隆玉蘭， 謝松樺 ， 謝 泉， 張 偉， 王偉康， 張建軍， 萬志敏， 李拓凡， 邵紅霞， 秦愛建， 葉建強(qiáng)*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇省動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.揚(yáng)州大學(xué) 農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院，江蘇 揚(yáng)州 225009；4.教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009；5.國藥集團(tuán)揚(yáng)州威克生物工程有限公司，江蘇 揚(yáng)州 225127)

禽腺病毒(Fowl Adenovirus, FAdV)在病毒分類中為腺病毒科禽腺病毒屬，為無囊膜的雙鏈DNA病毒。根據(jù)限制性內(nèi)切酶消化活性可分為5個基因型(A～E)，根據(jù)血清交叉中和反應(yīng)性可進(jìn)一步分為12個血清型(1～7、8a、8b、9～11)[1-2]。FAdV-Ⅰ呈世界性分布，在臨床上引發(fā)的病癥主要包括包涵體肝炎(Inclusion body hepatitis，IBH)、肝炎-心包積液綜合征(Hepatitis-hydropericardium syndrome，HPS)以及肌胃糜爛(Gizzard erosion，GE)等。其中，引起肝炎-心包積液綜合征的主要病原體是由屬于基因C型的血清4型禽腺病毒(FAdV-4)。肝炎-心包積液綜合征最先于1987年在巴基斯坦報(bào)道，隨后蔓延到日本、韓國等亞洲國家[3-6]。FAdV-4引起的肝炎-心包積液綜合征在2013年前病例報(bào)道較少，自2015年6月起在我國山東、安徽、河南等家禽密集養(yǎng)殖地區(qū)大范圍爆發(fā)，雞群死亡率可達(dá)20%～80%，給國內(nèi)養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[7-10]。目前國內(nèi)缺乏商品化的針對FAdV-4抗體檢測的特異性診斷技術(shù)。Fiber蛋白位于病毒粒子的表面，不僅含禽腺病毒重要抗原表位決定簇，且在結(jié)合宿主細(xì)胞天然受體、刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體方面具有重要作用[11]。因此，本研究擬以FAdV-4的兩個纖突蛋白Fiber-1及Fiber-2為靶點(diǎn)，利用桿狀病毒表達(dá)平臺和蛋白純化技術(shù)大量表達(dá)純化Fiber-1及Fiber-2蛋白的基礎(chǔ)上，創(chuàng)制高效特異的檢測FAdV-4抗體的間接ELISA技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞及抗體 質(zhì)粒pcDNA3.1-Fiber-1及pcDNA3.1-Fiber-2，感受態(tài)細(xì)胞EscherichacoliDH5α及E.coliDH10Bac，Sf9昆蟲細(xì)胞，LMH細(xì)胞及pFastBacHT A載體均由揚(yáng)州大學(xué)江蘇省動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；抗Ⅰ群FAdV標(biāo)準(zhǔn)雞陽性血清由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所李俊平研究員惠贈；抗NDV、EDS、H9N2、ALV-J、CAV、IBV雞陽性血清及SPF雞血清、抗Fiber-1及Fiber-2蛋白的單克隆抗體均由揚(yáng)州大學(xué)江蘇省動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備保存[12-13]。

1.1.2 主要試劑與儀器設(shè)備 羊抗鼠FITC購自KPL公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG和兔抗雞IgG購自Jackson ImmunoResearch；Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶、Gene 1 kb Super Marker、2×TaqMaster Mix以及Exnase TMII連接酶購自南京諾唯贊公司；LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑、Sf-900 II培養(yǎng)基購自Gibco公司；His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(His-tag Protein Purification Kit)購自碧云天公司；FAdV抗體檢測試劑盒購自荷蘭Biochek公司。IX2-SLP倒置熒光顯微鏡購自NIKON公司；BB-50二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 重組穿梭載體和桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 以真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Fiber-1及pcDNA3.1-Fiber-2為模板，將Fiber-1及Fiber-2基因通過一步克隆法克隆至pFastBacHT A載體中，構(gòu)建pFast-Fiber-1及pFast-Fiber-2重組穿梭載體并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，隨后涂布抗性平板篩選陽性菌落，搖菌提取質(zhì)粒后經(jīng)蘇州金唯智生物科技有限公司測序。經(jīng)測序正確的重組穿梭載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)座E.coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，涂布含50 μg/mL卡那霉素、7 μg/mL 慶大霉素、10 μg/mL四環(huán)素的LA-Bac平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽性白色菌落搖菌提取質(zhì)粒，測序鑒定。測序準(zhǔn)確的含F(xiàn)iber-1及Fiber-2的重組桿狀病毒質(zhì)粒分別命名為rBacmid-Fiber-1和rBacmid-Fiber-2。

