耿克軍 劉欣

摘 要：目的：研究分析乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑的安全性與功能特性。方法：采用急性毒理學(xué)、遺傳毒理學(xué)和90 d毒性試驗(yàn)，考察復(fù)合片劑安全性;同時(shí)，以高、中、低3個(gè)劑量組進(jìn)行為期30 d的灌胃試驗(yàn)，分析其對(duì)小鼠體重、免疫器官指數(shù)、吞噬指數(shù)等免疫指標(biāo)變化的影響。結(jié)果：毒理學(xué)試驗(yàn)表明對(duì)小鼠無(wú)毒副作用、無(wú)致畸、各項(xiàng)生理功能正常;與對(duì)照組比較，小鼠的體重與免疫器官指數(shù)均無(wú)顯著的影響（P>0.05），但顯著提高了小鼠的細(xì)胞免疫功能和單核巨噬細(xì)胞吞噬功能等免疫功能（P<0.05）。結(jié)論：研究表明乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑安全無(wú)毒副作用，具有增強(qiáng)免疫力的功能。

關(guān)鍵詞：乳礦物鹽;牛磺酸;安全性;功能性;小鼠

Abstract： Objective： Research and analyze the safety and functional characteristics of milk mineral salt and taurine compound tablets. Methods： Acute toxicology， genetic toxicology and 90-day toxicity tests were used to investigate the safety of composite tablets; at the same time， a 30-day gavage experiment was carried out in three dose groups of high， medium， and low to analyze its effects on the body weight of mice， Visceral-to-body ratio， immune organ coefficient， phagocytic index and other immune index changes. Results： The toxicology test showed that the mice had no toxic side effects， no teratogenicity， and normal physiological functions. Compared with the control group， the body weight and immune organs index of the mice had no significant effect （P>0.05）， but it improved significantly. Immune functions such as phagocytosis index and anti-volume number of mice （P<0.05）. Conclusion： Studies have shown that milk mineral salt compound taurine tablets are safe， non-toxic and side effects， and have the function of enhancing immunity.

Keywords： milk mineral salt; taurine; safety; functionality; mice

乳礦物鹽源于牛乳，是將牛乳中天然存在的鈣及礦物質(zhì)鹽通過(guò)膜分離技術(shù)濃縮得到含鈣量較高的乳礦物質(zhì)[1]。乳礦物鹽不僅可補(bǔ)充鈣，還具有降低血壓、防止動(dòng)脈血管狹窄等保健功能[2]。

?；撬嵋话阋杂坞x形式存在，廣泛分布于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，具有調(diào)節(jié)滲透壓、穩(wěn)定細(xì)胞膜、調(diào)節(jié)鈣水平的重要功能[3]。另外，研究發(fā)現(xiàn)，?；撬峋哂薪档脱?、改善糖尿病、抗腫瘤等活性，同時(shí)還具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用[4]。隨著對(duì)牛磺酸研究的日益深入，其已成為一種廣泛用于醫(yī)藥、食品、保健品行業(yè)的綠色添加劑。

基于乳礦物鹽與?；撬岬墓δ芴匦?，研究開(kāi)發(fā)乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合保健功能產(chǎn)品，用以提高特殊人群如兒童、孕產(chǎn)婦、老人等人群的生理功能。因此，本文以乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑為受試樣品，分別進(jìn)行動(dòng)物安全性和功能性試驗(yàn)，分析受試樣品對(duì)動(dòng)物的安全性能和免疫功能的影響，為全面開(kāi)發(fā)與利用乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑提供重要的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

受試樣品為乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑，每片含乳礦物鹽600 mg，含?；撬?00 mg。片劑的服用方法是每日4片。片重1.5 g/片。因此，該片劑人體每日服用6 g，即0.1 g/kg·BW（成人體重按60 kg計(jì)）;軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供清潔級(jí)昆明種小鼠300只，小鼠體重16～22 g，雌雄各半，許可證號(hào)：SCXK-（軍）2002-0001;飼料許可證號(hào)：清潔級(jí)，SCXK-（軍）2002-018。

