羅焱鵬 李夢(mèng)雅 王之盛 萬(wàn)發(fā)春 薛 白 王立志 閆向民 彭全輝*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，牛低碳養(yǎng)殖與安全生產(chǎn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都611130；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，濟(jì)南250100；3.新疆畜牧科學(xué)院，烏魯木齊830000)

初乳作為新生犢牛的第一營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，對(duì)犢牛的生長(zhǎng)發(fā)育及機(jī)體免疫功能的建立起著關(guān)鍵作用[1]，且富含多種免疫物質(zhì)和非特異性抗菌物質(zhì)，對(duì)于新生犢牛被動(dòng)免疫十分重要[2]，飼喂初乳可促進(jìn)犢牛胃腸道發(fā)育和生長(zhǎng)[3]。我國(guó)牧區(qū)肉牛養(yǎng)殖多采用放牧或放牧加補(bǔ)飼模式，犢牛隨母哺乳，自然斷奶。在四川藏區(qū)，牦牛多為春季產(chǎn)犢，母牦牛因冬季飼草短缺造成營(yíng)養(yǎng)攝入不足，春季所產(chǎn)犢牛大多瘦弱。牧區(qū)牦牛飼養(yǎng)管理仍較為落后，加之“人畜爭(zhēng)奶”現(xiàn)象頻發(fā)，新生犢牛多未能采食足量的初乳，極易導(dǎo)致?tīng)倥I(yíng)養(yǎng)攝入不足，機(jī)體免疫能力差。犢牛未能采食足量的母乳，生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足，易導(dǎo)致?tīng)倥３霈F(xiàn)發(fā)育遲緩[4]。

犢牛代乳粉作為母乳的替代產(chǎn)品可為早期斷奶犢牛提供主要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。王美美等[5]研究表明，荷斯坦?fàn)倥ｏ曃购?3%粗脂肪和22%粗蛋白質(zhì)的代乳粉對(duì)其干物質(zhì)、粗脂肪和粗蛋白質(zhì)的消化有促進(jìn)作用，有利于犢牛免疫力和抵抗力的提高。鮑宇紅等[6]研究發(fā)現(xiàn)，與母帶犢牛相比，飼喂代乳粉可提高早期斷奶犢牦牛生長(zhǎng)性能，飼喂含26%粗蛋白質(zhì)的代乳粉更有利于提高犢牦牛機(jī)體免疫力和抗氧化能力。但是母帶犢牛與飼喂代乳粉的離母犢牛在心理、營(yíng)養(yǎng)攝入等方面均有較大差異，其機(jī)體代謝差異如何目前未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-QTOF/MS)的代謝組學(xué)方法對(duì)母帶犢牛和飼喂代乳粉的離母犢牛血清進(jìn)行檢測(cè)分析，比較母帶犢牛和離母犢牛的血清代謝物和代謝途徑差異，為犢牛早期斷奶提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為犢牛代乳粉的開(kāi)發(fā)提供方向。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2 飼養(yǎng)管理

母帶犢牛組的犢牛出生后立即擦干被毛并對(duì)臍帶消毒，隨后進(jìn)行稱(chēng)重，1.0～1.5 h內(nèi)根據(jù)其體重灌服初乳3～4 L，然后跟隨母牛哺乳，10 d后自由采食飼糧。

離母犢牛組的犢牛出生后飼喂代乳粉，代乳粉按照1∶8的比例用50 ℃左右溫開(kāi)水溶解并攪拌均勻，待溫度冷卻到37 ℃左右，分別于07:00和18:00采用奶瓶飼喂，奶瓶在每次飼喂結(jié)束后清洗并消毒。代乳粉的日飼喂量為體重的3%，并隨著體重的增長(zhǎng)每半個(gè)月進(jìn)行1次調(diào)整。10 d后自由采食與母帶犢牛相同的飼糧。

1.3 代乳粉

代乳粉主要成分為脫脂奶粉、乳清粉、玉米蛋白粉等，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1[7]。

表1 代乳粉組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 血清樣品采集及代謝組學(xué)測(cè)定

試驗(yàn)第90天晨飼前，使用真空采血管在每頭牛頸靜脈采血10 mL，4 000×g離心10 min制備血清，隨后立即保存于-80 ℃冰箱，直到進(jìn)行代謝組學(xué)測(cè)定。