1.2.2 重組蛋白的表達(dá)與鑒定 利用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑將rBacmid-Fiber-1及rBacmid-Fiber-2重組桿狀病毒質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，27 ℃培養(yǎng)4 d后分別收獲培養(yǎng)液進(jìn)行傳代，連續(xù)傳代3次后收獲重組桿狀病毒rBv-Fiber-1及rBv-Fiber-2。以適量的病毒上清接種6孔板中的Sf9細(xì)胞，27 ℃培養(yǎng)4 d后固定細(xì)胞，以抗Fiber-1、Fiber-2單克隆抗體為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行間接免疫熒光(IFA)鑒定。

1.2.3 重組蛋白的純化與鑒定 以適量的rBv-Fiber-1及rBv-Fiber-2病毒上清接種T75細(xì)胞瓶中Sf9細(xì)胞，27 ℃培養(yǎng)4 d，5 000 r/min離心5 min后收集細(xì)胞沉淀，利用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行細(xì)胞裂解和蛋白純化。為得到純度高、產(chǎn)量大的目的蛋白，分別對裂解液與細(xì)胞沉淀的比例、裂解液與Ni親和介質(zhì)的比例、蛋白結(jié)合時(shí)間、洗脫Buffer的pH及咪唑濃度等進(jìn)行條件優(yōu)化，并通過SDS-PAGE檢測純化效果。為了檢驗(yàn)純化產(chǎn)物的免疫原性，分別以抗FAdV-4陽性雞血清及商品化Anti-His tag單抗為一抗，HRP標(biāo)記的兔抗雞IgG及羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行Western blot鑒定。

1.2.4 間接ELISA方法的建立 采用方陣滴定法，優(yōu)化包被蛋白濃度(8、4、2、1 μg/mL)、一抗血清稀釋度(1∶800、1∶400、1∶200、1∶100)、一抗作用時(shí)間(120、90、60、30 min)、二抗HRP標(biāo)記兔抗雞IgG稀釋度(1∶100 000、1∶50 000、1∶25 000、1∶12 500)、二抗作用時(shí)間(120、90、60、30 min)。包被液、封閉液、樣品稀釋液和酶稀釋液為揚(yáng)州大學(xué)江蘇省動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)配套試劑，其余條件參照常規(guī)試劑盒反應(yīng)條件。通過計(jì)算S/P值判定ELISA檢測結(jié)果，公式為S/P=(樣品OD450值-陰性對照OD450平均值)/(陽性對照OD450平均值-陰性對照OD450平均值)。

1.2.6 間接ELISA方法的特異性檢測 分別取抗FAdV-1、FAdV-2、FAdV-3、FAdV-4、FAdV-5、FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-9和FAdV-11陽性雞血清及抗NDV、EDS、H9N2、ALV-J、CAV和IBV陽性雞血清同步進(jìn)行ELISA檢測，從而評價(jià)該方法對FAdV-4的特異性。

1.2.7 間接ELISA方法的靈敏度檢測 取4份抗FAdV-4陽性雞血清進(jìn)行倍比稀釋(1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600)后按優(yōu)化好的方法進(jìn)行ELISA檢測。同時(shí)，以感染FAdV-4的LMH細(xì)胞為抗原的IFA法作為對照試驗(yàn)，同樣檢測上述不同稀釋度的血清。對比兩者的檢測結(jié)果，從而評價(jià)該方法的靈敏度。

