陳潔，溫素軍，梁鵬飛，李景峰，魏少萍，劉鑫，南麗麗

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅省草業(yè)工程實驗室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

紅豆草（Onobrychis viciaefolia）是豆科多年生草本植物，因其富含蛋白質(zhì)、氨基酸、粗脂肪和礦物質(zhì)，被譽為“牧草皇后”［1］，可用于青飼、青貯、放牧、曬制青干草、加工草粉、配合飼料和多種草產(chǎn)品，因莖葉含有單寧，可沉淀在瘤胃中形成大量泡沫性的可溶性蛋白質(zhì)，故反芻家畜在青飼、放牧?xí)r不易發(fā)生膨脹病。

我國干旱和半干旱地區(qū)的面積約占國土面積的52.5%［2］，干旱脅迫對農(nóng)作物造成的損失在所有非生物脅迫中占首位［3］。我國審定登記的紅豆草品種數(shù)量較少［4］，培育和應(yīng)用抗旱紅豆草品種能使干旱地區(qū)的紅豆草增產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)。紅豆草對病害［5］、干旱［6］、鹽漬［7］、霜凍［8］、低磷［9］等逆境均有較好耐受性，但不同品種之間抗性差異較大。當(dāng)出現(xiàn)干旱脅迫時，根系能最先感知土壤中的水分虧缺并做出相應(yīng)反應(yīng)［10］，其中根系形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理特性反映了植物抗旱的形態(tài)基礎(chǔ)和生理基礎(chǔ)［11-13］。為此，本試驗以5份紅豆草為試驗材料，利用PEG-6000模擬干旱環(huán)境，研究干旱脅迫對紅豆草根系生長及生理特性的影響，以期篩選出抗旱性較強的紅豆草材料以及與抗旱密切相關(guān)的指標(biāo)，為紅豆草抗旱育種提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

利用雜交選育的3個紅豆草品系，編號分別為P1，P2，P3［14］，對照為甘肅紅豆草（O.viciaefoliacv.Gansu，CK1）和蒙農(nóng)紅豆草（O.viciaefoliacv.Mengnong，CK2）。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用PEG-6000（聚乙二醇6000）模擬干旱條件。將500 g消毒后的細(xì)沙裝入塑料杯，經(jīng)H2O2溶液消毒后的供試紅豆草種子播種在塑料杯，每隔2 d澆灌50 mL Hoagland營養(yǎng)液；待幼苗生長至第42天，設(shè) 置6個 水 勢 梯 度：0（對 照，CK）、-0.4、-0.8、-1.2、-1.6和-2.0 MPa，并于處理7 d后采集紅豆草幼苗測定相關(guān)生理指標(biāo)，每個處理5次重復(fù)。

1.3 測定指標(biāo)與方法

采用烘干法分別測定每盆植株地下部分（根系）、地上部分（莖、葉）的干物質(zhì)量并計算根冠比（根干物質(zhì)量/地上部干物質(zhì)量）。將各處理的根系用蒸餾水沖洗干凈，采用臺式掃描儀對根系進行掃描并將圖像存入電腦，掃描儀的分辨率為300 dpi。采用Win-RHIZO根系分析系統(tǒng)軟件對根系圖像進行分析，獲得根系總長度（Root length，RL）、根系總表面積（Total root surface，TRS）、根系平均直徑（Average root diameter，ARD）、根 體 積（Root volume，RV）和 根 尖 數(shù)（Root tip number，RTN）等特征參數(shù)。

生理指標(biāo)測定參考鄒琦［15］的方法，其中根系活力采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法測定，可溶性糖（Soluble sugar，SS）含量采用蒽酮比色法測定，可溶性蛋白（Soluble protein，SP）含量采用考馬斯亮藍G-250染色法測定，丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定；葉片相對含水量（Relative water content，RWC）采用飽和稱重法測定；游離脯氨酸（Proline，Pro）含量采用酸性茚三酮比色法測定；超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性采用氮藍四唑光化還原法測定；過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測定。

