)果逐步減少，進一步促進了苗頭化合物的發(fā)現(xiàn)。在苗頭化合物的基礎(chǔ)之上，微量合成與晚期多樣性修飾等新理念的有機結(jié)合可以縮短從苗頭到先導(dǎo)化合物所需的時間。

誠然，微量合成加速了苗頭化合物發(fā)現(xiàn)的速率，但以下問題依舊值得注意： 1）片段的類藥性； 2）小分子砌塊庫的多樣性； 3）分子片段的手性異構(gòu)以及其大小等，這些問題直接決定了微量合成所構(gòu)建化合物庫的質(zhì)量，從而間接決定了最后苗頭化合物發(fā)現(xiàn)的成功與否。此外，微量合成所使用的反應(yīng)類型也是庫的構(gòu)建中一項決定性因素。因此，基于微量合成的藥物發(fā)現(xiàn)需要藥物化學(xué)家們綜合考慮多種因素[72-73]。

綜上所述，微量合成與新方法、新理念的創(chuàng)新性組合，幫助藥物化學(xué)家們節(jié)約了大量的人力和物力，縮短了藥物研發(fā)所需的時間，將“以小博大”體現(xiàn)得淋漓盡致。雖然現(xiàn)階段微量合成在藥物研發(fā)中依舊面臨著部分不足之處，但隨著各學(xué)科的發(fā)展，學(xué)科之間的交叉與融合越來越廣泛、新方法與新理念的有機結(jié)合越來越普遍，微量合成在新方法、新理念的促進下變得越來越成熟，為應(yīng)對未來公共健康危機的新藥研發(fā)提供了全新的思路。