1.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 選擇陽性和陰性血清各4份，每份血清4個重復(fù)，分別以同一批次不同時(shí)間、不同批次同一時(shí)間包被的酶標(biāo)板檢測，評價(jià)ELISA方法的批內(nèi)重復(fù)性及批間重復(fù)性。

1.2.9 符合率試驗(yàn) 選取FAdV-4感染雞血清，F(xiàn)AdV-4滅活疫苗免疫血清及SPF雞血清各20份進(jìn)行ELISA檢測，以Biochek FAdV商品化試劑盒同時(shí)與上述血清反應(yīng)，評價(jià)所建ELISA方法檢測FAdV-4抗體結(jié)果的可靠性。

1.2.10 感染雞群抗體水平變化檢測 為探究機(jī)體感染FAdV-4后的血清Fiber抗體水平變化及其與中和抗體的關(guān)系，以建立的ELISA以及病毒中和試驗(yàn)分別對低劑量感染FAdV-4的雞在不同時(shí)間段(感染后0、7、14、21、28 d，n=5)采集的血清進(jìn)行檢測，數(shù)據(jù)以Graphpad Prism 9.0繪制折線圖。中和試驗(yàn)步驟參考Wang等[12]進(jìn)行，當(dāng)中和抗體滴度Log2≥3，視為陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組桿狀病毒表達(dá)體系獲得

分別將pcDNA3.1-Fiber-1及pcDNA3.1-Fiber-2質(zhì)粒中攜帶的Fiber-1及Fiber-2基因通過一步克隆法分別克隆至pFastBacHT A載體中。重組載體經(jīng)PCR鑒定表明，成功在載體相應(yīng)位點(diǎn)分別插入大小為1 296 bp的Fiber-1基因和大小為1 440 bp的Fiber-2基因(圖1)。測序結(jié)果進(jìn)一步表明插入序列無突變無缺失，證明獲得了正確的pFast-Fiber-1及pFast-Fiber-2重組穿梭載體質(zhì)粒。重組穿梭載體質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)座、抗性平皿篩選、搖菌提取得到重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒rBacmid-Fiber-1及rBacmid-Fiber-2，經(jīng)PCR(M13通用引物)鑒定出現(xiàn)符合預(yù)期的約4 000 bp大小條帶(圖2)，而空載體桿粒的PCR產(chǎn)物大小僅為2 500 bp。測序結(jié)果進(jìn)一步表明插入序列無突變和缺失。以上結(jié)果表明本研究成功構(gòu)建了分別攜帶FAdV-4的Fiber-1及Fiber-2基因的兩個重組桿粒rBacmid-Fiber-1及rBacmid-Fiber-2。

圖1 PCR鑒定重組載體中Fiber基因Fig.1 PCR identification of Fiber genes in recombinant plasmidM：Super DNA Marker；1：Fiber-1；2：Fiber-2M:Super DNA Marker;1: Fiber-1;2: Fiber-2

2.2 重組蛋白在桿狀病毒中表達(dá)

將構(gòu)建正確的重組桿粒分別轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后，獲得重組桿狀病毒rBv-Fiber-1及rBv-Fiber-2，分別接種Sf9細(xì)胞后經(jīng)IFA檢測。結(jié)果顯示，rBv-Fiber-1及rBv-Fiber-2感染的Sf9細(xì)胞可與抗Fiber-1及Fiber-2單抗進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)FITC標(biāo)記二抗染色后熒光顯微鏡下可激發(fā)特異性亮綠色熒光；而野生桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞和正常Sf9細(xì)胞對照則均不激發(fā)熒光(圖3)。結(jié)果證明Fiber-1、Fiber-2蛋白在Sf9細(xì)胞中得到了正確表達(dá)。

圖2 重組桿粒的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of recombinant bacmidM: Super DNA Marker；1：陰性對照；2：rBacmid-Fiber-1；3：rBacmid-Fiber-2M:Super DNA Marker; 1:Negative control;2:rBacmid-Fiber-1;3:rBacmid-Fiber-2

