王益玲，王留珍，馮海燕

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001； 2.柳州市人民醫(yī)院 耳鼻咽喉科，廣西 柳州 545000)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是一種由基因與環(huán)境因素互相作用而引起的變態(tài)反應(yīng)性疾病，臨床以鼻塞、流清涕、鼻癢及黏膜蒼白水腫為特點(diǎn)[1]。作為最常見的上呼吸道疾病之一，AR在全球發(fā)病率逐年增長，患病總?cè)藬?shù)超過5億，且患病人群中約有20%～30%的成年人癥狀明顯，兒童的比例可能更高[2]。除了與變態(tài)反應(yīng)過程直接相關(guān)的鼻和眼癥狀外，AR也會(huì)對人們睡眠的干擾，導(dǎo)致白天嗜睡、疲勞和情緒變化，最終嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，每例AR患者的年治療總費(fèi)用近達(dá)萬元[3]。而目前臨床上對于AR的治療尚無根治的措施，且臨床常用的抗組胺藥存在導(dǎo)致生產(chǎn)力損失風(fēng)險(xiǎn)[4]。因此，深入研究AR潛在的分子機(jī)制，從而發(fā)現(xiàn)安全有效的診斷和治療靶點(diǎn)非常重要。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA。近年研究證實(shí)lncRNA在生命活動(dòng)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用(包括表觀遺傳調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和以RNA形式存在的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié))，同時(shí)在調(diào)節(jié)先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)和免疫細(xì)胞發(fā)育中也發(fā)揮著重要作用，可作為許多疾病診斷的生物標(biāo)志物[5]。研究表明lncRNA在AR發(fā)展過程中可作為競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)海綿吸附miRNA來影響信使RNA(messenger RNA，mRNA)的表達(dá)，從而參與AR的免疫反應(yīng)、細(xì)胞代謝等生物學(xué)過程[6]。但相關(guān)研究報(bào)道較少，其具體機(jī)制也尚未闡明。因此，本研究對AR的lncRNA微陣列芯片展開分析，并構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)，通過生物信息學(xué)方法分析ceRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的相關(guān)功能和通路，為AR的發(fā)病機(jī)制提供新的見解，并確定AR的預(yù)期靶點(diǎn)。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)

本研究使用的數(shù)據(jù)庫及相關(guān)分析平臺(tái)具體見表1。

表1 本研究使用的數(shù)據(jù)庫及相關(guān)分析平臺(tái)

1.2 篩選AR的相關(guān)芯片

在美國國家生物技術(shù)信息中心(the national center for biotechnology information, NCBI)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(GEO)中輸入“allergic rhinitis”“homo sapiens”“expression profiling by array”，選擇編號(hào)為GSE46171的芯片矩陣文件和編號(hào)為GPL6480的平臺(tái)文件作為研究對象。該芯片數(shù)據(jù)樣本包含6例AR患者鼻黏膜組織和3例健康對照鼻黏膜組織。

1.3 AR芯片數(shù)據(jù)分析

利用Perl語言對數(shù)據(jù)進(jìn)行基因重注釋，獲得AR患者和健康對照的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集，并利用R語言的limma包對基因進(jìn)行校正及差異分析，以P<0.05和|log2 fold change (FC)|>0.5作為過濾條件，篩選出存在差異表達(dá)的mRNA和lncRNA，最后運(yùn)用pheatmap包繪制差異lncRNA的差異熱圖。

1.4 lncRNA、miRNA、mRNA互作預(yù)測

利用mircode數(shù)據(jù)庫篩選與差異lncRNA互作的miRNA。再從公共數(shù)據(jù)庫(miRTarBase、TargetScan、miRDB)預(yù)測miRNA作用的mRNA，取3個(gè)數(shù)據(jù)庫均能預(yù)測到的mRNA，將結(jié)果與步驟1.3所得的差異mRNA取交集。整合得到lncRNA-miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)，并導(dǎo)入cytoscape軟件繪制ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為進(jìn)一步探究ceRNA網(wǎng)絡(luò)中mRNA的作用機(jī)制，將基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，限定研究物種為“Homo Sapiens”，并設(shè)置連接評分>0.4，獲得蛋白互作關(guān)系。將所得結(jié)果導(dǎo)入cytoscape軟件中，利用“Network Analyzer”工具進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)，并利用“CytoHubba”工具根據(jù)度值篩選出關(guān)鍵基因。

1.6 基因富集分析

DAVID數(shù)據(jù)庫整合了生物學(xué)數(shù)據(jù)分析，可完成基因表達(dá)數(shù)據(jù)的注釋、基因本體論(gene ontology，GO)及京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析。利用DAVID數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵基因進(jìn)行GO功能富集分析以研究AR的主要生物功能；對關(guān)鍵基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析以研究AR發(fā)病的主要信號(hào)通路，P<0.05代表富集結(jié)果顯著。最后利用R語言的ggplot2包進(jìn)行可視化處理。