1.4 統(tǒng)計分析

用Excel整理數(shù)據(jù)，SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行方差分析、聚類分析和主成分分析，不同處理之間用Duncan方法進行多重比較。應(yīng)用Fuzzy數(shù)學(xué)中隸屬度函數(shù)法進行綜合評判，與抗旱性呈正相關(guān)的參數(shù)如RWC、SS、Pro、SP、SOD、POD和根系活力計算公式為：

對與抗旱性呈負(fù)相關(guān)的MDA計算公式為：

式中：Fij為i品種j性狀測定的具體隸屬值；Xij為i品種j性狀測定值；Xjmin為j性狀中測定的最小值；Xjmax為j性狀中測定的最大值。

權(quán)重應(yīng)用客觀賦權(quán)法進行計算：

式中，Ij是一個無量綱數(shù)，表示某評價指標(biāo)在干旱脅迫下的測定值相對于對照組的比值。Cj為第j個指標(biāo)正常組的測定值，Sj為第j個指標(biāo)在某個脅迫處理下所測定的平均值。如果是負(fù)相關(guān)，計算式為：

最后通過歸一化，計算出每個評價指標(biāo)的權(quán)重：

綜合評價值：

2 結(jié)果與分析

2.1 紅豆草材料間根系形態(tài)特征的差異

供試紅豆草根冠比、根表面積和根尖數(shù)均隨水勢梯度的增加呈先增加后減小趨勢（P＜0.05），且在-0.8 MPa時達到最大值，與0 MPa相比，CK1的根冠比、CK2的根表面積及材料P2的根尖數(shù)增幅較大；除CK1的根冠比在0 Mpa時最小外，供試紅豆草的根冠比、根表面積和根尖數(shù)均在-2.0 MPa時最小。供試紅豆草根直徑和根體積隨脅迫程度加劇呈顯著下降趨勢（P＜0.05），在-2.0 MPa下，P1、P2、P3、CK1和CK2的根直徑和根體積均降至最小值。干旱脅迫顯著增加供試紅豆草根長（P＜0.05），且在-2.0 MPa時增至最大值（圖1）。

圖1 干旱脅迫下紅豆草的根系形態(tài)特征Fig.1 Effects of drought stress on root morphological characteristics of sainfoin

2.2 紅豆草材料間生理特性的差異

2.2.1RWC、SP、SS和Pro含量的變化由圖2可知，供試紅豆草RWC隨脅迫程度加劇呈不斷下降趨勢。-2.0 MPa處理下，其RWC降至最小值，且材料P1、P2的RWC顯著高于其他材料（P＜0.05）；除材料P2外，其余材料的SP含量均隨脅迫程度加劇先增加后下降。-2.0 MPa處理下，P2的SP含量增至最大值，其余材料均在-0.8 MPa處理下，SP含量增至最大值，而-2.0 Mpa處理下，SP含量均降至最低，且材料P1的SP含量顯著低于其他材料（P＜0.05）；除材料P2、CK2外，其余材料的SS含量均隨脅迫程度加劇先增加后下降。-2.0 MPa下，材料P2、CK2的SS含量增至最大值，分別為0 MPa的1.47、1.49倍（P＜0.05），其余材料均在-0.8 MPa下其SS含量增至最大，-2.0 MPa下其SS含量均降低，且CK1的SS含量顯著低于其他材料（P＜0.05）；供試紅豆草Pro含量均隨脅迫程度加劇先增加后下降。-1.6 MPa處理下，材料P2的Pro含量增至最高，增幅為226.21%（P＜0.05），其余材料均在-1.2 MPa處理下其Pro含量增至最大，-2.0 MPa處理下Pro含量均下降但均高于0 MPa。

圖2 干旱脅迫下對紅豆草葉片的相對含水量和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量Fig.2 Relative water content and contents of osmotic adjustment substances in sainfoin leaf under drought stress

