楊蕊毓，鄧錡璋,2，田麗平，田嘉旺，邱成書，劉紅玲*

(1 成都師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，成都 611130; 2 石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832003)

麥冬(Ophiopogonjaponicus)為百合科沿階草屬多年生常綠草本植物，醫(yī)學(xué)上普遍認為其在消炎、抗癌等方面有效[1]，主要生產(chǎn)于四川和浙江，分別稱為川麥冬和杭麥冬。麥冬喜溫暖濕潤，在降雨充沛的氣候條件5～30 ℃下才能正常生長[2]，而四川大部分屬于亞熱帶濕潤和半濕潤地區(qū)，年均降雨量充沛，因此為麥冬提供了良好的生長條件，這也是四川野生型麥冬資源豐富的原因之一。隨著新興技術(shù)的發(fā)展，野生麥冬被過度采挖，其生長環(huán)境的破壞也逐漸加劇，野生資源日益枯竭，而栽培麥冬由于土地、技術(shù)等資源的限制，產(chǎn)量及品質(zhì)仍存在大量問題。

叢枝菌根(AM)真菌是普遍存在于根圍的一種有益真菌，它能夠與陸地生態(tài)系統(tǒng)90%以上的植物形成共生關(guān)系，以促進植物吸收養(yǎng)分且能影響植物對自身次生代謝物的積累[3]。AM真菌在提高藥用植物的藥用成分方面效果顯著，接種AM真菌能促進黃花蒿地上部分揮發(fā)油收油[4]，提高半夏塊莖鳥苷、生物堿等藥用成分的含量[5]。AM真菌在與植物形成菌根后，其根外菌絲不斷擴展到土壤之中，穿過土壤顆粒的間隙，其分泌的有機物質(zhì)等會直接影響到土壤的化學(xué)性質(zhì)[6]。菌根共生雙方的多樣性對維持生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)性具有不可代替的作用[7]。

目前，已有大量關(guān)于藥用植物AM真菌資源的研究，但對藥用植物川麥冬根圍土壤 AM 真菌資源的研究未見報道。本研究利用高通量測序技術(shù)，通過分析2種不同生境川麥冬根圍土壤的 AM 真菌多樣性，旨在揭示2種生境川麥冬根圍土壤 AM 真菌多樣性和優(yōu)勢群落分布特點，探討AM真菌群落分布差異的驅(qū)動因子，為AM 真菌應(yīng)用于麥冬生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)概況

采樣地分別為四川省成都市溫江區(qū)(N 30°41′48.36″, E 103°49′57.78″)和四川省攀枝花市仁和區(qū)(N26°8′44.26″, E101°48′30.39″)，其中成都溫江地處成都平原，四周有群山環(huán)抱，平原內(nèi)四季分明，日照少、氣候溫和，降雨充沛，屬亞熱帶季風氣候區(qū)，海拔600 m左右，土壤類型為水稻土。而攀枝花市仁和區(qū)屬亞熱帶溫帶多種氣候類型，該區(qū)夏季長，四季不分明，而具有旱、雨季分明，晝夜溫差大，氣候干燥，小氣候復(fù)雜多樣等特點，海拔約1 500～2 000 m，土壤類型為紅壤。

1.2 樣品采集

本試驗以川麥冬為研究對象，選取2種生境，栽培環(huán)境(C)取自成都溫江麥冬栽培基地，野生環(huán)境(N)為攀枝花仁和區(qū)平地鎮(zhèn)金沙江干熱河谷地區(qū)。于2020年9月采集2種生境川麥冬根圍土壤。每個生境隨機選取麥冬20株，每株按東南西北四個方位取樣，除去地表表層雜物后，采集10～20 cm左右的土層土樣及根系裝入塑料袋中，放置于冰盒帶回實驗室。土壤樣品一部分自然風干用于土壤理化性質(zhì)測定，一部分存放于-80 ℃冰箱用于分子鑒定。

1.3 土壤理化性質(zhì)的測定

土壤理化性質(zhì)的測定參考鮑士旦《土壤農(nóng)化分析》[8]，土壤有機質(zhì)含量用重鉻酸鉀容量法-外加熱法、土壤全氮含量用半微量凱氏法、土壤全磷用HClO4-H2SO4法、土壤全鉀含量用火焰分光光度法、土壤有效磷含量用0.5 mol·L-1NaHCO3法、土壤速效鉀含量用NH4OAc浸提-火焰光度法。

