潘志輝，席令儀，孫景然，劉偉麗，吳瑾，房彥軍

軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院 環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中，使用農(nóng)藥的種類和數(shù)量越來越多。農(nóng)藥是把“雙刃劍”，它能解放農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力、減少農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量損失，但濫用農(nóng)藥會造成環(huán)境污染、人畜中毒等嚴(yán)重后果，人們通過皮膚接觸、飲食攝入和呼吸暴露于農(nóng)藥[1]。農(nóng)藥對生物具有多種毒性，主要包括生殖毒性、內(nèi)分泌干擾毒性和神經(jīng)系統(tǒng)毒性等，對人類健康造成嚴(yán)重威脅。長期低劑量接觸有機(jī)磷農(nóng)藥會降低男性精子存活率，影響受精能力及精液的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)[2]。

毒死蜱是一種廣譜有機(jī)磷農(nóng)藥，在世界范圍內(nèi)廣泛使用，其半衰期較長，能夠長時間存在于土壤和水中[3]。毒死蜱可以損傷神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等，現(xiàn)有研究表明其可導(dǎo)致雄性大鼠精子數(shù)量減少、生存能力降低，睪酮等生殖激素水平明顯降低[4]。長期暴露于毒死蜱會導(dǎo)致各種生殖系統(tǒng)缺陷，比如男性生殖系統(tǒng)功能退化和不育[5]。Vahabi Barzi等[6]的研究表明，毒死蜱損傷小鼠生殖系統(tǒng)，誘導(dǎo)胚胎發(fā)育中的細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致流產(chǎn)。毒死蜱暴露后，誘導(dǎo)GC-1細(xì)胞活性氧(ROS)水平升高，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7]。三唑類殺菌劑是一類具有獨特1,2,4-三唑環(huán)結(jié)構(gòu)的殺菌劑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用非常廣泛[8]。苯醚甲環(huán)唑作為三唑類中應(yīng)用廣泛的農(nóng)藥之一，更易進(jìn)入環(huán)境中造成污染，對人體健康產(chǎn)生威脅。長期暴露于苯醚甲環(huán)唑降低海洋青鳉魚下一代的繁殖力和生存力[9]。Li等[10]的研究結(jié)果表明，苯醚甲環(huán)唑誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞核溶解，提高細(xì)胞凋亡率。苯醚甲環(huán)唑暴露后，顯著降低大鼠睪丸內(nèi)精子數(shù)量，誘導(dǎo)組織結(jié)構(gòu)改變和DNA損傷[11]。此外，苯醚甲環(huán)唑誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞DNA損傷，提高細(xì)胞凋亡率[12]。已有研究報道單一農(nóng)藥以及農(nóng)藥和金屬物質(zhì)混用對生物的毒性作用，鮮有報道研究多種農(nóng)藥聯(lián)合暴露的生殖毒性作用。

精子的產(chǎn)生是一個復(fù)雜而連續(xù)的過程，包括精原細(xì)胞增殖、精母細(xì)胞減數(shù)分裂和精子細(xì)胞向精子的分化，其中，精原細(xì)胞在精子產(chǎn)生中起著至關(guān)重要的作用，在維持正常精子數(shù)量方面具有重要的生理意義[13-14]。目前的研究表明，毒死蜱和苯醚甲環(huán)唑在單獨暴露時具有明顯的生殖毒性，但關(guān)于毒死蜱和苯醚甲環(huán)唑聯(lián)合暴露生殖毒性效應(yīng)與機(jī)制的研究較少。因此，以小鼠精原細(xì)胞GC-1為模型，通過對不同濃度農(nóng)藥進(jìn)行細(xì)胞活力檢測，測定毒死蜱和苯醚甲環(huán)唑單獨和聯(lián)合暴露后其ROS、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)等氧化應(yīng)激指標(biāo)水平，并驗證凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，從而研究毒死蜱和苯醚甲環(huán)唑單獨和聯(lián)合暴露對GC-1細(xì)胞的毒性作用，為評估這2種農(nóng)藥對生殖系統(tǒng)的毒性作用提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