2.2.2SOD和POD活性變化供試紅豆草SOD和POD活性均隨脅迫程度加劇先升高后降低（圖3）。-0.8 MPa脅迫下，供試紅豆草的SOD活性均增至最高，-2.0 MPa脅迫下其SOD活性均降至最低，且CK2的SOD活性顯著低于其他材料（P＜0.05）；材料P1、P2和P3的POD活性均在-1.2 MPa脅迫下增至最大，而CK1和CK2的POD活性均在-0.8 MPa脅迫下達到峰值，增幅分別為13.92%和10.90%，-2.0 MPa脅迫下供試紅豆草POD活性均降至最小，且材料間差異不顯著。

圖3 干旱脅迫下紅豆草的抗氧化酶活性Fig.3 SOD and POD activities in sainfoin under drought stress

2.2.3MDA和根系活力變化干旱脅迫顯著增加了供試紅豆草的MDA含量（P＜0.05），在-2.0 MPa脅迫下均增至最大，P1、P2、P3、CK1和CK2的增幅分別 為241.60%、158.31%、168.28%、62.98%和265.18%；隨水勢梯度增加供試紅豆草根系活力呈先增加后減小趨勢，-0.8 MPa時均達到最大，與0 MPa相比，P1、P2、P3、CK1和CK2的根系活力增幅分別為83.97%、76.02%、122.67%、78.31%和102.02%；除CK2的根系活力在-1.6 MPa脅迫下最小外，其余材料均在-2.0 MPa脅迫時其根系活力降至最小（圖4）。

圖4 干旱脅迫對紅豆草MDA含量和根系活力的影響Fig.4 Effects of drought stress on MDA content and root activity in sainfoin

2.3 性狀相關(guān)性分析

除根長與根冠比、根直徑、根體積、根表面積、根尖數(shù)均呈負(fù)相關(guān)外，各根系形態(tài)指標(biāo)兩兩間均呈正相關(guān)；除根長與MDA含量呈極顯著正相關(guān)、與其他生理指標(biāo)基本呈負(fù)相關(guān)外，各根系形態(tài)指標(biāo)與各生理指標(biāo)基本均呈正相關(guān)，各生理指標(biāo)兩兩間基本均呈正相關(guān)（表1）。

2.4 主成分分析

前3個主成分的貢獻率分別為53.999%、19.753%、8.710%，累計貢獻率為82.461%。其中第1、2、3主 成 分 各 自 的 特 征 值 分 別 為7.560、2.765、1.219，對應(yīng)較大的特征向量分別是根直徑、Pro、SS含量，因此這3個指標(biāo)可以作為紅豆草抗旱性篩選與評價的重要指標(biāo)（表2-3）。

表2 各綜合指標(biāo)特征值及貢獻率Table 2 Eigenvalue and contribution of each comprehensive index

2.5 紅豆草苗期抗旱性綜合評價

隸屬函數(shù)分析克服了依靠單一指標(biāo)評價的弊端，能對植物的抗逆性做出客觀、合理、全面的評價。利用14項指標(biāo)的隸屬函數(shù)加權(quán)平均值對5份紅豆草抗干旱能力進行綜合評價，其中材料P1抗旱性最好，材料P3次之，CK2最差（表4）。

表4 紅豆草幼苗期抗旱指標(biāo)隸屬值及綜合評價Table 4 The membership value and comprehensive evaluation for drought resistance on sainfoin seedlings

3 討論

根系是植物吸收水分和養(yǎng)分的主要部位，也是對干旱脅迫最先起反應(yīng)的部位［12］。研究表明，干旱脅迫下根長、根系表面積和根體積較大，有利于植物大范圍吸收土壤水分和養(yǎng)分［17］。厲廣輝等［11］和Pirnajmedin等［18］研究認(rèn)為，根系干重、根系體積、根系總吸收面積與品種抗旱能力呈顯著正相關(guān)。Wang等［19］研究認(rèn)為，干旱脅迫顯著降低了高羊茅的根系生物量和根系總長度，而抗旱型品種的根系生物量和根系總長度降幅較小。本研究表明，-0.8 MPa脅迫時，供試紅豆草的根冠比、根系總表面積、根系平均直徑、根體積、根尖數(shù)和根系活力均顯著增加；隨脅迫程度增加（-0.8～-2.0 MPa脅迫），供試紅豆草的根冠比、根系總表面積、根系平均直徑、根體積、根尖數(shù)和根系活力均顯著下降。重度脅迫下，材料P1的根體積、根表面積、根直徑降幅最低，CK1的根冠比降幅最小，CK2的根系活力和根尖數(shù)降幅最低、根長最長。說明干旱脅迫下，根體積、根表面積、根直徑較高可能是紅豆草抗旱能力較強的重要原因。

