夏 葉,孫瑩慧,李春華,繆德年

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海 201106)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(簡稱單增李斯特菌,Listeria monocytogenes,Lm),是一種人畜共患的食源性致病菌。單增李斯特菌擁有極強(qiáng)的抗應(yīng)激能力和生物被膜形成特性,可在高滲透壓(10%—20% NaCl)、寬泛的pH(2.5—9.0)和溫度(0.4—45.0 ℃)條件下存活并生長,因此廣泛存在于水、土壤、食品加工及儲存環(huán)境中[1]。人和動物食用了單增李斯特菌污染的食品易感染李斯特菌病,引發(fā)胃腸炎、流產(chǎn),甚至敗血癥、腦膜炎等嚴(yán)重病癥[1-2]。SigB 為單增李斯特菌最重要的應(yīng)激調(diào)控因子,與細(xì)菌抵抗環(huán)境應(yīng)激密切相關(guān)[3]。當(dāng)細(xì)菌遭遇高滲透壓、低pH、低溫等應(yīng)激環(huán)境時,會通過調(diào)節(jié)SigB 來調(diào)控特定基因的轉(zhuǎn)錄水平從而幫助細(xì)菌抵抗應(yīng)激存活下來[4-5]。SigB 影響單增李斯特菌的生物被膜形成能力,形成生物被膜的李斯特菌對抗生素、環(huán)境應(yīng)激以及宿主免疫系統(tǒng)的耐受力大大增加,能更加牢固地附著于食品加工材料表面及腸道內(nèi)壁等,加大了殺滅單增李斯特菌的難度[6]。SigB 在單增李斯特菌對多種抗生素產(chǎn)生應(yīng)答并獲得耐藥性方面也至關(guān)重要[7]。此外,SigB 通過調(diào)控毒力調(diào)控因子PrfA 的P2 啟動子間接參與單增李斯特菌的毒力調(diào)控,影響細(xì)菌對宿主的毒力和致病性[8]。

本研究將sigB基因克隆至原核表達(dá)載體并進(jìn)行蛋白表達(dá)和純化,將純化的蛋白免疫兔體制備抗SigB蛋白的高效價多克隆抗體,以期為更好地探究單增李斯特菌的抗應(yīng)激機(jī)制、毒力調(diào)控機(jī)制及其快速診斷方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基、實驗動物和試劑

單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株10403S、大腸桿菌DH5α 和Rosetta(DE3)以及蛋白表達(dá)質(zhì)粒pET-30a 均由本實驗室保存。腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)購于北京陸橋技術(shù)股份有限公司；酵母浸膏、胰蛋白胨、抗生素和HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 購于生工生物工程(上海)股份有限公司；DNA 連接酶和KOD plus Neo polymerase購于東洋坊(上海)生物科技有限公司；2 ×PCR Mix 和DNA Marker 購于北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；限制性內(nèi)切酶購于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；核酸電泳染料Goldview 購于上海賽百盛基因技術(shù)有限公司；蛋白Marker 和Ni-NTA Beads 購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、DNA 膠回收試劑盒及質(zhì)粒抽提試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；NaCl、KCl 等購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。雌性新西蘭大白兔購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心。

1.2 sigB 基因的擴(kuò)增

根據(jù)GenBank 中公布的單增李斯特菌sigB基因序列(Gene ID:986527),以單增李斯特菌參考菌株10403S 的基因組為模板,以BamHⅠ和SalⅠ為酶切位點(diǎn),應(yīng)用Vector NTI 軟件設(shè)計重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒引物,引物由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司合成。上游引物F:5’-CGGGATCCATGCCAAAAGTATCTCA-3’,下游引物R:5’-GCGTCGACTTACTCCACTTCCTCATTC-3’。根據(jù)試劑盒說明書,提取單增李斯特菌10403S的基因組。以基因組為模板,通過PCR 擴(kuò)增目的基因,PCR 反應(yīng)條件為:94 ℃5 min；94 ℃30 s,60 ℃30 s,72 ℃45 s,30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收目的片段。

1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-SigB 的構(gòu)建

將膠回收PCR 產(chǎn)物和表達(dá)質(zhì)粒pET30a 分別經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后置于16 ℃恒溫連接儀連接1 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α 感受態(tài)細(xì)胞后涂布卡那霉素抗性(Kan+)平板,37 ℃過夜培養(yǎng)后挑取單菌落接種于Kan+液體LB 培養(yǎng)基,37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒經(jīng)PCR 鑒定為陽性的樣品送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測序鑒定,保存氨基酸序列未發(fā)生改變的陽性克隆備用。