毒死蜱(chlorpyrifos, CPF)標(biāo)準(zhǔn)品(CAS: 2921-88-2，純度≥99.6%，Dr. Ehrenstorfer GmbH，德國)，苯醚甲環(huán)唑(difenoconazole, DFC)標(biāo)準(zhǔn)品(CAS: 119446-68-3，純度≥99.5%，Dr. Ehrenstorfer GmbH，德國)，小鼠精原細(xì)胞GC-1(實驗室原有)，DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone，美國)，胎牛血清(GIBCO，美國)，0.25%胰蛋白酶(中科邁晨(北京)科技有限公司，中國)，青鏈霉素聯(lián)合液(Hyclone，美國)，二甲基亞砜(DMSO，AppliChem，德國)，Celltiter-Glo(Promega，美國)，ROS、MDA和GSH檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國)，線粒體膜電位檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國)，PE偶聯(lián)Annexin V細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(BD Bioscience，美國)；PARP一抗(CST：9532)，Cleaved-PARP一抗(CST：94885)，Caspase3一抗(CST：9662)，Cleaved-Caspase3一抗(CST：9664)，Bax一抗(武漢塞維爾，GB11690)，β-Tublin一抗(CST：2128)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與染毒

GC-1細(xì)胞用含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素聯(lián)合液的DMEM完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞密度為90%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)，隔天換液，保證細(xì)胞處于對數(shù)生長期。根據(jù)Wang等[15]的研究，后續(xù)實驗的濃度基于毒死蜱和苯醚甲環(huán)唑2種藥物的半抑制濃度(IC50)設(shè)置。

1.3 細(xì)胞活力檢測

將毒死蜱、苯醚甲環(huán)唑2種標(biāo)準(zhǔn)品用DMSO溶解配制成濃度為500 mmol·L-1的儲備液，于-20 ℃保存。調(diào)整對數(shù)期細(xì)胞密度接種至96孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到80%時，將農(nóng)藥儲備液用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋至0、0.195、0.039、0.078、0.156、0.313、0.625、1.25、2.50和5.00 mmol·L-1，并將不同濃度毒死蜱、苯醚甲環(huán)唑按每孔100 μL加入至96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。暴露24 h后，每孔加入50 μL Celltiter-Glo試劑，在15 min內(nèi)通過酶標(biāo)儀檢測其發(fā)光度，確定IC50，并檢測0、12、24、36和48 h的細(xì)胞生存率，得到相應(yīng)的劑量-時間效應(yīng)結(jié)果。

1.4 ROS含量檢測

采用DCFH-DA熒光探針法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量。取對數(shù)生長期細(xì)胞，加入2種藥物的單獨和聯(lián)合組合于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，DMSO溶劑作為對照。刺激細(xì)胞24 h后，按照ROS測試盒說明書加入DCFH-DA，37 ℃孵育30 min，然后加入胰酶細(xì)胞消化，加入培養(yǎng)基終止消化后離心，PBS清洗，收集細(xì)胞沉淀用PBS重懸，用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS。

1.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，加入2種藥物的單獨和聯(lián)合組合，對照組為DMSO溶劑。刺激細(xì)胞24 h。除去多余培養(yǎng)基，洗滌1次，充分裂解細(xì)胞。12 000 r·min-1、4 ℃離心5 min，取上清液待測。按照MDA檢測試劑盒說明書配制MDA檢測工作液，向每組樣品中加入適量MDA檢測工作液，沸水浴加熱15 min。冷卻至室溫后，1 000 r·min-1離心10 min，取上清液測定532 nm處的吸光度值，通過計算得出樣品中MDA的含量。按照SOD檢測試劑盒說明書配制酶工作液以及反應(yīng)啟動工作液，向每組樣品中加入適量工作液和緩沖液，充分震蕩混勻，37 ℃孵育30 min，立即測定450 nm處吸光度值，計算得到樣品中SOD的活性。按照GSH檢測試劑盒說明書配制總谷胱甘肽檢測工作液以及GSH清除試劑工作液，向每組樣品中加入適量工作液，充分混勻，25 ℃孵育5 min。然后向混合反應(yīng)體系加入50 μL 0.5 mg·mL-1NADPH溶液終止反應(yīng)，充分混勻后立即測定412 nm處的吸光度值，每5 min測定一次，共測定5次，歷時25 min，分別計算總谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的含量，然后計算GSH的含量。

1.6 細(xì)胞線粒體膜電位檢測

取對數(shù)生長期細(xì)胞，加入2種藥物的單獨和聯(lián)合組合，對照組為DMSO溶劑。刺激細(xì)胞24 h后，除去多余培養(yǎng)基并用PBS清洗，加入胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞并重懸。然后按照試劑盒說明書配制JC-1染色工作液和染色緩沖液，每組加入0.5 mL染色工作液后混勻放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min；取出后600g離心5 min，棄上清液并用染色緩沖液洗滌2次；0.5 mL染色緩沖液重懸細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測

