陳磊 郭海萍 逄宇 劉光福 潘兆寶 韓守華 程娟 李?yuàn)檴?/p>

近年來(lái)，由非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)引起感染的患者明顯增多，其中以膿腫分枝桿菌(Mycobacteriumabscessus)感染最為常見(jiàn)[1]。膿腫分枝桿菌是一種快速生長(zhǎng)型NTM，主要引起肺部及皮膚軟組織感染[2]，已有很多關(guān)于膿腫分枝桿菌在人與人之間進(jìn)行傳播，甚至引起院內(nèi)感染的報(bào)道[3-4]。膿腫分枝桿菌對(duì)現(xiàn)有的大多數(shù)抗生素及經(jīng)典的抗結(jié)核藥物具有天然耐藥性[5]，因此其引起的感染極難治療。

最近的研究表明，3-氨甲基-4-鹵代苯并噁唑類(lèi)化合物GSK656作為一種結(jié)核分枝桿菌亮氨酰-tRNA 合成酶(leucyl-tRNA synthetase)的小分子抑制劑，可用于治療耐多藥結(jié)核病[6]。本研究團(tuán)隊(duì)的前期研究表明，GSK656對(duì)膿腫分枝桿菌具有較好的體外抑菌活性[7]。GSK656與其他抗菌藥物，特別是與氨基糖苷類(lèi)藥物聯(lián)合使用在治療因膿腫分枝桿菌感染引起的疾病時(shí)是否具有協(xié)同效應(yīng)，將為以GSK656為有效治療方案的制定提供新的臨床依據(jù)。本研究評(píng)價(jià)GSK656與氨基糖苷類(lèi)藥物——阿米卡星聯(lián)合用藥對(duì)膿腫分枝桿菌分離株的體外抑菌活性，為臨床應(yīng)用GSK656聯(lián)合阿米卡星治療膿腫分枝桿菌感染提供依據(jù)。

材料和方法

一、材料和儀器

1.臨床分離株：膿腫分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 19977)及30株分離株來(lái)自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院菌株庫(kù)。所有膿腫分枝桿菌分離株均已通過(guò)多位點(diǎn)序列分析，包括16S rRNA、hsp65、rpoB、16S-23S rRNA序列測(cè)定，在分析比對(duì)后鑒定菌株種類(lèi)[8]。

2.培養(yǎng)基和抗菌藥物：中性羅氏(L?wenstein-Jensen)培養(yǎng)基購(gòu)自麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，抗菌藥物粉劑阿米卡星購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，GSK656購(gòu)自上海瀚香生物科技有限公司。采用無(wú)菌純水溶解后通過(guò)無(wú)菌0.22 μm濾膜(愛(ài)爾蘭默克密理博公司)過(guò)濾后備用。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 主要檢測(cè)指標(biāo)：檢測(cè)阿米卡星、GSK656對(duì)30株膿腫分枝桿菌的體外最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)、抑制50%受試菌所需的最低抑菌濃度(MIC50)、抑制90%受試菌所需的最低抑菌濃度(MIC90)。MIC50和MIC90可以反映藥物的體外抑菌活性，數(shù)值越低，體外抑菌活性越強(qiáng)。

2. MIC測(cè)定：微量肉湯稀釋法參照臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(Clinical and Laboratory Stan-dards Institute，CLSI)指南進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱(chēng)“藥敏試驗(yàn)”)[9]。取接種于中性羅氏培養(yǎng)基并培養(yǎng)3～7 d長(zhǎng)勢(shì)良好的膿腫分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 19977)和30株分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。使用Mueller-Hinton(MH)肉湯培養(yǎng)基對(duì)抗生素進(jìn)行稀釋?zhuān)珿SK656的濃度范圍為0.008～8 mg/L，阿米卡星的濃度范圍為0.125～128 mg/L。從羅氏培養(yǎng)基斜面上刮取菌落并制備成1個(gè)麥?zhǔn)蠞舛鹊男迈r菌液，以1∶20比例稀釋后接種于96孔微孔板中。30 ℃ 孵育72 h后，每孔加入含20 μl阿爾瑪藍(lán)和50 μl 的5%吐溫-80混合液，以37 ℃孵育24 h后評(píng)估細(xì)菌生長(zhǎng)狀況。將阻止液體由藍(lán)色變?yōu)榉奂t色的最低藥物濃度判定為MIC值。本研究采用CLSI指南，將MIC≤16 mg/L定義為阿米卡星對(duì)膿腫分枝桿菌敏感，將MIC≥64 mg/L定義為阿米卡星對(duì)膿腫分枝桿菌耐藥[9]；而對(duì)于GSK656，膿腫分枝桿菌的耐藥基線值尚無(wú)報(bào)道。