1.4 SigB 蛋白的原核表達(dá)

將pET30a-SigB 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)表達(dá)菌,于Kan+液體LB 培養(yǎng)基中37 ℃振搖培養(yǎng)至OD600nm約0.6,加入終濃度為0.4 mmol∕L 的IPTG 于37 ℃誘導(dǎo)生長3 h。離心收集菌體,以無菌PBS 重懸菌體后超聲裂解(功率300 W,工作4 s,間歇4 s,共20 min),離心取上清即獲得可溶性SigB 蛋白。取少量蛋白液進(jìn)行SDS-PAGE 電泳鑒定重組蛋白表達(dá)情況。其余蛋白液用于蛋白純化。

1.5 SigB 蛋白的純化

在層析柱中裝入約2 mL Ni-NTA Beads,將上述蛋白液緩慢加入平衡后的Ni-NTA Beads,以0.5 mL∕min的速度過柱,重復(fù)3 次；用蛋白洗滌液以1—2 mL∕min 的流速洗滌雜蛋白；最后用3 mL 洗脫液對目的蛋白進(jìn)行洗脫,取微量洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE 電泳,檢測純化效果。

1.6 多克隆抗體的制備

將500 μg 純化后的SigB 蛋白與等量的弗式完全佐劑混合,用注射推拉法充分乳化至油包水狀態(tài),分點(diǎn)注射于兔體脊柱兩側(cè)的皮下,進(jìn)行一免；每間隔2 周,取100 μg 抗原和等量弗式不完全佐劑混勻乳化,分別進(jìn)行二免、三免和四免。四免后1 周于耳緣靜脈采血1 mL,分離血清,測定抗體效價,若效價合格,則采用心臟采血法獲得全血。全血充分凝固且析出血清后,取上層血清即為SigB 多克隆抗體。

1.7 多克隆抗體的純化

將上述血清與生理鹽水按1∶1體積混合,加入與總體積等量的過硫酸銨溶液,混勻,4 ℃靜置3 h 以上；待使其充分沉淀后,4 ℃、3 000 r∕min 離心20 min,取沉淀。重復(fù)上述步驟3 次,最后用PBS 溶解沉淀并透析,即得到純化的SigB 多克隆抗體。

1.8 多克隆抗體的效價測定

通過間接ELISA 方法測定多克隆抗體的效價[9],當(dāng)OD450nm＞0.2,且P∕N≥2.1 時的最大抗體稀釋倍數(shù)即為其效價。

1.9 多克隆抗體的Western-blot 檢測

將誘導(dǎo)表達(dá)后的SigB 重組菌液和不含SigB 蛋白表達(dá)質(zhì)粒的空載菌液分別超聲裂解提取蛋白,經(jīng)SDS-PAGE 后,轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上,封閉液4 ℃過夜,以SigB 多克隆抗體作為一抗,羊抗兔HRP-IgG 作為二抗,進(jìn)行Western-blot 分析,檢測制備的SigB 多克隆抗體特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 sigB 基因的PCR 擴(kuò)增

將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果顯示擴(kuò)增片段大小與預(yù)期相符,約796 bp(圖1),且經(jīng)測序驗證,擴(kuò)增片段未發(fā)生堿基突變,表明成功克隆出sigB基因。

圖1 sigB 基因的PCR 擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of sigB gene

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

經(jīng)3 h 的IPTG 誘導(dǎo)表達(dá),獲得了可溶性SigB 蛋白,經(jīng)Ni-NTA Beads 層析純化后,SDS-PAGE 鑒定,得到的SigB 蛋白大小約30 ku(圖2),與預(yù)期相符。所得純化后的目的蛋白純度較高,質(zhì)量濃度約1.5 mg∕mL。

圖2 SDS-PAGE 分析SigB 蛋白的表達(dá)及純化效果Fig.2 SDS-PAGE analysis of SigB protein expression and purification

2.3 多克隆抗體的免疫效價

將純化后的重組SigB 蛋白免疫新西蘭大白兔,經(jīng)過4 次免疫后,收獲血清并進(jìn)行過硫酸銨沉淀和透析純化,即獲得純化的SigB 多克隆抗體。經(jīng)測定,當(dāng)抗體稀釋度為1∶51 200 時,OD450nm值為0.22,且P∕N≥2.1,即制備的多克隆抗體效價為1∶51 200(圖3)。