1.7 挖掘關(guān)鍵ceRNA網(wǎng)絡(luò)

挖掘關(guān)鍵基因在ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)聯(lián)信息，分析lncRNA與mRNA競爭結(jié)合的miRNA，并運(yùn)用cytoscape軟件繪制關(guān)鍵ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)的lncRNA與mRNA

利用perl和R語言等工具對芯片進(jìn)行重注釋后，再對其進(jìn)行差異分析。結(jié)果顯示，與健康對照組相比，AR患者共存在35個(gè)明顯改變的lncRNA，其中上調(diào)18個(gè)，下調(diào)17個(gè)；存在2 071個(gè)明顯改變的mRNA，其中上調(diào)1 018個(gè)，下調(diào)1 053個(gè)。分別在上調(diào)和下調(diào)的lncRNA中選取差異最顯著的10個(gè)來繪制熱圖，見圖1。

圖1 差異lncRNA在不同樣本中的表達(dá) 注：左縱軸為差異lncRNA的聚類分析，右縱軸為差異lncRNA的名稱。紅色代表高相對表達(dá)，綠色代表低相對表達(dá)。

2.2 ceRNA網(wǎng)絡(luò)

利用mircode等數(shù)據(jù)庫共預(yù)測到206個(gè)miRNA和1 269個(gè)mRNA，將預(yù)測到的mRNA與芯片中的2 071個(gè)差異mRNA取交集，再刪除不在該互作關(guān)系中的miRNA和lncRNA，整合后得到lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)。將該網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入cytoscape軟件中繪制ceRNA網(wǎng)絡(luò)，見圖2。網(wǎng)絡(luò)中共包括185個(gè)節(jié)點(diǎn)(29個(gè)lncRNA節(jié)點(diǎn)、31個(gè)miRNA節(jié)點(diǎn)、125個(gè)mRNA節(jié)點(diǎn))和500條邊。

圖2 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 注：菱形代表lncRNA，矩形代表miRNA，圓形代表mRNA，節(jié)點(diǎn)間的連線代表二者之間存在調(diào)控關(guān)系。 圖3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 注：節(jié)點(diǎn)代表mRNA，兩節(jié)點(diǎn)的連線代表二者間存在相互作用關(guān)系；節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深則度值越大，邊的粗細(xì)反映連接評分，邊越粗，mRNA間的互作關(guān)系越緊密。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)

借助STRING數(shù)據(jù)庫和cytoscape軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖3。圖中共涉及40個(gè)節(jié)點(diǎn)、69條邊，根據(jù)度值篩選出排名前5的mRNA為CREB1、PPARG、ETS1、IRF4、JAK2。這些度值較大的mRNA在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵作用，可能是AR發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因，基本信息見表2。

表2 關(guān)鍵mRNA的基本信息

2.4 GO富集分析和KEGG富集分析

GO富集分析關(guān)鍵基因的功能過程中，共確定了607個(gè)條目，其中包括550個(gè)生物過程(biological process,BP)、8個(gè)細(xì)胞成分(cellular component,CC)和49個(gè)分子功能(molecular function,MF)。根據(jù)P值，前10個(gè)富集的BP、CC和MF如圖4所示。BP主要涉及髓細(xì)胞分化、DNA結(jié)合的正調(diào)控、干擾素-γ-介導(dǎo)的信號(hào)通路、DNA結(jié)合的調(diào)節(jié)；CC主要涉及常染色質(zhì)、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合體、內(nèi)體腔；MF主要涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性，特異性RNA聚合酶II、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合、激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。KEGG富集分析關(guān)鍵基因共確定了40個(gè)條目，主要涉及Longevity信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路，如圖5所示。

圖4 關(guān)鍵基因的GO富集分析氣泡圖 注：縱軸代表GO富集分析的名稱，橫軸代表富集的基因占人體總基因的比例。氣泡顏色越紅富集程度越顯著，氣泡越大則在該項(xiàng)上富集的基因數(shù)越多。 圖5 關(guān)鍵基因的KEGG富集分析氣泡圖 注：縱軸代表通路名稱，橫軸代表富集的基因占人體總基因的比例。氣泡顏色越紅富集程度越顯著，氣泡越大則在該項(xiàng)上富集的基因數(shù)越多。