取100 μL解凍后的血清樣品于EP管中，加入400 μL混有內(nèi)標(biāo)的提取溶劑(乙腈∶水=1∶1，內(nèi)標(biāo)濃度2 μg/mL)，旋渦混勻30 s；轉(zhuǎn)移至冰水中超聲5 min；-20 ℃靜置1 h；4 ℃條件下，將樣品以12 000 r/min離心15 min；將上清(425 μL)轉(zhuǎn)移至EP管中，置于真空濃縮器中進(jìn)行干燥(無(wú)需進(jìn)行加熱)，加入100 μL提取溶劑將干燥后的提取物再次溶解；旋渦30 s將其混合均勻，隨后經(jīng)水浴超聲處理10 min；4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min；將60 μL上清轉(zhuǎn)移至2 mL進(jìn)樣瓶中，各樣品均取10 μL充分混勻作為質(zhì)控樣本，另取60 μL進(jìn)行檢測(cè)。使用UPLC-QTOF/MS技術(shù)進(jìn)行分析。

色譜條件：樣品使用UPLC BEH Amide色譜柱(1.7 μm×2.1 μm×100 mm，Waters，美國(guó))進(jìn)行分離，進(jìn)樣量為1.5 μL。液相色譜流動(dòng)相條件見(jiàn)表2。

表2 液相色譜流動(dòng)相條件

質(zhì)譜條件：使用AB 6600 Triple TOF(AB Sciex，美國(guó))質(zhì)譜儀并根據(jù)其IDA功能作一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。在每個(gè)數(shù)據(jù)采集循環(huán)中，篩選出符合要求的分子離子(離子強(qiáng)度最強(qiáng)且大于100)進(jìn)行采集對(duì)應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。轟擊能量：30 eV，15張二級(jí)譜圖每50 ms。電噴霧離子源(ESI)參數(shù)：霧化氣壓為60 psi，輔助氣壓為60 psi，氣簾氣壓為35 psi，溫度為650 ℃，噴霧電壓為5 000 V(正離子模式)或-4 000 V(負(fù)離子模式)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

質(zhì)譜分析后得到的原始數(shù)據(jù)文件通過(guò)Proteo Wizard軟件轉(zhuǎn)換為mzXML格式，隨后使用基于R語(yǔ)言設(shè)計(jì)的程序包XCMS 3.2進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)預(yù)處理結(jié)果到的了一個(gè)數(shù)據(jù)矩陣，其中包括質(zhì)量電荷比(m/z)值、保留時(shí)間(RT)以及峰值強(qiáng)度。數(shù)據(jù)處理結(jié)束后，根據(jù)R包CAMERA對(duì)峰值進(jìn)行標(biāo)注，隨后采用自建MS2數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行血清代謝物鑒定。

對(duì)得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾用以剔除噪聲數(shù)據(jù)，作歸一化處理。然后進(jìn)行主成分分析(PCA)，使用R包ROPLS進(jìn)行正交二乘法-判別分析(OPLS-DA)。根據(jù)OPLS-DA獲得變量重要性投影(VIP)，再結(jié)合t檢驗(yàn)P值與代謝物的差異倍數(shù)(FC)篩選出離母犢牛組和母帶犢牛組之間差異代謝物，篩選標(biāo)準(zhǔn)為FC<0.5或FC>1.5、VIP>1和P<0.01。隨后根據(jù)KEGG對(duì)篩選出的差異代謝物進(jìn)行功能與代謝途徑分析，使用MetaboAnalyst 5.0在線數(shù)據(jù)庫(kù)作聚類(lèi)分析，并作通路拓?fù)浞治鲇糜诜治霾町惔x物所富集的代謝通路。

2 結(jié) 果

2.1 主成分分析

2組主成分分析結(jié)果見(jiàn)圖1。血清樣本基本處于95%置信區(qū)間內(nèi)，樣本點(diǎn)分離清晰，2組之間能清楚的區(qū)分開(kāi)來(lái)，樣本間未出現(xiàn)相互重疊。