3. 分級(jí)抑菌濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI)測(cè)定：聯(lián)合藥敏試驗(yàn)采用棋盤(pán)稀釋法，根據(jù)各單藥MIC結(jié)果確定聯(lián)合藥敏試驗(yàn)使用的藥物濃度范圍，將GSK656和阿米卡星分別進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)蛊涔ぷ鳚舛确謩e為8×MIC、4×MIC、2×MIC、MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC。以30 ℃孵育72 h后，每孔加入含20 μl阿爾瑪藍(lán)和50 μl的5%吐溫-80混合液，以37 ℃孵育24 h后評(píng)估細(xì)菌生長(zhǎng)狀況。記錄兩藥聯(lián)合使用時(shí)的MIC值，并計(jì)算FICI判斷兩種藥物聯(lián)合使用的效果。FICI計(jì)算方法：FICI=A藥聯(lián)合使用時(shí)的MIC/A藥單獨(dú)使用時(shí)的MIC+B藥聯(lián)合使用時(shí)的MIC/B藥單獨(dú)使用時(shí)的MIC。FICI≤0.5為協(xié)同作用，0.52為拮抗作用[10]。

結(jié) 果

一、GSK656與阿米卡星單獨(dú)或聯(lián)合使用對(duì)膿腫分枝桿菌的MIC情況

30株膿腫分枝桿菌分離株對(duì)各抗菌藥物的MIC值見(jiàn)表1。對(duì)于阿米卡星，膿腫分枝桿菌的耐藥基線值為≥64 mg/L。本研究中30株膿腫分枝桿菌分離株對(duì)阿米卡星的敏感率為100.0%(30/30)(表1，2)。GSK656單獨(dú)使用時(shí)對(duì)30株膿腫分枝桿菌分離株的MIC50和MIC90分別為0.250 mg/L和2.000 mg/L，阿米卡星單獨(dú)使用時(shí)對(duì)30株膿腫分枝桿菌分離株的MIC50和MIC90分別為8.000 mg/L和16.000 mg/L。當(dāng)兩種藥物聯(lián)合使用時(shí)，GSK656的MIC50和MIC90分別為0.125 mg/L和0.500 mg/L，為單獨(dú)使用時(shí)的1/2和1/4，阿米卡星的MIC50和MIC90與單獨(dú)使用時(shí)相同。

表1 30株膿腫分枝桿菌對(duì)GSK656和阿米卡星的MIC值分布情況(株)

二、GSK656和阿米卡星聯(lián)合使用對(duì)膿腫分枝桿菌的FICI分布影響

GSK656和阿米卡星聯(lián)合使用對(duì)30株膿腫分枝桿菌以無(wú)關(guān)作用為主(80.0%，24/30)，對(duì)5株(16.7%)產(chǎn)生了協(xié)同作用，僅有1株(3.3%)產(chǎn)生了拮抗作用(表3，4)。

表2 30株膿腫分枝桿菌分離株對(duì)GSK656和阿米卡星的MIC范圍(mg/L)

表3 30株膿腫分枝桿菌對(duì)GSK656和阿米卡星單獨(dú)和聯(lián)合使用的MIC和FICI分布情況

表4 30株膿腫分枝桿菌對(duì)GSK656和阿米卡星單獨(dú)和聯(lián)合使用的MIC和FICI具體情況

續(xù)表4

討 論

在過(guò)去的幾年中，由NTM引起的感染患者例數(shù)快速增加[11-12]。由于缺乏明確的人與人之間傳播的證據(jù)，由NTM引起的感染往往容易被忽視[13]。且由于其對(duì)大多數(shù)的抗生素天然耐藥，對(duì)膿腫分枝桿菌感染的治療非常困難[14]。目前的治療方案推薦應(yīng)用氨基糖苷類(lèi)或大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素進(jìn)行治療，然而僅有約1/3的患者在多種抗生素治療后能夠獲得良好的疾病轉(zhuǎn)歸[11]。鑒于目前用于治療的抗生素效果不佳，亟需新的藥物或者藥物組合來(lái)治療因膿腫分枝桿菌感染引起的疾病。