1.4 AM真菌的分子鑒定

1.4.1 川麥冬根圍土壤總DNA的提取使用土壤DNA提取試劑盒(Ezup Column Soil DNA Purification Kit)提取不同樣地的川麥冬根圍土壤總DNA，完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。

1.4.2 巢式PCR擴增利用AM真菌特異引物(表1)對所提DNA進行巢式-PCR擴增。每個樣本設(shè)置3個重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)回收PCR產(chǎn)物，使用Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。參照電泳初步的定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應(yīng)比例的混合。

表1 巢式-PCR擴增引物

1.4.3 Miseq文庫的構(gòu)建與測序通過PCR將Illumina官方接頭序列添加至目標區(qū)域外端；使用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物；Tris-HCl緩沖液洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測；氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。文庫構(gòu)建試劑使用TruSeqTM DNA Sample Prep Kit。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序(委托于上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.5 生物學(xué)信息分析

平臺測序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進行拼接，同時對所得序列的質(zhì)量進行質(zhì)控及過濾，區(qū)分不同樣本后進行OTU聚類分析及物種分類學(xué)分析。根據(jù)不同的相似度水平，對序列進行OTU水平劃分，通常以97%相似水平的OTU進行生物信息學(xué)統(tǒng)計分析。

為了得到每個OTU所對應(yīng)的物種分類信息，采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學(xué)統(tǒng)計分析，并分別在各個分類學(xué)水平：域(Domain)、界(kingdom)、門(Phylum)、綱(Class)、目(Order)、科(Family)、屬(Genus)和種(Species)統(tǒng)計各樣本的群落物種組成。

1.6 統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)分析

土壤理化性質(zhì)、AM真菌多樣性指數(shù)采用SPSS 19.0進行單因素方差分析，提取97%相似度OTU，利用mothur計算Alpha多樣性指數(shù)，計算ACE、Shannon及Simpson等多樣性指數(shù)，用Origin 2019分析繪制不同科、屬水平下豐度圖，R語言circlize包分析繪制不同樣本與種水平的關(guān)系圖，Pearson分析法及R語言cor函數(shù)分析繪制土壤理化因子與AM真菌多樣性指數(shù)、屬水平豐度之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生境川麥冬根圍土壤理化性質(zhì)

2個生境川麥冬根圍的土壤理化性質(zhì)見表2。表明野生環(huán)境(N)下川麥冬根圍土壤全鉀、全磷、有效磷含量均顯著低于人工栽培環(huán)境(C)(P<0.05)。而野生環(huán)境下川麥冬根圍土壤全氮、有機質(zhì)含量均顯著高于人工栽培環(huán)境(P<0.05)。此外，2個生境的速效鉀含量則表現(xiàn)出無顯著差異。

表2 土壤理化性質(zhì)

2.2 不同生境川麥冬根圍AM真菌多樣性

使用生物學(xué)Alpha多樣性指數(shù)ACE、Shannon、Simpson表征川麥冬根圍土壤中AM真菌的多樣性(圖1)。結(jié)果顯示，野生環(huán)境(N)川麥冬根圍土壤AM真菌多樣性指數(shù)ACE、Shannon均顯著大于栽培環(huán)境(C)麥冬根圍土壤AM真菌,而Simpson指數(shù)則相反。

2.3 AM真菌分子多樣性鑒定分析

基于AM真菌18S rRNA基因的高通量測序，分析了不同生境川麥冬根圍土壤中AM真菌種屬多樣性。以97%為閾值對測序序列劃分操作分類單元(OTU)，共獲得31個OTU，31個OTU分屬于3個科3個屬10個種。分析發(fā)現(xiàn)，野生型川麥冬根圍AM真菌群落組成結(jié)構(gòu)與人工栽培型差異顯著(圖2-4)。人工栽培型川麥冬根圍鑒定出AM真菌1個科1個屬6個種，1個科為球囊霉科(Glomeraceae)，1個屬為球囊霉屬(Glomus)，6個種分別為Glomus-MO-G18-VTX00064、Glomus-MO-G22-VTX00125、Glomus-MO-G23-VTX00222、Glomus-Wirsel-OTU16-VTX00156、Glomus-acnaGlo2-VTX00155和Glomus-group-B-Glomus-acnaGlo7-VTX00057。而野生環(huán)境中川麥冬根圍鑒定出AM真菌3個科3個屬7個種，3個科分別為無梗囊霉科(Acaulosporaceae)、多孢囊霉科(Diversisporaceae)和球囊霉科，3個屬分別為無梗囊霉屬(Acaulospora)、多孢囊霉屬(Diversispora)、球囊霉屬，7個種分別為Acaulospora-Acaulospora1-3-VTX00201、Diversispora-sp.-VTX00058、Glomus-GlAd3.3-VTX00289、Glomus-MO-G22-VTX00125、Glomus-MO-G23-VTX00222、Glomus-group-B-Glomus-acnaGlo7-VTX00057和Glomus-group-B-Glomus-lamellosu-VTX00193。兩個生境共有1個科為球囊霉科，共有1個屬為球囊霉屬，共有3個種為Glomus-MO-G22-VTX00125、Glomus-MO-G23-VTX00222和Glomus-group-B-Glomus-acnaGlo7-VTX00057。兩個生境的優(yōu)勢科均為球囊霉科，優(yōu)勢屬均為球囊霉屬。