2.2 OPLS-DA得分圖及模型驗(yàn)證

由圖2可見(jiàn)，OPLS-DAS得分結(jié)果中，當(dāng)Q2和R2Y越接近于1時(shí)表明模型越穩(wěn)定可靠，可根據(jù)該模型進(jìn)行差異代謝物篩選。一般而言當(dāng)Q2>0.5時(shí)即可為判定該模型有效，當(dāng)Q2>0.9時(shí)可判定該模型預(yù)測(cè)能力優(yōu)異。本試驗(yàn)中，OPLS-DA模型得分對(duì)應(yīng)結(jié)果R2Y=0.996、Q2Y=0.998，表明模型穩(wěn)定性極好。

采用排列驗(yàn)證對(duì)OPLS-DA模型的有效性和預(yù)測(cè)能力進(jìn)行評(píng)估。紅藍(lán)橫線分別對(duì)應(yīng)為OPLS-DAS模型Q2和R2，紅點(diǎn)表示經(jīng)Y置換后模型的Q2′，藍(lán)點(diǎn)表示經(jīng)Y置換后模型的R2′。當(dāng)Q2′和R2′均小于原始模型的Q2和R2，即相應(yīng)的線都在其對(duì)應(yīng)點(diǎn)之上時(shí)，則表明模型預(yù)測(cè)能力可靠，可按照各血清化合物的VIP進(jìn)行差異代謝物的分析篩選。由以上結(jié)果可知，該模型可靠，可進(jìn)行差異代謝物的篩選。

M：母帶犢牛組 calves with dam group；C：離母犢牛組 calves without dam group。圖3同 the same as Fig.3.

2.3 差異代謝物的篩選

根據(jù)OPLS-DA獲得VIP，再結(jié)合t檢驗(yàn)P值與代謝物的FC篩選出離母犢牛組和母帶犢牛組之間差異代謝物。按照FC<0.5或FC>1.5、P<0.01和VIP>1的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異代謝物篩選，2組犢牛共篩選出30種差異代謝物。由表3可知，與離母犢牛組相比，母帶犢牛組血清中代謝物含量上調(diào)的主要有DL-3-苯乳酸、橙皮素、D-山梨糖醇等21種代謝物，下調(diào)的主要有戊二酸、二十一烷酸、二十酸等9種代謝物。

2.4 差異代謝物的層次聚類(lèi)及富集分析

通過(guò)對(duì)篩選出來(lái)的差異代謝物進(jìn)行層次聚類(lèi)分析，以熱圖的方式呈現(xiàn)，直觀的展現(xiàn)各差異代謝物在2組之間的差異。由圖3可見(jiàn)，分析結(jié)果表明，離母犢牛組與母帶犢牛組可明顯聚為2類(lèi)，組間差異明顯，組內(nèi)8個(gè)重復(fù)間無(wú)明顯差異，所篩選的差異代謝物合理。

圖2 OPLS-DA得分圖及模型排列驗(yàn)證圖

表3 母帶犢牛組和離母犢牛組之間差異代謝物

續(xù)表3項(xiàng)目Items變量投影重要度VIPP值 P-value差異倍數(shù) FC趨勢(shì) Trend胞壁酸 Muramic acid1.29<0.011.89↑根皮素 Phloretin1.55<0.011.89↑?；撬?Taurine1.40<0.011.83↑L-蘋(píng)果酸 L-malic acid1.46<0.011.81↑甲狀腺素 L-thyroxine1.37<0.011.80↑L-亮氨酸 L-leucine1.36<0.011.77↑L-色氨酸 L-tryptophan1.31<0.011.76↑嘌呤 Purine1.43<0.022.57↑L-谷氨酸 L-glutamate1.53<0.011.72↑L-焦谷氨酸 L-pyroglutamic acid1.55<0.011.79↑二氫胸腺嘧啶 Dihydrothymine1.38<0.012.70↑戊二酸 Glutaric acid1.32<0.010.35↓二十一烷酸 Heneicosanoic acid1.73<0.010.33↓二十酸 Arachidic acid1.52<0.010.31↓四氫嘧啶 Alloxan1.36<0.010.32↓甘氨酸 Glycine1.72<0.010.29↓磷酸肌酸 Phosphocreatine1.53<0.010.29↓醋酸氟氫可的松 Fludrocortisone acetate1.46<0.010.25↓羊毛甾醇 Lanosterol1.67<0.010.18↓硬脂酸 Stearic acid1.58<0.010.17↓