取對數(shù)生長期細(xì)胞，加入2種藥物的單獨和聯(lián)合組合，對照組為DMSO溶劑。刺激細(xì)胞24 h后，消化離心收集細(xì)胞，加入1 mL PBS緩沖溶液重懸細(xì)胞，再次離心完成后加入1 mL試劑盒緩沖液重懸細(xì)胞。所有樣品管取300 μL至流式管中，每支流式管中加入2 μL 7-AAD和PE試劑，100 μL稀釋后的緩沖液，室溫下避光染色5～15 min，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.8 Western blot分析

常規(guī)收集各處理組的細(xì)胞提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。定量后將蛋白樣品置于金屬浴中100 ℃煮沸10 min，蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳至溴酚藍(lán)接近分離膠底部時停止；轉(zhuǎn)膜前，用甲醇激活PVDF膜，將蛋白質(zhì)由聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至0.20 μm PVDF膜；結(jié)束后采用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，室溫孵育2 h；封閉結(jié)束后，用TBST快速洗膜3次，每次5～10 min；按照抗體說明書，配制適當(dāng)濃度的一抗孵育液，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次5～10 min，然后放于合適濃度的二抗孵育液中室溫孵育1 h，TBST再次洗膜3次，每次5～10 min；清洗好的PVDF膜上滴加適量發(fā)光顯跡液，暴露于化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)中檢測蛋白的表達(dá)。利用Image J軟件分析灰度值，確定蛋白的相對表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，多個實驗組與一個對照組均數(shù)的比較用Dunnett法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果(Results)

2.1 細(xì)胞活力檢測

為評估毒死蜱、苯醚甲環(huán)唑單獨暴露以及2種藥物聯(lián)合暴露對GC-1細(xì)胞的影響，通過Cell titer檢測細(xì)胞暴露于農(nóng)藥后的細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞活力隨之下降(圖1(a)～(b))。計算得到毒死蜱、苯醚甲環(huán)唑?qū)C-1細(xì)胞的IC50分別為158.5 μmol·L-1和89.57 μmol·L-1。后續(xù)實驗使用濃度為毒死蜱200 μmol·L-1，苯醚甲環(huán)唑120 μmol·L-1；聯(lián)合組為毒死蜱200 μmol·L-1+苯醚甲環(huán)唑120 μmol·L-1。正常的GC-1細(xì)胞呈上皮樣細(xì)胞狀，暴露于不同濃度的毒死蜱和苯醚甲環(huán)唑24 h后，隨著染毒濃度的增加細(xì)胞形態(tài)逐漸呈不規(guī)則狀，出現(xiàn)圓形、回縮和細(xì)胞體積變小等變化。且在毒死蜱和苯醚甲環(huán)唑聯(lián)合暴露組中，細(xì)胞形態(tài)改變情況更為顯著(圖1(c))。此外，研究毒死蜱、苯醚甲環(huán)唑2種藥物單獨和聯(lián)合暴露對細(xì)胞活力影響與時間的效應(yīng)關(guān)系可知，隨著時間的增加，每組細(xì)胞活力都有增長，但與對照組細(xì)胞相比其生長明顯受到抑制(圖1(d)～(f))。

圖1 不同濃度毒死蜱(CPF)和苯醚甲環(huán)唑(DFC)對細(xì)胞活力的影響注：(a) 不同濃度毒死蜱對GC-1細(xì)胞活力的影響；(b) 不同濃度苯醚甲環(huán)唑?qū)C-1細(xì)胞活力的影響；(c) 毒死蜱、苯醚甲環(huán)唑單獨和聯(lián)合暴露下的細(xì)胞形態(tài)(50 μm)；(d) 不同濃度毒死蜱(0、75、150和300 μmol·L-1)暴露與GC-1細(xì)胞活力的時間效應(yīng)曲線；(e) 不同濃度苯醚甲環(huán)唑(0、40、80和120 μmol·L-1)暴露與GC-1細(xì)胞活力的時間效應(yīng)曲線；(f) 毒死蜱、苯醚甲環(huán)唑聯(lián)合暴露與GC-1細(xì)胞活力的時間效應(yīng)曲線。Fig. 1 Effects of chlorpyrifos (CPF) and difenoconazole (DFC) at different concentrations on cell viability Note: (a) Effects of chlorpyrifos at different concentrations on cell viability of GC-1 cells; (b) Effects of difenoconazole at different concentrations on cell viability of GC-1 cells; (c) Cell morphology in groups exposed to different concentrations of chlorpyrifos and difenoconazole (50 μm); (d) Effects of chlorpyrifos at different concentrations (0, 75, 150 and 300 μmol·L-1) on cell viability of GC-1 cells after 0, 12, 24, 36 and 48 h exposure; (e) Effects of difenoconazole at different concentrations (0, 40, 80 and 120 μmol·L-1) on cell viability of GC-1 cells after 0, 12, 24, 36 and 48 h exposure; (f) Effects of chlorpyrifos and difenoconazole on cell viability of GC-1 cells after 0, 12, 24, 36 and 48 h exposure.