印度墨汁，刀豆蛋白A（ConA），細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（MTT），1，8-二羥基蒽醌，0.9%NaCl，NaN3，Giemsa染色，碘硝基氯化四氮唑藍(lán)（INT），YAC-1細(xì)胞，Hanks液（pH值為7.2～7.4），吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）、二甲基亞砜、臺(tái)酚蘭，1%壬基酚聚氧乙烯醚（NP-40），環(huán)磷酰胺（4 mg/mL），甲醇。

1.2 儀器設(shè)備

BD FACSCanto II流式細(xì)胞儀;干燥箱;倒置顯微鏡（OlympusIX71）;打孔器（8 mm）;微量血凝試驗(yàn)板;離心機(jī)（2-16K）;酶標(biāo)儀（RT-6100）;培養(yǎng)板（96孔）;CO2培養(yǎng)箱（Co-150）;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-1800）;倒置顯微鏡（OlympusIX71）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 受試樣品及配制

受試樣品為乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑，0.1 g/kg·BW（成人體重以60 kg計(jì)）。以去離子水作為對(duì)照。

1.3.2 動(dòng)物分組與給藥

（1）功能性評(píng)價(jià)。合格證號(hào)：SCXK-（軍）2002-001，體重18～22 g清潔級(jí)昆明種小鼠雌雄各100只;合格證號(hào)SCXK-（軍）2002-018飼料均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境：SPF級(jí)，室溫為20～22 ℃，相對(duì)濕度為（48～52）%RH，單籠喂養(yǎng)。試驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分組，每組10只，設(shè)低、中、高3個(gè)劑量組，分別為0.5 g/kg·BW、1.0 g/kg·BW、3.0 g/kg·BW，每天定點(diǎn)灌胃（早10：00），連續(xù)灌胃30 d后進(jìn)行試驗(yàn)。

（2）安全性評(píng)價(jià)。①急毒試驗(yàn)：同功能性試驗(yàn)小鼠20只，且相同飼養(yǎng)條件。受試樣品劑量設(shè)計(jì)為20 g/kg·BW，一天兩次定點(diǎn)灌胃（早晚10：00），連續(xù)灌胃14 d，觀察小鼠體征與死亡情況。②遺傳毒性試驗(yàn)：試驗(yàn)小鼠75只，且相同飼養(yǎng)條件，群籠飼養(yǎng)，5只/籠;受試樣品劑量設(shè)計(jì)分別為2.5 g/kg·BW、5.0 g/kg·BW、10 g/kg·BW。陽(yáng)性組：環(huán)磷酰胺4 mg/mL，每天定點(diǎn)灌胃（早10：00）。灌胃后正常飲食，根據(jù)試驗(yàn)需要觀察一定時(shí)間，分別進(jìn)行試驗(yàn)。③90 d經(jīng)口毒性試驗(yàn)：清潔級(jí)昆明種大鼠40只，體重65～79 g，雌性各半，隨機(jī)分成4組、每組10只。設(shè)低、中、高3個(gè)試驗(yàn)組，且受試樣品的劑量分別為2.5 g/kg·BW、5.0 g/kg·BW、10.0 g/kg·BW，以去離子水為對(duì)照。試驗(yàn)條件：室溫為19～24 ℃，濕度（40～55）%RH，單籠，每天定點(diǎn)灌胃（早10：00），連續(xù)灌胃90 d，自由進(jìn)食飲水，每周記錄1次體重和2次食物攝入量以及飼料撒漏量。灌胃結(jié)束后進(jìn)行病例學(xué)檢查，包括肝、脾、腎、胃腸、卵巢及睪丸。

1.3.3 功能性實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)

（1）小鼠體重的測(cè)定。連續(xù)灌胃30 d，稱量小鼠的初始和終期體重。

（2）免疫器官指數(shù)測(cè)定。參考張勇[4]的試驗(yàn)方法。小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境3 d后，隨機(jī)分為對(duì)照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組各10只。在乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑連續(xù)灌胃30 d并于末次灌胃12 h后，將小鼠脫頸椎處死，稱重，取腹腔液，并在無(wú)菌條件下分離稱重肝臟和脾臟。免疫器官指數(shù)計(jì)算公式為：