2.5 關(guān)鍵ceRNA網(wǎng)絡(luò)

lncRNA與關(guān)鍵mRNA競爭結(jié)合miRNA，其中上調(diào)mRNA的關(guān)鍵ceRNA 網(wǎng)絡(luò)中miR-27a-3p被lncRNA下調(diào)，見圖6。上調(diào)mRNA的關(guān)鍵ceRNA網(wǎng)絡(luò)中miR-125a-5p、miR-135a-5p、miR-125b-5p、miR-17-5p、miR-20b-5p被lncRNA下調(diào)，見圖7。

圖6 上調(diào)mRNA的關(guān)鍵ceRNA網(wǎng)絡(luò) 注：菱形代表lncRNA，矩形代表miRNA，圓形代表mRNA，節(jié)點(diǎn)間的連線代表二者之間存在調(diào)控關(guān)系。

圖7 下調(diào)mRNA的關(guān)鍵ceRNA網(wǎng)絡(luò) 注：菱形代表lncRNA，矩形代表miRNA，圓形代表mRNA，節(jié)點(diǎn)間的連線代表二者之間存在調(diào)控關(guān)系。

3 討論

lncRNA作為一類長非編碼RNA，通過調(diào)控miRNA來影響mRNA，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖分化、凋亡、活化等多種生命過程，最終介導(dǎo)多種疾病的發(fā)生。研究表明，lncRNA是炎癥和變應(yīng)性疾病(包括哮喘、變應(yīng)性皮炎)發(fā)病機(jī)制中眾多基因和途徑的強(qiáng)大調(diào)節(jié)因子[7]。充分探討這些lncRNA在AR中的作用將為AR的發(fā)病機(jī)制提供新的見解。因此在本研究中，作者從GSE461710芯片中提取數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)分析在AR患者和健康對照之間鑒定了18個(gè)上調(diào)和17個(gè)的下調(diào)lncRNA，并基于lncRNA-miRNA-mRNA間的關(guān)系進(jìn)行預(yù)測，構(gòu)建AR的ceRNA網(wǎng)絡(luò)。

為縮小研究范圍，尋找AR的關(guān)鍵機(jī)制，作者篩選出了ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵mRNA，并對其進(jìn)行富集分析。結(jié)果顯示，關(guān)鍵mRNA為CREB1、PPARG、ETS1、IRF4、JAK2，主要富集在Longevity信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路上，其生物過程主要涉及髓細(xì)胞分化、DNA結(jié)合的正調(diào)控、干擾素-γ-介導(dǎo)的信號(hào)通路、DNA結(jié)合的調(diào)節(jié)。無論是關(guān)鍵基因，還是其調(diào)控的生物過程和通路均與AR病情的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。腺苷5'-磷酸(AMP)激活的蛋白激酶(AMPK)信號(hào)作為一種能量傳感器，可通過調(diào)節(jié)分解、合成代謝過程的速率來維持細(xì)胞能量代謝的動(dòng)態(tài)平衡。研究表明，在變應(yīng)炎癥環(huán)境下AMPK信號(hào)被激活，并誘導(dǎo)鼻黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生自噬甚至死亡，進(jìn)而導(dǎo)致鼻黏膜上皮的完整性破壞，加重AR癥狀。CREB位于AMPK信號(hào)下游，抗組胺藥物可降低CREB的表達(dá)，維持鼻上皮細(xì)胞表面正常液體[8-9]；Longevity信號(hào)通路由IGF-1、sirtuin、AMPK和mTOR共4條通路共同構(gòu)成，Longevity信號(hào)可通過激活自噬、應(yīng)激防御機(jī)制以延長細(xì)胞壽命。但在AR患者Longevity信號(hào)異常應(yīng)答過程中會(huì)導(dǎo)致自噬、應(yīng)激防御反應(yīng)增強(qiáng)，最終介導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒和炎癥因子的釋放[10]；IL-17信號(hào)通路是活化Th17細(xì)胞的關(guān)鍵信號(hào)通路，研究表明，活化的Th17細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子(如：IL-17、IL-22、TNF-α)，促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞向鼻黏膜局部的遷移、黏附、定位，增加AR致敏狀態(tài)[11]。IRF4是促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th1、Th2、Th17等亞型細(xì)胞分化中的關(guān)鍵因子之一，研究表明AR患者的CD4+T細(xì)胞通過IRF4誘導(dǎo)ETS1和其他靶向轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th2分化[12]。JAK2是INF-γ信號(hào)下游，IFN受體含有酪氨酸激酶JAK2結(jié)合集，IFN-γ與其受體結(jié)合后啟動(dòng)JAK-STAT1參與過敏性疾病的發(fā)生。而通過抑制IFN-γ/ JAK/STAT通路可減少鼻腔樹突細(xì)胞分泌的胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素，進(jìn)而減少AR炎癥性Th2細(xì)胞反應(yīng)[13]。Sawane等[14]通過膳食喂養(yǎng)可促進(jìn)過敏小鼠鼻黏膜中的肥大細(xì)胞表達(dá)PPARγ，減少脫顆粒的肥大細(xì)胞分泌組胺和脂質(zhì)等化學(xué)介質(zhì)，進(jìn)而抑制過敏反應(yīng)。