2.2 毒死蜱、苯醚甲環(huán)唑單獨和聯(lián)合暴露對GC-1細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響

研究表明，細(xì)胞中ROS的積累是由于ROS產(chǎn)生能力增加或其清除能力下降所致。在本研究中，GC-1細(xì)胞經(jīng)毒死蜱、苯醚甲環(huán)唑單獨和聯(lián)合暴露24 h后，通過檢測MDA含量、ROS生成、GSH和SOD活性來分析氧化應(yīng)激水平。結(jié)果表明，與對照組相比，毒死蜱、苯醚甲環(huán)唑單獨和聯(lián)合暴露后細(xì)胞ROS水平升高，并且與單獨暴露組相比，聯(lián)合暴露組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高(圖2(a))，表明毒死蜱、苯醚甲環(huán)唑單獨和聯(lián)合暴露后可以引起GC-1細(xì)胞產(chǎn)生ROS。與對照組相比，單獨暴露組細(xì)胞SOD和GSH活性低于對照組，MDA含量升高。與單獨暴露組相比，聯(lián)合暴露組細(xì)胞SOD和GSH活性顯著降低，細(xì)胞內(nèi)MDA含量顯著升高(圖2(b)～(d))。

圖2 毒死蜱和苯醚甲環(huán)唑聯(lián)合暴露對GC-1細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響注：(a) 活性氧(ROS)水平，(b) 丙二醛(MDA)含量，(c) 超氧化物歧化酶(SOD)活性，(d) 還原型谷胱甘肽(GSH)活性；數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n=3；**P<0.01、***P<0.001，與對照組相比；## P<0.01、### P<0.001，與聯(lián)合暴露組相比。Fig. 2 Effect of combined chlorpyrifos and difenoconazole exposure on oxidative stress levels in GC-1 cellsNote: (a) Reactive oxygen species (ROS) level, (b) Malondialdehyde (MDA) content, (c) Superoxide dismutase (SOD) activity, (d) Glutathione (GSH) activity; all data were expressed as mean±S.E.M, n=3; **P<0.01, ***P<0.001, compared with DMSO control; ## P<0.01、### P<0.001, compared with the combined exposure group.

2.3 毒死蜱、苯醚甲環(huán)唑單獨和聯(lián)合暴露對GC-1細(xì)胞線粒體膜電位的影響

通過JC-1探針與流式細(xì)胞儀檢測毒死蜱和苯醚甲環(huán)唑聯(lián)合暴露對GC-1細(xì)胞線粒體膜電位的影響，對照組中高電位/低電位的比率為61.5，毒死蜱組為11.05，苯醚甲環(huán)唑組為5.21，聯(lián)合暴露組為2.95，與對照組相比，毒死蜱、苯醚甲環(huán)唑單獨和聯(lián)合暴露誘導(dǎo)GC-1細(xì)胞線粒體膜電位下降，而且與單獨暴露組相比，聯(lián)合暴露組細(xì)胞線粒體膜電位顯著下降(圖3)。

圖3 毒死蜱和苯醚甲環(huán)唑聯(lián)合暴露對GC-1細(xì)胞線粒體膜電位的影響注：***P<0.001，與對照組相比；### P<0.001，與聯(lián)合暴露組相比。Fig. 3 Effect of combined chlorpyrifos and difenoconazole exposure on the mitochondrial membrane potential of GC-1 cellsNote: ***P<0.001, compared with DMSO control; ### P<0.001, compared with the combined exposure group.