免疫器官指數(shù)=免疫器官重量/體重×100%

（3）單核-巨噬功能測(cè)定。①碳廓清試驗(yàn)。受試樣品末次灌胃12 h后，分別在注射印度墨水2 min、10 min后，迅速取20 ?L的內(nèi)眥靜脈叢血，并與0.1% 2 mL Na2CO3溶液混合，于600 nm處測(cè)定吸光度值。同時(shí)脫頸椎處死小鼠，稱重肝臟、脾臟。吞噬指數(shù)a計(jì)算公式為：

式中：K-吞噬速率;OD1-2 min時(shí)的吸光度值;OD2-10 min時(shí)的吸光度值;t1-2 min;t2-10 min;a-吞噬指數(shù)。②腹腔巨噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)。在小鼠腹腔內(nèi)注射1 mL 20%雞紅細(xì)胞30 min后，將小鼠頸椎脫臼處死并固定在鼠板上，剪開(kāi)腹壁皮膚并注入2 mL的生理鹽水，持續(xù)1 min轉(zhuǎn)動(dòng)鼠板，然后在2片載玻片滴上腹腔洗液，在37 ℃的條件下溫育30 min。對(duì)載玻片進(jìn)行漂洗、固定、染色、蒸餾水漂洗晾干及計(jì)數(shù)等操作處理。吞噬率和吞噬指數(shù)α計(jì)算公式為：

吞噬率=吞噬細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)×100%（4）

吞噬指數(shù)α=（100個(gè)吞噬細(xì)胞吞噬的細(xì)菌總數(shù)）/100（5）

（4）細(xì)胞免疫功能測(cè)定。①ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，按照楊迪[5]的試驗(yàn)方法。②遲發(fā)型變態(tài)試驗(yàn)。受試樣品末次灌胃12 h后，將50 ?L的DNFB均勻涂抹于3 cm×3 cm脫毛的腹部皮膚;5 d后，在小鼠的右耳涂抹10 ?L的DNFB溶液，涂抹處理24 h后，取直徑8 mm的左右耳片稱重[6]，左右耳腫脹度差計(jì)算公式為：

左右耳腫脹度差=右耳重量-左耳重量（6）

1.3.4 安全性評(píng)價(jià)

（1）急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)。試驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，選健康成年小鼠20只，雌雄各半，劑量設(shè)計(jì)為20 g/kg·BW，每天定點(diǎn)灌胃（早10：00），一天灌胃2次。正常飲食14 d后，觀察記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體征變化。

（2）遺傳毒性試驗(yàn)。①小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)。小鼠適應(yīng)環(huán)境3 d，選50只健康小鼠，隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半，設(shè)低、中、高3個(gè)試驗(yàn)組，每組受試樣品劑量分別為2.5 g/kg·BW、5.0 g/kg·BW、10 g/kg·BW，另設(shè)去離子水陰性對(duì)照組及環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組，采用兩次給藥，間隔24 h，于末次給藥12 h后，取胸骨制片、固定、染色，油鏡下觀察1 000個(gè)PCE細(xì)胞，計(jì)算微核細(xì)胞率。②精子畸形試驗(yàn)。動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境3 d，選用25只健康雄性小鼠，隨機(jī)分為5組，每組5只，設(shè)低、中、高3個(gè)試驗(yàn)組，每組受試樣品劑量分別為2.5 g/kg·BW、5.0 g/kg·BW、10 g/kg·BW，陽(yáng)性對(duì)照為4 mg/mL的環(huán)磷酰胺注射液，陰性對(duì)照組為去離子水。試驗(yàn)組及陰性對(duì)照組均經(jīng)口灌胃。于首次給受試物后的第35 d處死小鼠，取附睪制片、染色，于油鏡下對(duì)每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1 000條精子，計(jì)算精子畸形發(fā)生率，采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

（3）90 d經(jīng)口毒性試驗(yàn)。對(duì)選取的試驗(yàn)組的大鼠連續(xù)灌胃90 d，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均采用3次平行試驗(yàn)。單因素方差分析采用SPSS軟件。分別采用LSD法和Tamnane法統(tǒng)計(jì)分析方差齊性分析與方差不齊統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著為概率值P≤0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑對(duì)小鼠體重影響的分析

