尉立剛，孫文艷，范三紅，李倩，楊鈺昆，郭彩霞

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

豬肉，作為我國(guó)肉類(lèi)消費(fèi)的主體，是人們?nèi)粘ｏ嬍持兄匾慕M成部分。統(tǒng)計(jì)顯示：2018年我國(guó)豬肉的消費(fèi)量高達(dá)6.90億頭[1]，占肉類(lèi)總產(chǎn)量的63.45%。冷凍儲(chǔ)藏，作為一種經(jīng)濟(jì)便捷的保存方法，在肉類(lèi)產(chǎn)業(yè)中廣泛應(yīng)用[2]。但是，原料肉在低溫凍藏過(guò)程中，其蛋白質(zhì)和脂肪將會(huì)發(fā)生一定程度的氧化，導(dǎo)致其品質(zhì)下降[3]。

目前，關(guān)于原料肉在凍藏過(guò)程中理化性質(zhì)的改變已引起國(guó)內(nèi)外相關(guān)學(xué)者的關(guān)注。李倩等人[3]研究了低溫凍藏時(shí)間對(duì)原料豬肉中肌原纖維蛋白氧化程度的影響，結(jié)果表明：隨凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)，豬肉中肌原纖維蛋白的羰基含量顯著增加，而內(nèi)源性色氨酸熒光、總巰基和表面疏水性顯著下降（p<0.05）。趙鉅陽(yáng)等[4]調(diào)查了冷凍儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)生豬肉品質(zhì)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨凍藏時(shí)間的增加，生豬肉中可溶性蛋白質(zhì)和彈性顯著降低，而POV、TBARS以及游離氨基酸的含量呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。此外，隨凍藏時(shí)間延長(zhǎng)，生豬肉中的風(fēng)味物質(zhì)差異顯著。因此，生豬肉的品質(zhì)隨著凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著下降，尤其是凍藏120 d后，其品質(zhì)下降明顯。Brewer等[5]調(diào)查了凍藏時(shí)間對(duì)真空包裝的豬肉中脂肪氧化的影響后發(fā)現(xiàn)：豬肉中脂肪氧化程度隨凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加。以上研究多集中在原料肉凍藏過(guò)程中蛋白質(zhì)氧化、可溶性蛋白質(zhì)、游離氨基酸以及原料肉脂肪氧化等方面，而很少涉及到冷凍時(shí)間對(duì)豬肌內(nèi)脂肪及肌原纖維蛋白凝膠性能影響的相關(guān)報(bào)道。

試驗(yàn)擬以新鮮豬肉為研究對(duì)象，-18 ℃下分別凍藏0、1、4、8、12周后，探究冷凍時(shí)間對(duì)豬肌內(nèi)脂肪和肌原纖維蛋白溶解度、保水性、凝膠白度及強(qiáng)度的影響，以期為豬肉冷凍過(guò)程中肌內(nèi)脂肪及肌原纖維蛋白凝膠性能的改變提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

將屠宰后 24 h的豬脊肉（大白豬，180日齡，pH=5.8，亮度值：42.7，紅度值：3.7，黃度值：7.3）置于冰盒中保藏；乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA），上海羅恩試劑有限公司；1,4-哌嗪二乙磺酸（PIPES，純度98%），北京索萊寶科技有限公司；硫代巴比妥酸（TBA，分析純），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；氯仿、甲醇、正己烷、鹽酸、氫氧化鉀，分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Starter2100型pH計(jì)，上海奧豪斯儀器有限公司；QT-1型渦旋振蕩器，上海琪特分析儀器有限公司；NS800型分光測(cè)色儀，深圳市三恩時(shí)科技有限公司；DZ-400/2SK型真空包裝機(jī)，上海青葩食品包裝機(jī)械有限公司；GC-2010型氣相色譜儀，日本島津公司；Agilent1100型液相色譜儀，安捷倫科技（中國(guó)）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 豬脊肉的凍藏