2.4 毒死蜱、苯醚甲環(huán)唑單獨和聯(lián)合暴露誘導(dǎo)GC-1細(xì)胞凋亡

毒死蜱、苯醚甲環(huán)唑單獨和聯(lián)合暴露GC-1細(xì)胞24 h，經(jīng)Annexin V-PE雙染色、流式細(xì)胞儀檢測可知，與對照組相比，毒死蜱和苯醚甲環(huán)唑單獨暴露均能誘導(dǎo)GC-1細(xì)胞凋亡，毒死蜱暴露后細(xì)胞凋亡率為23.0%，苯醚甲環(huán)唑暴露后細(xì)胞凋亡率為25.0%，而聯(lián)合組的凋亡率顯著升高，為37.7%(圖4)。與單獨暴露組相比，聯(lián)合暴露組細(xì)胞凋亡率顯著提高，可見毒死蜱和苯醚甲環(huán)唑聯(lián)合暴露明顯誘導(dǎo)GC-1細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖4 毒死蜱和苯醚甲環(huán)唑聯(lián)合暴露對GC-1細(xì)胞凋亡率的影響注：(a) 與對照組相比，毒死蜱、苯醚甲環(huán)唑單獨和聯(lián)合暴露對GC-1細(xì)胞凋亡的影響，(b) 各處理組凋亡率；數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n=3；***P<0.001，與對照組相比；### P<0.001，與聯(lián)合暴露組相比。Fig. 4 Effect of combined chlorpyrifos and difenoconazole exposure on the apoptosis rate of GC-1 cells Note: (a) Compared with DMSO control, the effects of chlorpyrifos and difenoconazole on apoptosis of GC-1 cells; (b) The apoptosis rate of each treatment group; all data were expressed as mean±S.E.M, n=3; ***P<0.001, compared with DMSO control; ### P<0.001, compared with the combined exposure group.

2.5 凋亡相關(guān)蛋白檢測

為進(jìn)一步驗證毒死蜱和苯醚甲環(huán)唑聯(lián)合暴露對GC-1細(xì)胞凋亡通路的影響，通過Western blot驗證單獨及聯(lián)合處理后相關(guān)蛋白Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase3和Bax的表達(dá)情況。結(jié)果表明，與對照組相比，單獨和聯(lián)合暴露組Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase3蛋白的表達(dá)上升，同時促凋亡蛋白Bax的表達(dá)明顯增加。與單獨暴露組相比，聯(lián)合暴露組Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase3和Bax蛋白的表達(dá)明顯上升(圖5)，以上結(jié)果表明毒死蜱和苯醚甲環(huán)唑聯(lián)合暴露誘導(dǎo)GC-1細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)提高。

圖5 毒死蜱和苯醚甲環(huán)唑聯(lián)合暴露對GC-1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響注：(a) PARP、Cleaved-PARP、Caspase3、Cleaved-Caspase3和Bax蛋白條帶圖，(b) PARP定量分析圖，(c) Cleaved-PARP定量分析圖，(d) Caspase3定量分析圖，(e) Cleaved-Caspase3定量分析圖，(f) Bax蛋白定量分析圖；*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，與對照組相比；# P<0.05、## P<0.01、### P<0.001，與聯(lián)合暴露組相比。Fig. 5 Effect of combined chlorpyrifos and difenoconazole exposure on the expression levels of apoptosis-related proteins in GC-1 cellsNote: The expressions of apoptosis-related proteins of PARP, Cleaved-PARP, Caspase3, Cleaved-Caspase3 and Bax, (b)～(f) Relative protein expression levels of (b) PARP, (c) Cleaved-PARP, (d) Caspase3, (e) Cleaved-Caspase3 and (f) Bax normalized to β-Tublin; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, compared with DMSO control; # P<0.05, ## P<0.01, ### P<0.001, compared with the combined exposure group.