2.4 土壤理化性質(zhì)與AM真菌多樣性的相關(guān)性

對不同生境川麥冬根圍土壤理化因子與AM真菌多樣性指數(shù)進行相關(guān)性分析(圖5)，川麥冬根圍土壤AM真菌多樣性指數(shù)與土壤理化因子存在相關(guān)性。AM真菌ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)與土壤理化因子存在相同的趨勢，均與土壤全鉀(TK)、全磷(TP)呈顯著負相關(guān)，與土壤全氮(TN)呈顯著正相關(guān)，與土壤速效鉀(AK)、有效磷(AP)呈負相關(guān)，與土壤有機質(zhì)(OM)呈正相關(guān)。而AM真菌Simpson指數(shù)與土壤全鉀(TK)、全磷(TP)呈顯著正相關(guān)，與土壤全氮(TN)呈顯著負相關(guān)，與土壤速效鉀(AK)呈正相關(guān)、與土壤有效磷(AP)呈顯著正相關(guān)，與土壤有機質(zhì)(OM)呈顯著負相關(guān)。其中，TK、TP、TN為不同生境川麥冬根圍土壤AM真菌多樣性的主要驅(qū)動因子。

2.5 土壤理化性質(zhì)與AM真菌群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性

對不同生境川麥冬根圍土壤理化因子與AM真菌屬水平相對豐度進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)(圖6)，無梗囊霉屬和多孢囊霉屬均與土壤TP、AP、TK顯著負相關(guān)，與土壤OM、TN顯著正相關(guān)，球囊霉屬則表現(xiàn)出與土壤TP、AP、TK顯著正相關(guān)，而與土壤有機質(zhì)、堿解氮顯著負相關(guān)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，無梗囊霉屬和多孢囊霉屬與土壤理化因子的相關(guān)性變化趨勢與球囊霉屬與土壤理化因子的相關(guān)性變化趨勢相反，而球囊霉屬與無梗囊霉屬和多孢囊霉屬均呈顯著負相關(guān)。其中，TK、TP、TN、AP、OM為不同生境川麥冬根圍AM真菌群落結(jié)構(gòu)的主要驅(qū)動因子。

3 討 論

3.1 不同生境下川麥冬根圍AM多樣性

微生物的多樣性指數(shù)是用來描述某一微生物類型的個體數(shù)和均勻度的重要指標，可以直接地反映某一微生物群落的種類豐富度[9]。本研究中，野生環(huán)境多樣性指數(shù)ACE和Shannon指數(shù)均顯著大于人工栽培川麥冬，而Simpson指數(shù)則相反。進一步說明野生環(huán)境下川麥冬根圍AM真菌豐富度顯著大于人工栽培環(huán)境。大量研究已經(jīng)證實，AM真菌產(chǎn)生的根圍菌絲能幫助植物獲得更為豐富的營養(yǎng)[10]，這一結(jié)果說明在野生環(huán)境中麥冬需要更豐富的AM真菌幫助其生長發(fā)育，而人工栽培下，由于施肥等人為因素的影響，麥冬根圍AM真菌豐度有所減少。楊高文等[11]研究表明，AM真菌的多樣性較高時有利于植物群落的穩(wěn)定性，并促進植物生產(chǎn)力，這可能是野生麥冬成藥品質(zhì)高于栽培的原因之一。

3.2 不同生境下麥冬根圍AM真菌群落結(jié)構(gòu)