目前的指南推薦使用大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)聯(lián)合氨基糖苷類(lèi)或碳青霉烯類(lèi)藥物治療膿腫分枝桿菌引起的肺部疾病[15]。氨基糖苷類(lèi)藥物在分枝桿菌引起的疾病的治療中一直扮演著重要的角色。大多數(shù)氨基糖苷類(lèi)化合物是由鏈霉菌屬或小單孢菌屬的放線菌產(chǎn)生的天然物質(zhì)。氨基糖苷類(lèi)化合物的殺菌原理主要是通過(guò)與細(xì)菌的30 S核糖體亞基結(jié)合，導(dǎo)致翻譯過(guò)程不能正常進(jìn)行，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[16]。該類(lèi)抗生素的特點(diǎn)是抗菌譜廣，殺菌作用迅速，并能與其他藥物產(chǎn)生協(xié)同作用。阿米卡星通常用于治療由快速生長(zhǎng)型分枝桿菌引起的嚴(yán)重感染，包括偶然分枝桿菌和膿腫分枝桿菌。然而，在快速生長(zhǎng)的龜分枝桿菌和膿腫分枝桿菌中，由于核糖體操縱子單一拷貝的存在，其16S rRNA 1408位點(diǎn)的單一突變將導(dǎo)致高水平的阿米卡星耐藥。突變頻率已被證明高達(dá)10-5[16]。這表明當(dāng)這些細(xì)菌大量存在時(shí)，氨基糖苷類(lèi)藥物不應(yīng)作為單一藥物使用。

作為替代療法，一些新的抗結(jié)核藥物用于NTM患者的治療實(shí)現(xiàn)了治療效果[17]。因此，進(jìn)行體外(聯(lián)合)藥敏試驗(yàn)評(píng)估這些新的抗結(jié)核藥物對(duì)NTM的MIC至關(guān)重要。GSK656是一種新的結(jié)核分枝桿菌亮氨酰-tRNA 合成酶的小分子抑制劑，它可以抑制亮氨酸修飾和蛋白質(zhì)合成[6]。已有研究表明，GSK656對(duì)耐多藥結(jié)核病和廣泛耐藥結(jié)核病的分離株均有較好的體外抑制效果[7]。目前，關(guān)于GSK656對(duì)NTM菌株的體外抑菌活性的研究結(jié)果較少。Li等[6]藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果證實(shí)，GSK656在小鼠模型中的生物利用度為11.12 h·μg·ml-1，高于本研究中大多數(shù)膿腫分枝桿菌分離株的MIC值。本研究結(jié)果表明，GSK656在體外具有良好的抗膿腫分枝桿菌活性。96.7%(29/30)的測(cè)試菌株MIC值≤2 mg/L，因而GSK656是一種潛在的抗膿腫分枝桿菌的藥物。

阿米卡星是治療膿腫分枝桿菌肺病的一種氨基糖苷類(lèi)藥物[13]。在本研究中，30株分離株對(duì)阿米卡星的敏感率為100.0%，且阿米卡星與GSK656的聯(lián)合效應(yīng)較好，16.7%表現(xiàn)為協(xié)同作用，80%表現(xiàn)為無(wú)關(guān)作用，僅3.3%表現(xiàn)為拮抗作用。從機(jī)制上看，GSK656是一種tRNA合成酶的抑制劑[6]，而阿米卡星的作用位點(diǎn)為16S rRNA[13]，兩者在抑制蛋白質(zhì)合成上可能有協(xié)同作用或相加作用。30株分離株中，僅有1株的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示為拮抗作用，推測(cè)其拮抗作用可能是由于該菌株在傳代培養(yǎng)的過(guò)程中，部分菌株對(duì)阿米卡星產(chǎn)生了耐藥。

在體外藥敏試驗(yàn)中，將阿米卡星與GSK656聯(lián)合作用，可提供GSK656與常規(guī)抗膿腫分枝桿菌藥物之間療效的直接比較，為GSK656在臨床的應(yīng)用提供新的參考依據(jù)。本研究結(jié)果表明，當(dāng)GSK656與阿米卡星聯(lián)合使用后，GSK656對(duì)膿腫分枝桿菌的MIC50和MIC90較單獨(dú)使用時(shí)出現(xiàn)明顯降低，由于協(xié)同作用而減少的MIC可能有助于取得良好的預(yù)后，從而提高臨床療效，減少耐藥的出現(xiàn)[11]。

本研究存在一定局限性。首先，體外確定的抗菌藥物的活性可能不能預(yù)測(cè)體內(nèi)的藥效，特別是協(xié)同作用。其次，不良反應(yīng)的發(fā)生是一個(gè)重要的問(wèn)題，但在現(xiàn)有研究中無(wú)法獲得此類(lèi)信息。

綜上所述，體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，GSK656或GSK656和阿米卡星聯(lián)合用藥可能可以作為膿腫分枝桿菌治療的替代方案，但結(jié)果仍需進(jìn)一步的動(dòng)物和臨床試驗(yàn)加以驗(yàn)證。