3 討論(Discussion)

毒死蜱效力持久，是目前世界上農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用最為廣泛的有機(jī)磷農(nóng)藥[3,16]。苯醚甲環(huán)唑作為一種典型的三唑類殺菌劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用，已有報道其會對人類健康尤其是男性生殖系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響。作為雄性生殖系統(tǒng)中最重要的器官，睪丸的主要作用是分泌和合成雄激素，生成精子[17]。精子發(fā)生是一個從精原細(xì)胞到精母細(xì)胞再到精子細(xì)胞的有序發(fā)展過程，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡等協(xié)調(diào)有序的過程。精原細(xì)胞在維持正常的精子發(fā)生和精子數(shù)量方面起著重要的作用。細(xì)胞凋亡是一種進(jìn)化保守的細(xì)胞程序性死亡機(jī)制，在精子發(fā)生中起重要作用。在男性生殖細(xì)胞的發(fā)育過程中，約有75%的生殖細(xì)胞通過凋亡調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞與支持細(xì)胞的數(shù)量和比例[18-19]。有研究表明，細(xì)胞凋亡主要影響精原細(xì)胞而不是精母細(xì)胞，生殖細(xì)胞的凋亡可能是自發(fā)發(fā)生的，也可能由某些物理刺激、化學(xué)試劑等引發(fā)的[20]。例如，乙草胺作為一種除草劑，可以造成大鼠DNA損傷以及誘導(dǎo)小鼠精原細(xì)胞GC-1凋亡[17]。本研究以小鼠精原細(xì)胞GC-1為暴露模型，研究毒死蜱和苯醚甲環(huán)唑聯(lián)合暴露對GC-1細(xì)胞的毒性效應(yīng)與機(jī)制，以期為農(nóng)藥暴露對人類生殖系統(tǒng)的毒性作用研究提供一定的理論依據(jù)。

本研究通過Cell titer法檢測GC-1細(xì)胞暴露于0～500 mmol·L-1毒死蜱和苯醚甲環(huán)唑24 h后所受的毒性影響，結(jié)果表明隨著暴露濃度的增加，細(xì)胞活力呈劑量依賴性降低。2種藥物對GC-1細(xì)胞的IC50分別為毒死蜱158.5 μmol·L-1，苯醚甲環(huán)唑89.57 μmol·L-1。調(diào)整濃度為毒死蜱200 μmol·L-1，苯醚甲環(huán)唑120 μmol·L-1，聯(lián)合組為毒死蜱200 μmol·L-1+苯醚甲環(huán)唑120 μmol·L-1進(jìn)行后續(xù)實驗。研究毒死蜱和苯醚甲環(huán)唑聯(lián)合暴露0、12、24、36和48 h后對GC-1細(xì)胞活力的影響，結(jié)果表明，與對照組相比，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞活力受到抑制，而且細(xì)胞活力有良好的時間-劑量對應(yīng)關(guān)系。

在正常生理條件下，生物體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除始終處于相對平衡的狀態(tài)，但當(dāng)農(nóng)藥等外源物質(zhì)在體內(nèi)積累到一定程度時，會產(chǎn)生大量ROS。這些有害物質(zhì)的產(chǎn)生會導(dǎo)致抗氧化防御的改變，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激[21]?？寡趸烙鶛C(jī)制能夠清除多余ROS并且預(yù)防組織因氧化應(yīng)激產(chǎn)生的損傷，產(chǎn)生抗氧化酶(SOD、CAT等)和非酶類抗氧化物質(zhì)(GSH等)。其中，抗氧化酶通過清除過量ROS來保證自由基的正常代謝，使其恢復(fù)動態(tài)平衡[22]。在生物體內(nèi)，ROS處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)，在細(xì)胞增殖和存活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用，其也被認(rèn)為是一種重要的凋亡信號，對農(nóng)藥的毒性研究具有重要意義[23]。大量研究數(shù)據(jù)表明，氧化應(yīng)激可以由化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)，并在生殖毒性中發(fā)揮重要作用。例如，鄰苯二甲酸二乙己酯(DEHP)可顯著增加小鼠GC-1細(xì)胞中MDA含量，抑制GSH和SOD活性[24]。已有研究發(fā)現(xiàn)毒死蜱暴露會增加小鼠大腦中的氧化應(yīng)激，苯醚甲環(huán)唑誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2中ROS產(chǎn)生，并誘導(dǎo)其凋亡[25-26]。為了進(jìn)一步探討氧化應(yīng)激在毒死蜱和苯醚甲環(huán)唑聯(lián)合暴露誘導(dǎo)的GC-1細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制，我們研究了不同劑量毒死蜱、苯醚甲環(huán)唑單獨以及聯(lián)合暴露對GC-1細(xì)胞ROS生成和MDA水平的影響。結(jié)果表明，與對照組相比，所有處理組細(xì)胞中ROS和MDA含量都顯著增加，且毒死蜱和苯醚甲環(huán)唑的聯(lián)合暴露組中的ROS和MDA含量明顯高于單獨暴露組，表明ROS濃度增加，毒死蜱和苯醚甲環(huán)唑聯(lián)合暴露對GC-1細(xì)胞生存產(chǎn)生了不良影響。而通過對GC-1細(xì)胞的抗氧化能力檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，所有處理組細(xì)胞中SOD和GSH活性都降低，且聯(lián)合暴露組中的SOD和GSH活性明顯低于單獨暴露組，進(jìn)一步表明聯(lián)合暴露組的抗氧化應(yīng)激水平低于對照組和單獨暴露組。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS升高和SOD、GSH活性下降時，會進(jìn)一步加重細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激損傷，本研究結(jié)果表明，毒死蜱和苯醚甲環(huán)唑聯(lián)合暴露可明顯增加GC-1細(xì)胞ROS和MDA的生成，降低細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH活性，降低抗氧化能力，導(dǎo)致GC-1細(xì)胞氧化損傷，充分說明毒死蜱和苯醚甲環(huán)唑聯(lián)合暴露后顯著誘導(dǎo)GC-1細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激效應(yīng)，也從細(xì)胞水平說明了氧化應(yīng)激效應(yīng)可能是毒死蜱和苯醚甲環(huán)唑?qū)C-1細(xì)胞產(chǎn)生毒性的誘因。