AM 真菌的分類鑒定是分析 AM 真菌多樣性的關(guān)鍵。近年來，通過分析 18S rDNA基因序列鑒定 AM 真菌種類，因其與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法相比更具科學(xué)性和準確性，成為 AM 真菌分類研究的重要手段。潘佩蕾等[12]利用分子鑒定在杭麥冬根際土壤分離鑒定了10種菌根孢子，其中球囊霉屬和巨孢囊霉屬為主要優(yōu)勢類群。同樣的本研究通過Illumina平臺測序?qū)σ吧驮耘鄡煞N不同生境下的麥冬根圍AM真菌進行分析，兩個生境共鑒定出3個科3個屬，且不同生境麥冬根圍土壤AM真菌優(yōu)勢屬均為球囊霉屬，可作為麥冬植株篩選優(yōu)勢菌種的依據(jù)。該結(jié)果與大量研究結(jié)果類似，球囊霉屬在中國廣泛分布，適應(yīng)性強，屬于廣譜性共生系統(tǒng)真菌[13-14]。可能是由于球囊霉屬能利用自身菌絲及共生菌根的根段進行繁殖[15-16]，相比于其他種屬其具有更強的產(chǎn)孢能力和侵染宿主根系。有研究表明不同生境下植物根圍AM真菌多樣性存在顯著差異，程俐陶等[17]對貴州地區(qū)栽培及野生半夏進行傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)野生半夏根圍土壤中AM真菌種類、數(shù)量及活力均高于栽培半夏。周麗思等[18]采用巢式-PCR 和 DNA 克隆測序技術(shù)分析了西雙版納地區(qū)野生與栽培絞股藍根內(nèi) AM真菌的 18S rDNA 序列，結(jié)果顯示，相比于栽培絞股藍，野生絞股藍根內(nèi)的AM真菌種類更加豐富。本研究中，在野生環(huán)境下麥冬根圍共鑒定出AM真菌3個屬7個種，而人工栽培麥冬根圍鑒定出AM真菌1個屬6個種。野生環(huán)境下麥冬根圍AM真菌顯然更為豐富，與前人研究結(jié)果一致。

3.3 不同生境麥冬根圍AM真菌群落多樣性與土壤理化因子的相關(guān)性

AM真菌廣泛存在于土壤環(huán)境中，植物從AM真菌定殖中受益，在很大程度上取決于土壤環(huán)境條件[19]。曹敏等[20]對重慶地區(qū)茅蒼術(shù)根際叢枝菌根真菌多樣性和土壤因子進行冗余分析表明，根際土壤因子對AM真菌的群落組成和豐度存在顯著影響，是導(dǎo)致AM真菌群落結(jié)構(gòu)地理分布格局差異的重要原因之一。本研究中，栽培麥冬和野生麥冬根圍土壤理化因子全鉀、全磷、全氮、速效鉀、有效磷及有機質(zhì)含量均表現(xiàn)出顯著差異，且野生環(huán)境多樣性指數(shù)Ace和Shannon指數(shù)均顯著大于人工栽培麥冬，Simpson指數(shù)則相反，說明土壤理化因子對AM真菌分布存在影響。進一步對土壤理化因子和AM真菌多樣性指數(shù)ACE、Shannon及Simpson進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，土壤理化因子TK、AK與AM真菌多樣性指數(shù)ACE和Shannon均呈顯著負相關(guān)，與Simpson指數(shù)呈顯著正相關(guān)。該結(jié)果與張含眉等[21]研究結(jié)果相似，但與張之為等[22]所得出土壤K含量減少，促使AM真菌類群呈現(xiàn)上升趨勢的研究結(jié)果相反，推測一定范圍內(nèi)豐富鉀能促進菌根真菌的形成，而過高的鉀反而抑制AM真菌菌絲的發(fā)育。同時，本研究中土壤理化因子TP、AP與AM真菌多樣性指數(shù)ACE和Shannon均呈顯著負相關(guān)，而Simpson指數(shù)則相反。與王化秋等[23]根系速效磷與AM真菌豐富度指數(shù)均顯著負相關(guān)的研究結(jié)果類似，而與楊春雪等[24]得出土壤磷與AM真菌物種豐富呈顯著正相關(guān)的結(jié)果相反。同樣地，推測土壤內(nèi)一定濃度的磷能促進菌根共生體的發(fā)育，而過高的磷含量則抑制菌絲的形成。李楠海等[25]提出在80 mg/kg磷水平，接種叢枝菌根真菌對桔梗的促生效果最佳。AM真菌與麥冬的接種效應(yīng)相關(guān)研究表明[26]，土壤中K含量直接影響菌根的形成，在濃度約為0.18 g/kg時，促進麥冬菌根的形成，K濃度大于0.24 g/kg時侵染率顯著降低，說明過高的K不利于菌根的發(fā)育。另外，本研究土壤理化因子TN與AM真菌多樣性指數(shù)ACE和Shannon均呈顯著正相關(guān)，而Simpson指數(shù)則相反。該結(jié)果與Jansa等[27]研究結(jié)果相反。推測土壤N含量對AM真菌菌絲的形成以及分布的影響存在一定的閾值。土壤有機質(zhì)與AM真菌多樣性指數(shù)ACE和Shannon均呈正相關(guān)，而Simpson指數(shù)則相反。與劉敏等[28-29]研究結(jié)果相似。相關(guān)研究說明土壤有機質(zhì)含量過高，肥力過剩，抑制菌根的功能發(fā)揮和AM真菌的生長，導(dǎo)致AM真菌豐度下降[30]。同樣有研究發(fā)現(xiàn)，AM真菌對其所處環(huán)境的養(yǎng)分狀況較為敏感，豐度過高的養(yǎng)分供應(yīng)將對AM真菌孢子的萌發(fā)和菌絲的生長產(chǎn)生影響，間接地減少AM真菌對宿主植株的侵染與共生[31]。

