陳甘牛，苗 杰，陸兆軍，趙 瑩，孫曉慧，宋 黎，王世偉，喬艷輝，柴傳平

(1.煙臺(tái)市森林資源監(jiān)測(cè)保護(hù)服務(wù)中心，山東煙臺(tái)264000；2.沂南縣國(guó)有林場(chǎng)總場(chǎng)，山東沂南276300；3.山東省林業(yè)科學(xué)研究院，山東濟(jì)南250014)

草莓（Fragaria×ananassa Duch.）是薔薇科草莓屬植物，植物學(xué)分類為多年生草本植物，果樹學(xué)分類為小漿果植物，是世界七大水果之一，素有“水果皇后”的美稱?！录А葺侨毡眷o岡縣農(nóng)民育種家章弘先生于1992年選育的品種，為日本主栽品種之一，其特點(diǎn)是果實(shí)大，長(zhǎng)圓形，味濃甜，畸形少，可溶性固形物含量9%～14%，豐產(chǎn)，休眠期淺，適宜鮮食和加工。1996年遼寧東港市草莓研究所引入試栽成功，2000年后在膠東地區(qū)大面積推廣栽培。

草莓適應(yīng)性強(qiáng)，在全球分布廣泛。美、日、韓等發(fā)達(dá)國(guó)家早已根據(jù)本國(guó)市場(chǎng)需求建立了自己的草莓脫毒快繁體系，廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中，草莓產(chǎn)量和質(zhì)量有了較大提高。我國(guó)草莓種苗生產(chǎn)方式一直沿用傳統(tǒng)的無(wú)性繁殖方式，品質(zhì)退化嚴(yán)重，大面積感染病毒。目前國(guó)內(nèi)感染病毒種類主要有4 種：斑駁病毒、皺縮病毒、輕型黃邊病毒和鑲脈病毒，這些病毒大部分為潛隱性病毒，含有病毒的草莓早期無(wú)明顯表現(xiàn)特征，不進(jìn)行專業(yè)性的檢測(cè)無(wú)法分辨其是否存在病毒[1-2]。感染的病毒易造成復(fù)合感染，導(dǎo)致果實(shí)品質(zhì)及產(chǎn)量下降，嚴(yán)重時(shí)可致草莓減產(chǎn)75%，田間無(wú)特效藥和有效防治手段[3]。已有的研究報(bào)道，許多學(xué)者認(rèn)為莖尖培養(yǎng)與熱處理結(jié)合脫毒是草莓較好的脫毒方法，但脫毒效果與熱處理方式、莖尖的大小和草莓的品種密切相關(guān)[4]。本研究采用生長(zhǎng)健壯的‘章姬’草莓為材料，通過(guò)熱處理脫毒后剝離莖尖，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，建立莖尖脫毒及快繁技術(shù)體系，為實(shí)現(xiàn)草莓脫毒苗的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料‘章姬’草莓由煙臺(tái)綠食農(nóng)林科技草莓研究所苗圃提供。2019年3月初選取生長(zhǎng)健壯、匍匐莖充實(shí)、無(wú)病蟲斑、具典型‘章姬’性狀的優(yōu)良單株為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 外植體滅菌和無(wú)菌苗的建立

以草莓匍匐莖的莖尖端2～3 cm 為外植體材料，去除形態(tài)學(xué)末端。3%洗潔精溶液浸泡15 min，期間用毛刷輕微攪動(dòng)，流水沖洗1～2 h，無(wú)菌水沖洗1～2 次，移入超凈工作臺(tái)。用75%酒精處理時(shí)間分別為30 s、60 s和90 s，用無(wú)菌水沖洗2～3 次后，再用2%次氯酸鈉處理時(shí)間分別為4 min、8 min 和12min，再用無(wú)菌水沖洗4～5 次后無(wú)菌吸水紙吸干表面水分，切取長(zhǎng)度為0.8～1.0 cm 頂芽莖段接種到MS 培養(yǎng)基中。每個(gè)處理20 瓶，每瓶接種3 個(gè)莖段，3 個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)7 d 后，剔除霉菌細(xì)菌污染苗，統(tǒng)計(jì)污染率，建立草莓無(wú)菌苗體系。