為進(jìn)一步挖掘關(guān)鍵基因在ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)聯(lián)信息，分析lncRNA與mRNA競爭結(jié)合的miRNA。根據(jù)關(guān)鍵ceRNA網(wǎng)絡(luò)可知，miR-27a-3p，miR-125a-5p、miR-135a-5p、miR-125b-5p、miR-17-5p、miR-20b-5p在影響關(guān)鍵mRNA的翻譯和表達(dá)過程中，發(fā)揮著重要作用。研究表明，給予外源性的miR-27a抑制劑，可減少花粉暴露的黏膜氧化反應(yīng)下的嗜酸性粒細(xì)胞的募集、黏液以及膠原蛋白的產(chǎn)生[15]。在AR疾病中，高表達(dá)的miR-17-5p促進(jìn)Bax、caspase-3、caspase-9的表達(dá)以及炎癥因子的分泌，加重鼻上皮細(xì)胞損傷；而低表達(dá)的miR-135a通過影響IFN-γ、T-box的分泌，參與誘導(dǎo)Th1/Th2失衡[16-17]。miR-125a與miR-125b是高度同源的miRNA，但二者的應(yīng)答結(jié)果截然相反，變應(yīng)原的刺激會(huì)促進(jìn)上皮細(xì)胞miR-125b的表達(dá)，進(jìn)而引起上皮細(xì)胞自噬、上皮屏障發(fā)生功能障礙，最終參與AR的發(fā)?。坏贏R患者鼻黏膜組織中miR-125a表達(dá)與INSS(鼻漏、瘙癢、充血評分)、總鼻癥狀評分(TNSS)以及炎性細(xì)胞因子 (IL-4、IL-6、IL-10和IL-17)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[18-19]。目前尚無miR-20b直接影響AR的研究，但在哮喘研究中表明，miR-20b可抑制哮喘小鼠的氣道炎癥反應(yīng)[20]。

本次研究受篩選條件的限制只能分析ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的主要作用靶點(diǎn)，且預(yù)測結(jié)果可能無法完全代表mRNA在蛋白水平的表達(dá)情況及l(fā)ncRNA的實(shí)際功能。在miRNA靶向mRNA的相關(guān)研究中，MiR-27a可通過靶向抑制PPAR-γ表達(dá)產(chǎn)生促進(jìn)糖代謝或肺動(dòng)脈高壓反應(yīng)[21]。miR-135a通過抑制JAK/STAT，降低哮喘病變肺組織中TNF-α、IL-6、IL-5和eotaxin的分泌，進(jìn)而減輕哮喘小鼠的氣道炎癥[22]。在lncRNA調(diào)控miRNA的相關(guān)研究中，過表達(dá)的lncRNA MIAT通過激活TH17細(xì)胞免疫反應(yīng)來促進(jìn)AR過敏以及炎癥反應(yīng)，表明lncRNA MIAT與miR-125a、miR-125b可能在T細(xì)胞炎癥反應(yīng)中存在調(diào)節(jié)關(guān)系[23]。其他的lncRNA調(diào)控miRNA則在其他疾病中得到了證實(shí)，如：lncRNA HOTAIRM1靶向抑制miR-17-5p，進(jìn)而減少胃癌細(xì)胞系的增殖和遷移并促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[24]。lncRNA HOTAIRM1-1通過負(fù)調(diào)控miR-125b表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡加重骨關(guān)節(jié)炎損傷[25]。而TTTY5、LINC00189、 LINC00114、LINC00266-1、CASC2等lncRNA涉及的信號(hào)軸雖然未有相關(guān)參考文獻(xiàn)支撐，但可為后續(xù)研究AR提供線索?？傊诒敬窝芯克A(yù)測的AR疾病的lncRNA、miRNA、mRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中，miRNA、mRNA的單獨(dú)效應(yīng)已經(jīng)得到了廣泛的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，但lncRNA的調(diào)節(jié)機(jī)制以及三者之間的作用關(guān)系仍值得進(jìn)一步驗(yàn)證，以期進(jìn)一步闡明AR發(fā)病的基因作用機(jī)制。

綜上所述，本研究通過構(gòu)建AR的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，探討可能與AR發(fā)生發(fā)展相關(guān)的致病機(jī)制，為后續(xù)深入研究AR基因間的調(diào)控關(guān)系提供了參考依據(jù)和方向，并有望在將來成為疾病診斷的標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)，為AR研究提供一定理論支撐。