栽培麥冬根圍土壤全磷、全鉀、速效鉀、有效磷含量均顯著大于野生麥冬，這與栽培麥冬人工施磷肥、鉀肥有關(guān)。而栽培麥冬根圍AM真菌多樣性指數(shù)小，可能是因為栽培條件下，麥冬根圍營養(yǎng)充足，不需要與AM真菌侵染形成菌根結(jié)構(gòu)來獲得其余營養(yǎng)。有研究表明，在減量施肥狀態(tài)下，植物根系A(chǔ)M真菌的菌絲侵染率高于常規(guī)施肥[32]?？状贡萚33]探究不同施肥水平下AM真菌對甘蔗生長的影響表明，在減量施肥水平下，AM真菌能更好地發(fā)揮對植物的促生效益。

3.4 麥冬根圍AM真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化因子的相關(guān)性

土壤理化因子作用于宿主植物從而間接地影響了AM真菌的生長繁殖與分布[34]。高甜甜等[35]對不同品種甘草根際土壤AM真菌群落多樣性進行分析發(fā)現(xiàn)，不同屬的AM真菌與宿主植物根系土壤理化性質(zhì)之間所存在的相關(guān)性各不同。本研究對麥冬根圍土壤理化因子與AM真菌屬水平群落結(jié)構(gòu)進行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，土壤磷、鉀、氮含量和有機質(zhì)豐度均對AM真菌屬水平群落結(jié)構(gòu)存在顯著影響。其中AM真菌無梗囊霉屬、多孢囊霉屬相對豐度與土壤磷含量顯著負相關(guān)，而AM真菌球囊霉屬與其則呈顯著負相關(guān)的趨勢。以往有研究表明，球囊霉屬能在磷含量較高的土壤環(huán)境中繁殖，并能提高宿主對磷的吸收[36]。進一步分析發(fā)現(xiàn)，球囊霉屬與無梗囊霉屬和多孢囊霉屬均呈顯著負相關(guān)。有研究表明，處于互利共生關(guān)系的微生物呈正相關(guān)，而處于競爭關(guān)系的微生物則呈負相關(guān)[37]，故推測球囊霉屬與其他兩個屬存在競爭關(guān)系。

4 結(jié) 論

本實驗利用高通量測序技術(shù)對不同生境下麥冬根圍AM真菌多樣性進行分析，共鑒定出AM真菌3個科3個屬10個種。在不同生境下球囊霉屬均為麥冬根圍優(yōu)勢屬，可作為麥冬植株菌種篩選的實驗依據(jù)。不同生境下麥冬根圍AM真菌多樣性差異顯著，野生麥冬根圍AM真菌較為豐富。進一步對土壤驅(qū)動因子和AM真菌多樣性指數(shù)及屬相對豐度進行Pearson分析發(fā)現(xiàn)，AM真菌群落分布及結(jié)構(gòu)組成與土壤理化因子顯著相關(guān)，但不同的因子相關(guān)性表現(xiàn)存在差異，而同一土壤驅(qū)動因子對AM真菌發(fā)育的驅(qū)動存在一定的閾值，過高的土壤肥力不利于菌絲的發(fā)育。土壤N、P、K和有機質(zhì)含量是影響麥冬根圍AM真菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素，且不同種屬的AM真菌對其所處生境的需求不同。本研究為進一步優(yōu)化麥冬的栽培措施和合理施肥提供了理論參考。