將上述置于冰盒的豬外脊肉運(yùn)抵試驗(yàn)室，隨后剔盡脂肪組織，垂直于肌纖維紋路的方向?qū)⒇i脊肉分割成100 g左右的肉塊，封裝后在-18 ℃分別凍藏0、1、4、8和12周，以備肌原纖維蛋白的提取及以下理化指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.2 肌原纖維蛋白的提取

依據(jù)Yu等[6]的方法，對(duì)肌原纖維蛋白進(jìn)行提取。將上述凍藏的豬肉在4 ℃下解凍，切割成條狀，按1:4（g/mL）的比例加磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L磷酸鈉，0.1 mol/L氯化鈉，2 mmol/L氯化鎂，1 mmol/L EGTA，pH=7.0），置于均質(zhì)機(jī)均質(zhì)60 s，隨后，在3340 r/min離心15 min，棄上清液，重復(fù)上述操作三次。按1:4（g/mL）的比例加入0.1 mol/L的NaCl溶液，攪拌，用0.1 mol/L的HCl調(diào)pH至6.25，用四層紗布過(guò)濾，離心棄上清液，得肌原纖維蛋白。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)品，雙縮脲法測(cè)定肌原纖維蛋白濃度。

1.2.3 肌原纖維蛋白中殘余脂肪氧化值的測(cè)定

肌原纖維蛋白中殘余脂肪的氧化程度參照Yu等[7]的方法進(jìn)行測(cè)定。稱(chēng)2.0 g左右的肌原纖維蛋白于50 mL燒杯中，隨后加入3 mL 1%的TBA溶液（0.075 mol/L的NaOH為溶劑）和17 mL 2.5%的TCA溶液（0.036 mol/L的HCl為溶劑），混勻后移至比色管，加熱煮沸0.5 h，冷卻至室溫。隨后，取10 mL上清液于25 mL比色管中，加入10 mL氯仿，渦旋儀振蕩混勻，在4500 r/min下離心15 min。取6 mL上清液，加入3 mL石油醚，渦旋儀振蕩混勻，在上述相同轉(zhuǎn)速下離心，取下層液在532 nm處測(cè)定吸光度。同時(shí)以2 mL的PIPES溶液（15 mmol/L）代替樣品作試驗(yàn)空白。肌原纖維蛋白中殘余脂肪的TBARS按公式(1)計(jì)算。

式中：

A1——樣品的吸光度；

A2——空白的吸光度；

m——肌原纖維蛋白的質(zhì)量，g。

1.2.4 肌原纖維蛋白溶解度的測(cè)定

依據(jù)曹云剛等[8]的研究方法對(duì)肌原纖維蛋白的溶解度進(jìn)行測(cè)定。用15 mmol/L的PIPES緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH=6.25）將提取出的肌原纖維蛋白稀釋為2 mg/mL，攪拌60 min（4 ℃），4500 r/min離心0.5 h。吸取1 mL上清液，加入4 mL堿性酒石酸銅溶液，37 ℃水浴中反應(yīng)0.5 h，540 nm比色，同時(shí)以蒸餾水做空白。蛋白溶解度按公式（2）計(jì)算。

式中：

C1——上清液液中肌原纖維蛋白濃度，mg/mL；

C2——肌原纖維蛋白濃度，mg/mL。

1.2.5 肌原纖維蛋白凝膠的制備

凝膠的制備方法參照曹云剛等人[8]的描述。首先，將肌原纖維蛋白用15 mmol/L的PIPES緩沖液稀釋至30 mg/mL，隨后分別稱(chēng)取稀釋過(guò)的肌原纖維蛋白約5.0 g于10 mL燒杯（測(cè)定肌原纖維蛋白的保水性）中，約30 g于50 mL燒杯（測(cè)定肌原纖維蛋白的白度及凝膠強(qiáng)度）中，保鮮膜密封燒杯，在程序升溫水浴鍋中以10 ℃/min的升溫速率從25 ℃加熱至75 ℃，保持20 min，隨后冰浴中冷卻0.5 h，以備保水性、白度和凝膠強(qiáng)度的測(cè)定。