圖3 SigB 蛋白多克隆抗體效價Fig.3 The titer of SigB protein polyclonal antibody

2.4 多克隆抗體的Western-blot 檢測

以上述制備的多克隆抗體作為一抗,以HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 作為二抗,進(jìn)行Western-blot 檢測。結(jié)果顯示:經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的pET30a-SigB 蛋白在30 ku 左右檢測出特異性SigB 蛋白條帶,而陰性對照未見條帶(圖4),表明本研究獲得的SigB 多克隆抗體具有良好的特異性。

圖4 SigB 蛋白多克隆抗體的Western blot 鑒定Fig.4 Western blot analysis of sigB protein polyclonal antibody

3 討論與結(jié)論

單增李斯特菌作為一種重要的食源性病原菌,擁有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力,因此廣泛存在于各種自然環(huán)境及食品加工、儲存環(huán)境中[1]。細(xì)菌在遇到應(yīng)激或環(huán)境變化時,會通過改變自身的基因表達(dá)水平來適應(yīng)環(huán)境。SigB 為單增李斯特菌最重要的應(yīng)激調(diào)控因子,通過識別特定的啟動子序列,與RNA 聚合酶結(jié)合形成全酶,從而誘導(dǎo)下游抗應(yīng)激基因的轉(zhuǎn)錄啟動[10]。SigB 已被證實參與抵抗溫度、酸堿、氧化、膽酸鹽、滲透壓、碳饑餓等多種環(huán)境及能量應(yīng)激的調(diào)控[3]。單增李斯特菌作為侵襲性胞內(nèi)菌,在入侵宿主細(xì)胞過程中受到一系列毒力因子的調(diào)控。其中,PrfA 為單增李斯特菌最主要的毒力調(diào)控因子,其P2 啟動子P2prfA為SigB 依賴型,sigB基因的缺失會影響P2prfA啟動子的激活,從而影響細(xì)菌的各種毒力表型。Ollinger等[8]通過微陣列基因芯片測序及熒光定量PCR,證實sigB基因的缺失影響hly、plcA、actA、lmo2219 等毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平。最新研究表明,SigB 與PrfA 的相互作用促進(jìn)了單增李斯特菌從胞外到胞內(nèi)的躍遷,影響細(xì)菌入侵宿主細(xì)胞的過程[11]?？梢?SigB 對單增李斯特菌的生存和感染都至關(guān)重要,不僅調(diào)控單增李斯特菌的抗應(yīng)激能力,幫助細(xì)菌在惡劣環(huán)境中存活下來,并且影響細(xì)菌的毒力,參與細(xì)菌感染宿主細(xì)胞的過程。本研究獲得了高純度可溶性SigB 蛋白以及高效價多克隆抗體,可在已有的表型和轉(zhuǎn)錄水平基礎(chǔ)上,進(jìn)一步驗證SigB 蛋白與P2prfA啟動子以及PrfA 的互作關(guān)系,探究SigB 蛋白對各毒力因子在蛋白表達(dá)層面的影響,解析SigB 與其調(diào)控操縱子互作的激活機(jī)制。

單增李斯特菌是一種食源性人獸共患病原菌,人和動物通過攝入污染該菌的食物而感染,引發(fā)李斯特菌病。近幾年,我國時有李斯特菌病的臨床病例發(fā)生[12],李斯特菌污染即食食品的報道也多次出現(xiàn)。Wang 等[13]于2018年在自貢市即食食品中分離到的單增李斯特菌攜帶超強(qiáng)毒力基因。Chen 等[14]于2018年在即食蔬菜中分離到多株單增李斯特菌。隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整,即食食品、生食食品所占比重越來越大,也為單增李斯特菌的防控增加了難度,開發(fā)快速檢測試劑盒勢在必行。多克隆抗體作為檢測工具具有成本低、周期短,且能識別多個抗原表位、增強(qiáng)靶蛋白信號、提高檢測靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。本研究獲得的SigB 蛋白和多克隆抗體為快速檢測試劑盒的研發(fā)提供了可靠的試驗工具。

本研究通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了高純度的可溶性單增李斯特菌SigB 蛋白,并通過免疫兔體成功制備了高效價的多克隆抗體,所制備的多克隆抗體能與SigB 蛋白發(fā)生特異性結(jié)合,且該多克隆抗體在SigB 蛋白缺失的單增李斯特菌中未檢測到目的蛋白,表現(xiàn)出良好的抗體特異性。本試驗獲得的SigB 蛋白以及多克隆抗體為SigB 蛋白的生物學(xué)功能研究以及單增李斯特菌的快速檢測提供了技術(shù)支撐,為闡明單增李斯特菌的毒力調(diào)控和抗應(yīng)激機(jī)制奠定了基礎(chǔ),對防控李斯特菌病、保障食品衛(wèi)生安全具有深遠(yuǎn)意義。