1.2.2 高溫處理

將草莓無(wú)菌苗置于工智能氣候箱中，參考聶園軍[5]的做法，采用逐步升溫的方式（每小時(shí)升溫1℃）對(duì)無(wú)菌苗進(jìn)行高溫處理培養(yǎng)，起始溫度25 ℃，終止溫度38 ℃，分別處理28 d、38 d、48 d。人工氣候箱光照時(shí)間14 h，光照強(qiáng)度3000～5000 lx，相對(duì)濕度70%。每個(gè)處理20 瓶，每瓶接種2 棵無(wú)菌苗，3 個(gè)重復(fù)。28～48 d 后統(tǒng)計(jì)存活率。

1.2.3 病毒檢測(cè)

脫毒效果檢驗(yàn)參考顧地周[6]電子顯微鏡檢測(cè)法，利用負(fù)染色法，對(duì)脫毒處理的葉片進(jìn)行染色，再將染色的葉片制成60 nm 的超薄葉片，每棵成活苗取3 個(gè)葉片，在電子顯微鏡下觀察葉片中的病毒顆粒，如果沒(méi)有則證明已脫毒。

1.2.4 愈傷組織誘導(dǎo)

試驗(yàn)按照正交設(shè)計(jì)L9（34），采用3 因素3 水平設(shè)計(jì)，共9 個(gè)組合。分別是培養(yǎng)基（MS、1/2MS 和white）、6-BA（0.5 mg·L-1、1 mg·L-1、1.5 mg·L-1）和IBA（0.25 mg·L-1、0.5 mg·L-1、0.75mg·L-1），將剝離高溫處理后成活苗的0.5～0.8 mm 莖尖接種，每個(gè)組合20 瓶，每瓶接種3 個(gè)莖尖。30d 后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率，并記錄愈傷組織生長(zhǎng)情況。

1.2.5 不定芽誘導(dǎo)

把質(zhì)地致密、顏色淡黃的愈傷組織接種到含不同濃度的6-BA 和IBA 的MS 培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接種20 瓶，每瓶3 塊。定期觀察愈傷組織的再分化狀態(tài)，30 d 后統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率。

1.2.6 生根培養(yǎng)

叢生芽高度2.5 cm 時(shí)，切成單株轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基?；A(chǔ)培養(yǎng)基選用1/2MS 培養(yǎng)基，NAA 濃度設(shè)0 mg·L-1、0.25 mg·L-1、0.5 mg·L-1、0.75 mg·L-14 個(gè)梯度，每個(gè)處理接種20 瓶，每瓶接種3 棵生根苗，28 d 后統(tǒng)計(jì)生根情況。

培養(yǎng)基中含蔗糖25 g·L-1、瓊脂粉8 g·L-1、pH 為5.8～6.2。將組培材料置于光照強(qiáng)度2000 lx，光照時(shí)間14 h·d-1，培養(yǎng)溫度(25±2) ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[7]。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理及分析

（1）污染率(%) = 污染外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

（2）存活率(%) = 存活外植體數(shù)/接種外植總體數(shù)×100%

（3）脫毒率(%) = 脫除病毒的葉片數(shù)/檢測(cè)葉片數(shù)×100%

（4）愈傷組織誘導(dǎo)率(%) = 愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%

（5）不定芽誘導(dǎo)率(%) = 愈傷組織出芽數(shù)/接種愈傷組織總數(shù)×100%

（6）生根率(%) = 生根苗數(shù)/接種苗數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理對(duì)外植體染菌率的影響

外植體無(wú)菌苗體系的建立是直接影響組織培養(yǎng)成敗的重要因素，單獨(dú)使用一種消毒劑，污染率較高，效果差[8]。本試驗(yàn)采用75%酒精和2%次氯酸鈉聯(lián)合處理草莓外植體，消毒效果較好。

不同滅菌時(shí)間對(duì)外植體的影響由表1 看出，污染率隨著滅菌處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，75%酒精處理無(wú)莖段死亡現(xiàn)象，2%次氯酸鈉隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)外植體的損傷越大，主要表現(xiàn)為褐化嚴(yán)重、植株枯萎，消毒時(shí)間為12 min 時(shí)，編號(hào)3 和6 均死亡1 株、編號(hào)9 死亡2 株。編號(hào)9 即75% 酒精處理90 s、2%次氯酸鈉處理12 min，污染率最低0%，存活率93.33%，但是芽基部表面褐化，切口枯萎；編號(hào)8 即75%酒精處理90 s、2%次氯酸鈉處理8 min，污染率最低0%，存活率最高100%，莖段生長(zhǎng)正常，無(wú)褐化枯萎現(xiàn)象發(fā)生。綜合分析試驗(yàn)結(jié)果表明‘章姬’草莓最佳的滅菌處理為75%酒精90 s、2%次氯酸鈉8 min。