圖3 IFA鑒定重組桿狀病毒中Fiber蛋白的表達(dá)Fig.3 IFA analysis of Fiber protein expressed by recombinant baculovirus

2.3 重組Fiber蛋白的純化與鑒定

為獲得純化的蛋白，重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞4 d后收獲細(xì)胞，充分裂解后10 000r/min離心10 min取上清，經(jīng)Ni介質(zhì)親和純化。經(jīng)過摸索，得到純化的最佳條件：裂解液與細(xì)胞沉淀的比例為6 mL裂解液對應(yīng)含10 mL培養(yǎng)基的T75細(xì)胞大方瓶中的細(xì)胞沉淀；裂解液與Ni親和介質(zhì)的比例為10∶1；蛋白結(jié)合時(shí)間為3 h(適用于Fiber-1蛋白)或12 h(適用于Fiber-2蛋白)；洗脫Buffer的pH及咪唑濃度分別為7.4及300 mmol/L。按照優(yōu)化好的條件進(jìn)行蛋白純化，并對純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE檢測和Western blot鑒定。SDS-PAGE結(jié)果表明，純化的Fiber-1和Fiber-2蛋白大小分別約為55 kDa和70 kDa(圖4A、圖5A)，與預(yù)期分子量相符。Western blot 結(jié)果表明，目的條帶可分別在55 kDa和70 kDa處被相應(yīng)的抗FAdV-4陽性雞血清及抗His單克隆抗體識別(圖4B、圖5B)。以上結(jié)果表明獲得了純化的Fiber-1及Fiber-2蛋白, 為構(gòu)建抗體檢測技術(shù)提供了良好抗原。

圖4 純化的Fiber-1蛋白的SDS-PAGE分析(A)和Western blot鑒定(B)Fig.4 SDS-PAGE (A) and Western blot (B) analysis of purified Fiber-1 proteinM：蛋白Marker；1：純化后Fiber-1蛋白M: Protein Marker;1: Purified Fiber-1 protein

圖5 純化的Fiber-2蛋白的SDS-PAGE分析(A)和Western blot鑒定(B) Fig.5 SDS-PAGE (A) and Western blot (B) analysis of purified Fiber-2 proteinM：蛋白Marker；1：純化后Fiber-2蛋白M: Protein Marker; 1: Purified Fiber-2 protein

2.4 間接ELISA方法的建立

將以上純化的Fiber-1及Fiber-2蛋白分別作為包被用抗原，建立了檢測Fiber-1及Fiber-2抗體的Fiber-1_ELISA以及 Fiber-2_ELISA。經(jīng)方陣滴定法，依據(jù)陰陽性血清OD450比值，同時(shí)考慮實(shí)際操作時(shí)間、經(jīng)濟(jì)成本和可操作性確定了ELISA最終反應(yīng)條件：抗原包被量均為0.2 μg/孔，一抗(血清)稀釋度為1∶400， 37 ℃孵育 1 h，HRP酶標(biāo)二抗稀釋度為1∶50 000， 37 ℃孵育 1 h，顯色10 min。根據(jù)80份陰性血清的S/P值確定Fiber-1_ELISA的Cut-off值為0.085 1，F(xiàn)iber-2_ELISA的Cut-off值為0.067 2。考慮到操作誤差，在確保檢測結(jié)果的前提下，確定血清的S/P值大于0.1判定為陽性，小于或等于0.1判為陰性。

2.5 間接ELISA具有良好的FAdV-4特異性及敏感性

特異性檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究建立的Fiber-1_ELISA以及 Fiber-2_ELISA均只能夠檢測出抗FAdV-4的陽性血清，而與所檢測的FAdV-1、FAdV-2、FAdV-3、FAdV-5、FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-9以及FAdV-11陽性雞血清及抗NDV、EDS、H9-AIV、ALV-J、CAV和IBV陽性雞血清均不反應(yīng)(圖6、圖7)。與IFA方法進(jìn)行的靈敏度比較檢測表明，本研究建立ELISA方法對同一份檢測血清的陽性稀釋度為IFA檢測血清陽性稀釋度的4～16倍(表1)。以上結(jié)果表明，本研究建立的Fiber-1_ELISA以及 Fiber-2_ELISA具有良好的FAdV-4特異性，且具有比IFA更高靈敏度。