2.5 差異代謝物KEGG通路分析

使用Metabo Analyst 5.0在線分析數(shù)據(jù)庫(kù)以影響系數(shù)(Impact)和P值分析差異代謝物所富集相關(guān)代謝通路，結(jié)果見(jiàn)圖4。以Impact>0.1為篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相關(guān)代謝通路篩選，結(jié)果見(jiàn)表4。綜合富集分析的顯著性P值和通路影響系數(shù)(Impact>0.1)發(fā)現(xiàn)，與飼喂代乳粉的離母犢牛的血清代謝物的改變最為相關(guān)是D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝、牛磺酸和亞?；撬岽x、精氨酸和脯氨酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝以及谷胱甘肽代謝5條代謝通路。

3 討 論

本試驗(yàn)在母帶犢牛和離母犢牛血清中共篩選出了30種差異顯著的代謝物，其中離母犢牛血清中?；撬帷-谷氨酸和橙皮素等代謝物含量顯著低于母帶犢牛，血清中硬脂酸、二十酸和二十一烷酸等代謝物含量顯著高于母帶犢牛。血清差異代謝物主要對(duì)犢牛的抗菌、抗氧化能力和脂類(lèi)代謝產(chǎn)生影響。

3.1 離母犢?？咕芰θ跤谀笌倥?/h3>

本試驗(yàn)結(jié)果表明，離母犢牛血清中具有抑菌作用的物質(zhì)如DL-3-苯乳酸、月桂酸和L-蘋(píng)果酸的含量顯著低于母帶犢牛。DL-3-苯乳酸是由部分乳酸菌分泌產(chǎn)生的一種化合物，有著很強(qiáng)的抑菌作用，能夠有效抑制犢牛腹瀉和腸胃炎的致病菌如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和嗜水氣單胞菌[8]，以及產(chǎn)生霉菌毒素的真菌[9]。月桂酸及其衍生物對(duì)部分病原菌有良好的抑制效果，如革蘭氏陽(yáng)性菌和某些病毒及真菌。Skrivanová等[10]研究表明，月桂酸對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌有很強(qiáng)的抑制作用，該菌可導(dǎo)致?tīng)倥０l(fā)生氣性壞疽和病毒性腹瀉。月桂酸衍生物單月桂酸甘油單酯(GML)是母乳的常見(jiàn)成分，具有良好的抗菌活性，對(duì)易誘發(fā)機(jī)體炎癥、消化道疾病的金黃色葡萄球菌、鏈球菌以及幽門(mén)螺桿菌等常見(jiàn)病原菌有著很強(qiáng)的抑制作用[11]。L-蘋(píng)果酸對(duì)大腸桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌有很強(qiáng)的抑制作用[12]，二者是引起犢牛腹瀉的主要致病菌。與母帶犢牛相比，離母犢牛血清抑菌功能物質(zhì)的含量顯著降低，在一定程度上降低離母犢牛抵御病原菌的能力，增加了犢牛腹瀉及患其他疾病風(fēng)險(xiǎn)。

圖3 差異代謝物聚類(lèi)熱圖

圖4 差異代謝物富集圖

表4 通路富集

3.2 離母犢?？寡趸芰θ跤谀笌倥?/h3>

與母帶犢牛相比，離母犢牛血清中γ-谷氨酰半胱氨酸、L-谷氨酸含量顯著降低。差異代謝物通路分析結(jié)果顯示，谷胱甘肽代謝途徑受到影響。γ-谷氨酰半胱氨酸是合成谷胱甘肽的前體，可以通過(guò)繞過(guò)谷胱甘肽生物合成調(diào)節(jié)并提供限制底物，在氧化應(yīng)激條件下補(bǔ)充減少的谷胱甘肽[13]。谷胱甘肽是一種常見(jiàn)的抗氧化物，有助于機(jī)體清除有害氧自由基，緩解各種炎癥損傷[14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，離母犢牛血清中L-谷氨酸含量顯著低于母帶犢牛。谷氨酸作為谷胱甘肽合成的前體物質(zhì)，在清除氧化基和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[15]。谷氨酸衍生物谷氨酰胺能夠改善幼齡哺乳動(dòng)物的腸道生理功能[16]，增強(qiáng)免疫機(jī)能，提高機(jī)體抗氧化能力[17]。本試驗(yàn)室前期研究表明，90日齡時(shí)，離母犢牛血清中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性和總抗氧化能力(T-AOC)顯著低于母帶犢牛[18]，血清抗氧化指標(biāo)與代謝組學(xué)測(cè)定結(jié)果相一致。