表3 各因子載荷矩陣Table 3 Matrix of factor loading

植物抗旱性與植物的水分狀況密切相關(guān)。本試驗中，干旱脅迫顯著降低了供試紅豆草的RWC，且CK2的RWC降幅最大，說明CK2的葉片保水能力較其他供試紅豆草差，對干旱環(huán)境的適應(yīng)能力較弱。

可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸作為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，干旱脅迫下其含量迅速增加，能降低滲透勢，維持膨壓，這是植物適應(yīng)干旱脅迫的一種重要機制［20-21］。本研究顯示，整個脅迫期間，材料P2的SP含量增幅最大，CK1的SS調(diào)節(jié)作用最強，P1、CK2的Pro含量增幅最大。說明干旱脅迫下，供試紅豆草的滲透調(diào)節(jié)能力因材料不同而異，且不同材料對不同生理指標(biāo)的敏感性亦不同。

植物在遭受環(huán)境脅迫時，活性氧會大大增加［22］，SOD、POD是有效的保護酶［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫顯著增加了供試紅豆草的MDA含量，說明供試紅豆草的膜脂過氧化水平均隨干旱脅迫程度增加而顯著增加，這與以往的研究結(jié)果一致［24］；相比之下，材料P1的MDA含量低于其他供試材料，說明P1膜系統(tǒng)受到外界環(huán)境的傷害較小，能夠保持較高的細(xì)胞膜相對完整性，間接地體現(xiàn)出較好的抗旱性。供試紅豆草的SOD和POD活性隨著干旱程度的增加先升高后降低，其SOD活性均在-0.8 MPa脅迫時顯著增加，材料P1、P2、P3的POD活性則在-1.2 MPa脅迫時顯著增加。說明在輕中度干旱條件下，植物能夠促進抗氧化酶的合成，使抗氧化酶具有較高的活性，但隨著干旱脅迫的增加，干旱脅迫強度超出植物忍受范圍，植物體內(nèi)抗氧化酶合成系統(tǒng)失調(diào)，導(dǎo)致抗氧化酶活性降低［25］。整個脅迫期間，材料P1的抗氧化酶（SOD、POD）活性最大，說明抗旱性強的材料其POD和SOD活性存有率高，這與前人研究結(jié)論一致［26］。本研究發(fā)現(xiàn)，供試紅豆草根系活力隨水勢梯度的增加呈先增高后降低趨勢，這與前人研究結(jié)論一致［27］。說明在輕度干旱脅迫下，植物體內(nèi)調(diào)節(jié)促進了根系生長并提高了根系活力，在重度干旱條件下，植物內(nèi)環(huán)境失調(diào)，植物難以促進根系生長，致使根系活力降低。

主成分分析表明第1、2、3主成分的累計貢獻率為82.461%，主要特征值分別為根直徑、Pro、SS含量，前面的分析也表明這3個指標(biāo)與紅豆草耐旱性關(guān)系密切，可作為紅豆草耐旱性評價指標(biāo)。

4 結(jié)論

采用營養(yǎng)液沙培法，以不同PEG-6000濃度模擬干旱脅迫，運用Fuzzy數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)綜合評判法對5份紅豆草的根系形態(tài)及生理指標(biāo)進行綜合分析，得出材料P1、P2、P3的抗旱性優(yōu)于甘肅紅豆草和蒙農(nóng)紅豆草，且P1抗旱性最好。干旱脅迫下，根直徑、脯氨酸、可溶性糖可作為篩選耐旱紅豆草的參考指標(biāo)。本試驗為培育抗旱紅豆草新品種提供了理論依據(jù)。