圖6 Fiber-1_ELISA特異性試驗(yàn)Fig.6 Specificity test of Fiber-1_ELISA

圖7 Fiber-2_ELISA特異性試驗(yàn)Fig.7 Specificity test of Fiber-2_ELISA

表1 Fiber-1_ELISA以及 Fiber-2_ELISA靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 間接ELISA具有良好的重復(fù)性及穩(wěn)定性

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，F(xiàn)iber-1_ELISA及Fiber-2_ELISA在同一批次包被的三塊酶標(biāo)板中進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)，批內(nèi)變異系數(shù)分別為3.97%～9.71%和2.33%～8.70%；在三個不同批次包被的酶標(biāo)板中進(jìn)行批間重復(fù)試驗(yàn)，批間變異系數(shù)分別為2.12%～8.93%和2.70%～8.70%，均小于10%(表2、表3)，表明所建立的ELISA方法結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好。

表2 Fiber-1_ELISA的重復(fù)性試驗(yàn)

2.7 間接ELISA與其他檢測方法比較

利用本研究建立的Fiber-1_ELISA、Fiber-2_ELISA方法與荷蘭Biochek FAdV抗體檢測試劑盒對20份FAdV-4感染雞群血清，20份FAdV-4滅活疫苗免疫血清及20份SPF雞血清同步進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，本研究建立的Fiber-1_ELISA、Fiber-2_ELISA方法與荷蘭Biochek FAdV抗體檢測試劑盒檢測結(jié)果一致，即對感染或免疫血清均檢出陽性而SPF血清均為陰性，符合率為100%(圖8)。為比較感染FAdV-4后，雞體產(chǎn)生的抗Fiber抗體與中和抗體的關(guān)系，對感染FAdV-4的雞在不同時(shí)間段采集的雞血清進(jìn)行了比較檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)iber-1、Fiber-2抗體以及中和抗體在FAdV-4感染后7 d即被檢測到，隨后一直上升至21 d時(shí)達(dá)到頂峰，并在28 d后均開始下降(圖9A、9B)。感染雞體內(nèi)Fiber抗體水平和中和抗體水平呈現(xiàn)一致的變化規(guī)律，說明兩者具有很強(qiáng)的相關(guān)性。以上結(jié)果表明所建立的Fiber-1_ELISA及Fiber-2_ELISA方法可靠性高，可用于FAdV-4的感染預(yù)警診斷及免疫水平評價(jià)。

表3 Fiber-2_ELISA的重復(fù)性試驗(yàn)

圖8 Fiber-1_ELISA、Fiber-2_ELISA以及Biochek_ELISA檢測不同雞群血清Fig.8 Detection of serum form different flocks by Fiber-1 ELISA, Fiber-2 ELISA and Biochek_ELISA

圖9 Fiber_1 ELISA、Fiber_2 ELISA(A)以及中和試驗(yàn)(B)檢測感染雞群抗體水平變化Fig.9 Detection of serum from infected chicken flocks in different dpiby Fiber_1 ELISA, Fiber_2 ELISA (A) and Neutralization test (B)