此外，離母犢牛血清中牛磺酸、橙皮素和根皮素等一系列具有抗氧化功能物質(zhì)的含量顯著低于母帶犢牛。牛磺酸具有抗氧化功能，對(duì)腸道的氧化損傷有緩解作用[19]，并可抑制腸道炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腸道的正常發(fā)育和功能穩(wěn)定[20-21]。Barua等[22]研究發(fā)現(xiàn)，?；撬釋?duì)腸黏膜核因子-κB(NF-κB)的表達(dá)和活化有很強(qiáng)的抑制性，可抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，阻斷炎癥及其次級(jí)炎癥的發(fā)生。橙皮素具有抗炎、抗氧化和抗病毒等多種功能[23]，可調(diào)節(jié)脂代謝和抗氧化功能，并能夠很好的保護(hù)肝功能。根皮素是一種抗氧化物質(zhì)，能夠抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，并有效清除過(guò)氧亞硝酸鹽[24]。研究發(fā)現(xiàn)，根皮素可以通過(guò)抑制前列腺素E2(PGE2)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)以及晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)的形成從而緩解腸道炎癥[25]。離母犢牛遭遇早期斷奶和飼糧變化，易產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，機(jī)體內(nèi)自由基累積過(guò)多、氧化物過(guò)剩，致使機(jī)體發(fā)生氧化損傷[26]。氧化應(yīng)激是造成犢牛機(jī)體免疫功能失調(diào)及炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要因素[27]。離母犢?？寡趸芰^弱，也將增加犢牛對(duì)各種疾患的易感性。

3.3 離母犢牛脂肪代謝能力強(qiáng)于母帶犢牛

本試驗(yàn)中，離母犢牛血清中長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸含量顯著高于母帶犢牛，包括硬脂酸、二十酸和二十一烷酸，這可能是離母犢牛機(jī)體脂肪分解代謝能力較強(qiáng)，而合成代謝能力較弱的綜合結(jié)果。脂肪組織分解產(chǎn)生大量非酯化脂肪酸(NEFAs)，有研究表明，NEFAs可通過(guò)激活肝細(xì)胞腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號(hào)通路，促進(jìn)脂質(zhì)氧化，抑制脂類(lèi)合成[28]。Chatelain等[29]研究表明，肝細(xì)胞中長(zhǎng)鏈脂肪酸能夠促進(jìn)肝臟脂肪酸氧化的限速酶肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1α(CPT1α)的表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸氧化。另有研究表明，飽和脂肪酸(SFA)可能與動(dòng)物機(jī)體炎癥相關(guān)，SFA可激活Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)中的TLR2和TLR4及其下游信號(hào)，導(dǎo)致機(jī)體無(wú)菌炎癥[30]。離母犢牛血清中飽和脂肪酸含量的升高，可能是造成其機(jī)體炎癥反應(yīng)的一個(gè)潛在因素。離母犢牛血清中甲羥戊酸含量顯著低于母帶犢牛。甲羥戊酸是膽固醇和萜類(lèi)化合物合成的重要中間產(chǎn)物，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和膠原合成中起重要作用[31]。甲羥戊酸含量與膽固醇的合成呈正相關(guān)[32]。在動(dòng)物中，甲羥戊酸途徑產(chǎn)生異戊二烯類(lèi)物質(zhì)，包括膽固醇、多萜醇、血紅素A和泛醌，它們參與細(xì)胞膜生物合成、糖蛋白合成和電子傳遞[33]。因此，離母犢牛血清中長(zhǎng)鏈脂肪酸含量高于母帶犢牛，其健康狀況弱于母帶犢牛。

4 結(jié) 論

飼喂代乳粉的離母犢牛的抗菌、抗氧化能力弱于母帶犢牛，脂肪代謝分解能力強(qiáng)于母帶犢牛，脂肪合成代謝能力弱于母帶犢牛。