表1為連續(xù)灌胃30 d受試樣品，小鼠體重的變化情況，由表1可知，受試樣品對(duì)小鼠體重均無(wú)顯著影響，差異不顯著（P>0.05），表明乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑未引起小鼠體重的變化。

2.2 乳礦物鹽與牛磺酸復(fù)合片劑對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響

一般機(jī)體在健康條件下，各臟器與體重是相對(duì)恒定。小鼠的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，各組間數(shù)據(jù)均無(wú)顯著差異（P>0.05）。表明乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑未能促進(jìn)小鼠免疫器官的增長(zhǎng)，對(duì)免疫器官指數(shù)無(wú)影響。

2.3 乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

表3為乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響。由表3可知，高、中、低各劑量組的ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化OD值顯著高于對(duì)照組（P<0.05），高、中、低各劑量組的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）的左右耳腫脹度（即抗體水平）顯著優(yōu)于對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明乳礦物鹽和?；撬釓?fù)配片劑顯著增強(qiáng)細(xì)胞免疫活性。

2.4 單核-巨噬細(xì)胞功能測(cè)定

由表4可知，與對(duì)照組比較，各組的碳廓清吞噬指數(shù)a、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬率、吞噬指數(shù)差異顯著（P<0.05）。說(shuō)明受試樣品促進(jìn)機(jī)體免疫細(xì)胞的增加，具有抗感染、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能的作用。

2.5 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)測(cè)定

由表5可知，在急性毒理試驗(yàn)觀察期內(nèi)，試驗(yàn)動(dòng)物生長(zhǎng)良好，進(jìn)食正常，未見(jiàn)中毒特征及死亡，大體解剖未見(jiàn)異常。

2.6 遺傳毒性試驗(yàn)測(cè)定

2.6.1 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

由表6可知，小鼠的微核細(xì)胞率均正常，其中陽(yáng)性對(duì)照組微核細(xì)胞率明顯高于陰性對(duì)照組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，差異極顯著（P<0.01），說(shuō)明受試動(dòng)物敏感，試驗(yàn)可靠。PCE/NCE在正常范圍內(nèi)，受試樣品對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞未見(jiàn)致突變作用，結(jié)果為陰性。

2.6.2 小鼠精子畸形試驗(yàn)

由表7可知，受試物各劑量組動(dòng)物精子畸變率均<30%，在正常范圍內(nèi)，陽(yáng)性對(duì)照組精子畸變率明顯高于陰性對(duì)照組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，差異極顯著（P<0.01），說(shuō)明受試小鼠敏感，試驗(yàn)結(jié)果可靠，受試樣品乳礦物鹽與牛磺酸復(fù)合片劑未對(duì)小鼠精子產(chǎn)生損傷作用，受試樣品未顯示生殖毒性和對(duì)生殖細(xì)胞潛在的致突變性，小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

2.6.3 90 d經(jīng)口毒性試驗(yàn)測(cè)定

基于前期試驗(yàn)觀察，試驗(yàn)大鼠機(jī)體及各項(xiàng)生理指標(biāo)正常，所以僅設(shè)計(jì)對(duì)照組與高劑量組，分析受試樣品對(duì)大鼠機(jī)體各組織器官的影響。各處理組中動(dòng)物數(shù)均為10只。由表8、表9可知，大鼠的肝、膽管、胃、十二指腸黏膜、睪丸及卵巢等組織正常。胃和十二指腸黏膜完整，無(wú)明顯腺體增生萎縮改變。僅出現(xiàn)個(gè)別腎髓質(zhì)部可見(jiàn)小囊腫，匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理學(xué)改變。綜合可知，各組大鼠無(wú)明顯病理變化，受試樣品乳礦物鹽和?；撬釓?fù)合片劑安全、無(wú)毒副作用。

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑未顯著影響小鼠的體重與免疫器官指數(shù)，卻顯著提高了小鼠的細(xì)胞免疫能力和單核巨噬細(xì)胞吞噬能力。另外，通過(guò)急性毒理學(xué)、遺傳毒理學(xué)和90 d毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑安全無(wú)毒副作用。綜合可知，乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑具有較高的安全性與免疫調(diào)節(jié)功能，可用于保健食品開(kāi)發(fā)利用。

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