2.2 病毒檢測(cè)

用電子顯微鏡檢測(cè)法檢驗(yàn)無(wú)菌苗存活率及脫毒率。由表2 可知，無(wú)菌苗在38℃恒溫條件下培養(yǎng)10 d后，植株生長(zhǎng)開始減慢，培養(yǎng)28 d 后，葉片開始變黃，植株部分枯死。培養(yǎng)38 d 后，無(wú)菌苗成活率大大降低，脫毒率大幅提升，植株幾乎停止生長(zhǎng)；培養(yǎng)48 d 后，成活率低至30.00%，脫毒率達(dá)最大值85.19%，存活的植株萎蔫，生長(zhǎng)不良。因此在溫度一定的條件下，存活率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，脫毒率則與培養(yǎng)時(shí)間成正比，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，脫毒率越高。為取得更高的脫毒率，培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)越長(zhǎng)越好，但是，成活率則相反，且植株長(zhǎng)勢(shì)差，不利于后期的愈傷組織誘導(dǎo)。綜合存活率、脫毒率及植株生長(zhǎng)情況的考慮，確定‘章姬’草莓38 ℃恒溫條件下培養(yǎng)時(shí)間38 d 為宜。

表2 38 ℃條件下不同處理時(shí)間對(duì)無(wú)菌苗存活率和脫毒率的影響

2.3 不同因素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

脫毒草莓莖尖接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上7 d 左右，緊貼培養(yǎng)基莖尖切口處開始膨大，顏色變淡，14 d 后切口處膨大的愈傷組織顏色淡綠，30 d 后變?yōu)榈S色、顆粒狀愈傷組織，體積增大。不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)草莓莖尖愈傷組織的產(chǎn)生和生長(zhǎng)狀態(tài)影響不同。愈傷組織誘導(dǎo)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同因素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

激素濃度一定的情況下，MS、1/2MS、White 對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率總體趨勢(shì)為MS>1/2MS>White。在MS 培養(yǎng)基愈傷組織的誘導(dǎo)率隨激素的增高而增大，其中，以編號(hào)3 誘導(dǎo)率最高，達(dá)86.67%。由此確定，‘章姬’草莓莖尖愈傷組織最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS + 6BA1.5 mg·L-1+ IBA0.75 mg·L-1。

2.4 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

愈傷組織接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上7 d，顏色由淡黃色轉(zhuǎn)為黃綠色，體積增大。14 d 時(shí)，愈傷組織突起明顯，出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)芽點(diǎn)數(shù)量增多，逐漸分化為芽叢，28 d 左右形成叢生芽，苗高2～3 cm，葉片2～3 片。

由表4 可知，培養(yǎng)基中無(wú)添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)時(shí)，愈傷組織未見(jiàn)再分化。附加0.25 mg·L-1NAA 時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率較低，僅3.33%，添加1.50 mg·L-16-BA 時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率43.33%；隨著NAA 和6-BA 濃度的升高，不定芽誘導(dǎo)率都分別升高。

表4 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)不定芽誘導(dǎo)率的影響

同時(shí)添加6-BA 與NAA，在NAA 濃度一定時(shí)，誘導(dǎo)率隨6-BA 濃度的遞增而呈拋物線狀變化，6-BA 濃度在1.0 mg·L-1時(shí)分化率達(dá)到最高，由此可見(jiàn)細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素配比使用更有利于再分化[9]。綜合試驗(yàn)結(jié)果可知，適宜‘章姬’草莓不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS + 6-BA1.0 mg·L-1+ NAA0.25 mg·L-1，不定芽誘導(dǎo)率最高90.00%，產(chǎn)生大量叢生芽。

2.5 IBA 對(duì)草莓生根的影響

把叢生芽切成單株接種到含有不同濃度IBA 的生根培養(yǎng)基中，15d 后部分小苗基部開始膨大，20 d 開始出現(xiàn)白色不定根，35 d 根長(zhǎng)2～3 cm，發(fā)根數(shù)條，小苗長(zhǎng)勢(shì)良好。