1.2.6 肌原纖維蛋白凝膠保水性的測(cè)定

參照賈娜等[9]的方法對(duì)凝膠保水性進(jìn)行測(cè)定。具體如下：將上述制備的凝膠（約5.0 g）放入50 mL離心管（m1），離心10 min（3000 r/min，4 ℃），隨后將離心管倒置于濾紙上20 min，稱(chēng)重（m3）。凝膠保水性按公式（3）計(jì)算。

式中：

m1——離心前肌原纖維蛋白凝膠樣品的質(zhì)量，g；

m2——離心管的質(zhì)量，g；

m3——經(jīng)吸水后凝膠和離心管的質(zhì)量，g。

1.2.7 肌原纖維蛋白凝膠白度的測(cè)定

參照夏秀芳等人[10]的方法對(duì)凝膠白度進(jìn)行測(cè)定。將上述制備的肌原纖維蛋白凝膠置于室溫下平衡 30 min。采用 3nh分光測(cè)色儀對(duì)樣品的白度進(jìn)行測(cè)定，記錄L*、a*和b*值。凝膠白度按公式（4）計(jì)算。

式中：

L*——亮度值；

a*——紅度值（正、負(fù)值分別表示偏紅、偏綠）；

b*——黃度值（正、負(fù)值分別表示偏黃、偏藍(lán)）。

1.2.8 肌原纖維蛋白凝膠強(qiáng)度的測(cè)定

參照曹云剛等人[8]的方法對(duì)肌原纖維蛋白的凝膠強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定。將上述制備的肌原纖維蛋白凝膠在25 ℃下平衡 30 min，用濾紙吸去樣品表面水分，用TMS-PRO質(zhì)構(gòu)儀對(duì)蛋白凝膠強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定。儀器的參數(shù)為：圓柱塑膠探頭（TMS 25.4 mm），測(cè)試速度：30 mm/min，起始力：0.050 N；穿刺距離：4 mm；回升距離：50 mm。探頭刺破凝膠所需壓力即為肌原纖維蛋白的凝膠強(qiáng)度。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)均設(shè)為三次重復(fù)（不同日期），結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Statistix 9.0軟件進(jìn)行方差分析和顯著性分析（LSD法），文章中的圖均用Origin 8.5進(jìn)行繪制，試驗(yàn)結(jié)果中的不同字母代表差異顯著（p<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷凍時(shí)間對(duì)肌原纖維蛋白中殘余脂肪氧化的影響

如圖1所示，在原料豬肉凍藏0~12周的時(shí)間中，肌原纖維蛋白中殘余脂肪的TBARS值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在凍藏1周時(shí)，與新鮮的豬肉相比，肌原纖維蛋白中殘余脂肪的 TBARS值未見(jiàn)顯著變化（p>0.05），其TBARS值為0.07 mg/kg蛋白。凍藏4周時(shí)，脂肪的TBARS值為0.17 mg/kg蛋白。隨凍藏時(shí)間的持續(xù)增加（12周），TBARS值增至0.22 mg/kg蛋白（p<0.05）。因此，隨原料肉凍藏時(shí)間延長(zhǎng)，肌內(nèi)脂肪的氧化程度不斷加劇。趙鉅陽(yáng)等[4]認(rèn)為生豬肉TBARS升高主要是由于凍藏期間肉中水分緩慢升華，使得水分原來(lái)的空間更易被氧氣所占據(jù)，導(dǎo)致原料肉氧化，TBARS升高。Igene等[11]對(duì)凍藏的雞胸肉中丙二醛的濃度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雞肉在凍藏后期，丙二醛的濃度顯著升高，因此，凍藏期間丙二醛濃度增大很可能是導(dǎo)致本研究中TBARS值升高的原因，這與Vivien等[12]的研究結(jié)果基本一致。