3 討 論

近年來，禽腺病毒的爆發(fā)嚴(yán)重危害家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。在腺病毒感染致病過程中，腺病毒基因組編碼的主要表面結(jié)構(gòu)蛋白六鄰體，五鄰體以及纖突蛋白均發(fā)揮極其重要的作用。其中纖突蛋白不僅含腺病毒中和性表位、血清型特異性抗原決定簇，并且在決定病毒組織嗜性、介導(dǎo)腺病毒感染與致病中也具有重大意義[11]。在禽腺病毒12個血清型中，近年來暴發(fā)的FAdV-4的致病性最強(qiáng)、危害性最大，是我國優(yōu)勢流行血清型禽腺病毒。值得注意的是，與大部分哺乳動物屬腺病毒僅有一種纖突蛋白不同，禽腺病毒FAdV-1、FAdV-4以及FAdV-10具有非常獨(dú)特的抗原模式，即具有兩種纖突蛋白(Fiber-1與Fiber-2)。目前，研究發(fā)現(xiàn)FAdV-4的Fiber-1通過頭部和桿部介導(dǎo)病毒的感染入侵[12-13]，并且可有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體；而Fiber-2則主要影響FAdV-4的復(fù)制和致病性[16-17]，這些結(jié)果提示Fiber-1和Fiber-2是監(jiān)測FAdV-4感染及其免疫狀態(tài)極其重要靶點(diǎn)。

目前，中國尚無獲批的FAdV-4特異性血清學(xué)檢測技術(shù)，而荷蘭Biochek公司生產(chǎn)的FAdV商品化ELISA試劑盒不僅價(jià)格高昂，且是以FAdV-1(CELO)全滅活病毒作為抗原包被，在評估FAdV-4疫苗產(chǎn)生的抗體水平中難免造成誤差。Pan等[18]及羅思思等[19]分別以FAdV-4滅活病毒及純化的Penton重組原核蛋白作為包被抗原，建立了針對Ⅰ群多種血清型FAdV的兩種不同間接ELISA方法，但均不具有FAdV-4特異性。He等[20]以純化的原核Fiber-2蛋白建立的ELISA方法則兼具良好的FAdV-4特異性和檢出效果。昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢在于更強(qiáng)的翻譯后修飾能力，如保留蛋白的天然糖基化修飾等，F(xiàn)eichtner等[21]在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)了加FAdV-4非致病性毒株KR5的纖突蛋白并應(yīng)用于ELISA抗體檢測，取得良好效果。然而我國流行的高致病性FAdV-4纖突蛋白在氨基酸水平上與國外毒株相比有相當(dāng)程度的差異，目前國內(nèi)采用的FAdV-4滅活候選疫苗也大多以流行株制備而得。因此，本研究擬通過靶向纖突蛋白，利用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)，建立特異性針對于當(dāng)下國內(nèi)流行的FAdV-4的纖突蛋白抗體的ELISA檢測方法。

本研究首先靶向Fiber-1和Fiber-2蛋白進(jìn)行桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)，通過優(yōu)化純化條件得到了大量的、純度高的纖突蛋白作為包被抗原，并對基于纖突蛋白ELISA方法的特異性、重復(fù)性、靈敏度等各種檢測性能進(jìn)行了評估。特異性試驗(yàn)顯示ELISA方法僅特異針對FAdV-4，而不與Ⅰ群其他血清型禽腺病毒及其他禽源病毒陽性血清反應(yīng)。兩種ELISA批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于10%，表明本方法穩(wěn)定性強(qiáng)、結(jié)果可靠。血清對比檢測進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，ELISA方法與商品化BioChek ELISA檢測效果一致，表明本方法可有效檢出免疫或感染雞群中抗FAdV-4抗體。此外，本研究發(fā)現(xiàn)臨床雞血清中Fiber抗體水平與中和抗體水平呈現(xiàn)一致的變化規(guī)律和良好的相關(guān)性，表明本方法可有效評估針對FAdV-4的中和抗體水平。值得注意的是，市面上的FAdV-4疫苗主要為滅活疫苗和Fiber-2亞單位疫苗，評估疫苗效果時(shí)可根據(jù)實(shí)際需要選擇Fiber-1_ELISA或Fiber-2_ELISA進(jìn)行針對性檢測，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，本研究所構(gòu)建的FAdV-4特異性間接ELISA方法不僅較進(jìn)口試劑盒成本低廉，且具有良好的檢測效果，可廣泛應(yīng)用于FAdV-4的感染預(yù)警診斷及免疫水平評價(jià)，為持續(xù)監(jiān)測雞群中FAdV-4的感染狀況、以及檢測FAdV-4中國流行株制備的疫苗免疫后的抗體水平提供有力的工具。