線粒體作為精子細(xì)胞主要的供能細(xì)胞器，在維持細(xì)胞正常的生理活動中起重要作用，而線粒體膜電位下降會導(dǎo)致線粒體功能異常進(jìn)而影響精子細(xì)胞的活力，是精子細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期信號。Jiang等[27]的研究表明，毒死蜱暴露誘導(dǎo)豬卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激和線粒體功能損傷，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Wang等[28]研究報道苯醚甲環(huán)唑通過ROS相關(guān)的Caspase途徑誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞毒性和凋亡。本研究結(jié)果表明，與單獨暴露組相比，毒死蜱和苯醚甲環(huán)唑聯(lián)合暴露導(dǎo)致GC-1細(xì)胞線粒體膜電位顯著降低。同時檢測細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，與單獨暴露組相比，聯(lián)合暴露組細(xì)胞凋亡率明顯上升。細(xì)胞凋亡是一種主動的死亡過程，受外源性途徑和內(nèi)源性途徑控制，其中涉及線粒體的內(nèi)源性途徑是凋亡的重要途徑之一[29]。通過激活半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)導(dǎo)致線粒體膜通透性增加、染色質(zhì)凝聚和DNA斷裂，從而使細(xì)胞核固縮、碎裂并促進(jìn)凋亡小體的形成[30]。Bcl-2蛋白家族與線粒體凋亡途徑密切相關(guān)，根據(jù)Bcl-2蛋白家族在細(xì)胞凋亡過程中的作用不同，其可以分為2種類型，一種是促凋亡蛋白，如Bax，另一種是抗凋亡蛋白，如Bcl-2[31]。有研究表明通過增加Bax/Bcl-2的比值來提高Caspase3的活性從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[32]。GC-1細(xì)胞暴露于濃度為200 mg·mL-1的鎳納米粒子后Bax和Caspase3表達(dá)增強[33]。在本研究中，與對照組相比，毒死蜱和苯醚甲環(huán)唑聯(lián)合暴露后，GC-1細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax以及相應(yīng)的效應(yīng)蛋白如Cleaved PARP、Cleaved Caspase3的表達(dá)升高。

綜上所述，毒死蜱、苯醚甲環(huán)唑單獨和聯(lián)合暴露均能降低GC-1細(xì)胞活力，并誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激，降低細(xì)胞的抗氧化能力，降低線粒體膜電位，提高GC-1細(xì)胞凋亡率，且升高細(xì)胞內(nèi)Cleaved PARP、Cleaved Caspase3和Bax等蛋白的表達(dá)水平從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且相比于單獨暴露，2種農(nóng)藥聯(lián)合暴露對GC-1細(xì)胞的毒性效應(yīng)更強。但是農(nóng)藥聯(lián)合暴露誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制復(fù)雜，需要進(jìn)一步通過基因測序和動物實驗探究其農(nóng)藥效應(yīng)靶點、凋亡調(diào)控通路，為評估農(nóng)藥聯(lián)合毒性機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。