2.2 冷凍時(shí)間對(duì)肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響

如圖2所示，隨凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)，肌原纖維蛋白凝膠的保水性顯著下降（p<0.05）。與新鮮原料肉相比（46.67%），經(jīng) 4周凍藏之后，其凝膠保水性降至36.60%（p<0.05）。隨冷凍時(shí)間的持續(xù)增加（12周），肌原纖維蛋白的凝膠保水性降至 33.57%（p<0.05）。原料肉在冷凍的過(guò)程中，肌原纖維蛋白不可避免地將會(huì)發(fā)生氧化[3]。賈娜等[9]研究顯示：氧化后的肌原纖維蛋白，其三維立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致肌原纖維蛋白束水力和凝膠網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的致密型有所降低，保水性下降。因此，凍藏過(guò)程中肌原纖維蛋白的氧化可能是導(dǎo)致其凝膠保水性降低的原因之一。

2.3 冷凍時(shí)間對(duì)肌原纖維蛋白溶解度的影響

如圖3所示，隨凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)，原料肉中肌原纖維蛋白的溶解度呈顯著下降趨勢(shì)（由56.08%下降到35.92%）。與新鮮肉中的肌原纖維蛋白相比，經(jīng) 1周凍藏之后，肌原纖維蛋白的溶解度有所下降，但不顯著（p>0.05），且凍藏1周時(shí)的肌原纖維蛋白的溶解度是 49.68%。隨凍藏時(shí)間增加（8周），肌原纖維蛋白的溶解度降至 37.20%（p<0.05）。Sompongse等[13]對(duì)凍藏期間肌原纖維蛋白的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，結(jié)果提示凍藏過(guò)程中肌原纖維蛋白中的巰基會(huì)氧化成二硫鍵，導(dǎo)致肌原纖維蛋白的重鏈發(fā)生一定程度的聚合，致使溶解度下降。此外，溶解度下降的另一個(gè)原因可能是在凍藏過(guò)程中肌原纖維蛋白發(fā)生氧化[3]，導(dǎo)致原先隱藏的疏水基團(tuán)發(fā)生暴露，進(jìn)而誘導(dǎo)了疏水相互作用的發(fā)生，使得原料肉中肌原纖維蛋白的溶解度下降[8]。

2.4 冷凍時(shí)間對(duì)肌原纖維蛋白凝膠強(qiáng)度的影響

如圖4所示，隨著凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)，肌原纖維蛋白的凝膠強(qiáng)度整體呈下降趨勢(shì)。與新鮮原料肉相比較，經(jīng)8周凍藏后，肌原纖維蛋白的凝膠強(qiáng)度由0.25降低至0.14（p<0.05）。原料肉在低溫凍藏過(guò)程中，脂肪和肌原纖維蛋白將會(huì)發(fā)生氧化，導(dǎo)致肌原纖維蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，使得肌原纖維蛋白分子間的作用力和氫鍵作用被削弱，導(dǎo)致熱誘導(dǎo)后所生成的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不致密，保水性下降，從而致使肌原纖維蛋白凝膠強(qiáng)度下降[14]。此外，凍藏過(guò)程中氧化所導(dǎo)致的肌原纖維蛋白溶解度下降，促使參與成膠的蛋白量減少，可能也是導(dǎo)致肌原纖維蛋白凝膠強(qiáng)度下降的原因[15]。