由表5 可知，在培養(yǎng)基中未添加IBA 時(shí)，小苗無(wú)生根現(xiàn)象，只看到莖段及葉片增大。當(dāng)IBA 的濃度范圍為0.25～0.75 mg·L-1時(shí)，生根率明顯提高，IBA 濃度0.75 mg·L-1時(shí)，生根率最高93.33%；而IBA 濃度＞1.0 mg·L-1時(shí)，生根率逐漸下降。由此得出‘章姬’草莓最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS + IBA 0.75 mg·L-1，主根明顯，植株生長(zhǎng)健壯。

表5 不同濃度IBA 對(duì)草莓植株生根的影響

3 結(jié)論和討論

外植體消毒是快繁體系建立的重要環(huán)節(jié)，由于外植體來(lái)源于田間，不可避免的附有大量的病毒和細(xì)菌，因此，消毒劑的種類、濃度、消毒時(shí)間的選擇尤為重要。本試驗(yàn)采用75%酒精消毒90 s，再用2%次氯酸鈉處理8 min，結(jié)果表明二者聯(lián)合比單獨(dú)使用消毒效果好，污染率0%，存活率100%。

莖尖培養(yǎng)是最常見(jiàn)的草莓組培快繁方法。利用莖尖的快速分生能力不僅能在組培條件下獲得大量的優(yōu)質(zhì)種苗，還可以結(jié)合脫毒技術(shù)生產(chǎn)脫毒種苗[10]。當(dāng)前，草莓莖尖脫毒研究多集中在莖尖大小的選擇、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類和劑量、高溫處理等方面。陳婕[11]采用熱-化結(jié)合處理（熱處理結(jié)合病毒醚處理）的方法獲得生根能力更強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)脫毒草莓苗。莖尖脫毒通常莖尖長(zhǎng)度越小越好，但是實(shí)際操作中，莖尖越小，脫毒率增高的同時(shí)，死亡率也隨之增加。筆者在長(zhǎng)期的工作實(shí)踐中，發(fā)現(xiàn)0.5～0.8 mm 的莖尖長(zhǎng)度適合愈傷組織誘導(dǎo)，還方便操作，因此，本研究采用38 ℃高溫處理后無(wú)毒的無(wú)菌苗，剝離0.5～0.8 mm 的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，獲得了生長(zhǎng)健壯的優(yōu)質(zhì)脫毒‘章姬’草莓苗。

在愈傷組織誘導(dǎo)中，不同植物對(duì)各類營(yíng)養(yǎng)成分的需求也有差異[12]。本試驗(yàn)選用了3 種（MS、1/2 MS 和white）基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的6-BA 和IBA，采用正交試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)適宜草莓愈傷組織誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基為MS，可能是MS 培養(yǎng)基中鉀鹽、銨鹽、硝酸鹽等無(wú)機(jī)鹽更適宜草莓莖尖誘導(dǎo)形成愈傷組織，其誘導(dǎo)率主要受到6-BA 濃度的影響，在一定范圍內(nèi)，誘導(dǎo)率隨6-BA 濃度的升高而升高，誘導(dǎo)的愈傷組織在再分化過(guò)程中更容易分化成苗。最適愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基配比MS+6BA1.5 mg·L-1+IBA0.75 mg·L-1，誘導(dǎo)率86.67%。

植物所需生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類和濃度，在不同培養(yǎng)階段是不同的，二者以適宜濃度配比使用，有利于形成完整植株，濃度過(guò)高或過(guò)低，會(huì)影響再生植株發(fā)生及長(zhǎng)勢(shì)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，草莓愈傷組織再分化過(guò)程中細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素聯(lián)合使用更利于愈傷組織再分化，較高濃度的6-BA 與適宜濃度IBA 也有助于草莓愈傷組織再分化，但I(xiàn)BA 濃度過(guò)高對(duì)再分化不利。因此最適宜不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基配比MS + 6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.25 mg·L-1，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)90%。本試驗(yàn)建立的‘章姬’草莓莖尖脫毒快繁體系對(duì)其他品種草莓的脫毒和工廠化育苗具有一定的參考意義。