2.5 冷凍時(shí)間對(duì)肌原纖維蛋白凝膠白度的影響

從圖5中得知，隨凍藏時(shí)間延長(zhǎng)，肌原纖維蛋白的凝膠白度值整體呈下降趨勢(shì)。與新鮮原料肉相比，經(jīng)12周凍藏后，肌原纖維蛋白的白度值由59.71降至26.53（p<0.05）。Xia等[16]研究顯示脂肪氧化將會(huì)導(dǎo)致過(guò)氧自由基含量的增加，從而誘發(fā)蛋白質(zhì)氧化，形成的氧化產(chǎn)物與氨基酸側(cè)鏈發(fā)生非酶促反應(yīng)，導(dǎo)致肌原纖維蛋白的白度值下降。因此，凍藏期間肌內(nèi)脂肪以及肌原纖維蛋白的氧化將會(huì)導(dǎo)致凝膠白度的下降。此外，脂肪氧化所引起的肌原纖維蛋白與色素蛋白發(fā)生交聯(lián)也可能是凝膠白度下降的原因之一[17]。

2.6 相關(guān)性分析

由表1可知，凍藏時(shí)間與TBARS呈極顯著正相關(guān)（p<0.01），與溶解度、凝膠保水性、凝膠白度以及凝膠強(qiáng)度呈極顯著負(fù)相關(guān)（p<0.01），由此推斷凍藏時(shí)間對(duì)TBARS、溶解度、凝膠保水性、凝膠白度及強(qiáng)度有較大影響。TBARS與溶解度、凝膠保水性、凝膠白度及凝膠強(qiáng)度呈極顯著負(fù)相關(guān)（p<0.01）；溶解度與凝膠保水性和凝膠白度呈極顯著正相關(guān)（p<0.01），與凝膠強(qiáng)度呈顯著正相關(guān)（p<0.05）；凝膠保水性與凝膠白度和強(qiáng)度呈極顯著正相關(guān)（p<0.01）；凝膠白度與凝膠強(qiáng)度呈極顯著正相關(guān)（p<0.01）。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步表明：凍藏時(shí)間對(duì)原料肉肌內(nèi)脂肪和肌原纖維蛋白的凝膠性能影響較大。

表1 豬肉中理化性質(zhì)的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of physical and chemical properties in pork

凍藏時(shí)間對(duì)豬肌內(nèi)脂肪和肌原纖維蛋白的凝膠性能影響也可用各指標(biāo)之間的LDA分析來(lái)評(píng)估。通常，從原點(diǎn)開(kāi)始，通過(guò)與測(cè)量指標(biāo)之間形成向量，兩個(gè)向量之間的相關(guān)性可通過(guò)它們之間夾角的余弦值來(lái)確定[18]。如圖6所示，在TBARS與溶解度、凝膠保水性、凝膠白度以及凝膠強(qiáng)度之間都為鈍角矢量角，這表明這些指標(biāo)之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，說(shuō)明隨肌內(nèi)脂肪氧化程度的加劇，肌原纖維蛋白的溶解度、凝膠保水性、凝膠白度以及凝膠強(qiáng)度都顯著下降。凝膠保水性、溶解度、凝膠白度以及凝膠強(qiáng)度之間呈銳角矢量角，這個(gè)結(jié)果表明這些指標(biāo)之間呈現(xiàn)正相關(guān)。因此，肌原纖維蛋白溶解度的下降可能也是導(dǎo)致凝膠保水性、凝膠白度和凝膠強(qiáng)度下降的原因。

3 結(jié)論

試驗(yàn)主要研究了冷凍時(shí)間對(duì)豬肌內(nèi)脂肪氧化及肌原纖維蛋白凝膠性能的影響。結(jié)果表明：隨凍藏時(shí)間的增加，肌內(nèi)脂肪氧化程度增加，肌原纖維蛋白的溶解度、凝膠保水性、凝膠白度以及凝膠強(qiáng)度均呈下降趨勢(shì)。這些指標(biāo)之間的相關(guān)性及LDA分析結(jié)果表明：凍藏所導(dǎo)致的肌內(nèi)脂肪氧化可能是肌原纖維蛋白溶解度、保水性、凝膠白度及凝膠強(qiáng)度下降的原因之一。因此，在原料肉低溫凍藏過(guò)程中，控制肌內(nèi)脂肪氧化對(duì)保證原料肉的品質(zhì)尤為重要。