鄭海生，藍(lán)育青，李 芳，梁曉茜，楊鎮(zhèn)朵，鐘興武

0引言

姜黃素(curcumin，Cur)作為我國的一種傳統(tǒng)中藥，具有多種療效[1-3]。姜黃素在眼科的應(yīng)用研究發(fā)現(xiàn)其具有抑制人視網(wǎng)膜色素上皮(human retinal pigment epithelium，hRPE)細(xì)胞增殖及糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)等作用，因此其在防治眼底新生血管性病變中可以發(fā)揮抗新生血管的藥理作用，并且已有臨床試驗(yàn)研究姜黃素的藥物代謝動力學(xué)及癌癥治療的生物有效劑量[4-5]。但姜黃素難溶于水，體內(nèi)被快速代謝，體內(nèi)半衰期短，且需要長期、反復(fù)用藥。這給患者帶來許多的不便與痛苦。同時由于其作用于組織和細(xì)胞的非選擇性，且目前仍無穩(wěn)定性較好的藥物劑型，影響了姜黃素在臨床上的廣泛應(yīng)用。因此研制姜黃素的新劑型具有重要的臨床意義。納米中藥是指運(yùn)用納米技術(shù)制造的、粒徑小于100nm 的中藥有效成分、有效部位、原藥及其復(fù)方制劑[6-7]。納米中藥與傳統(tǒng)中藥比較有其優(yōu)勢[8-10]：增大了藥物的溶解度；更容易通過血-視網(wǎng)膜屏障、血-腦屏障定向作用于視網(wǎng)膜及中樞神經(jīng)；具有緩釋性、靶向性；提高藥物的質(zhì)量、減少副作用、提高療效；節(jié)約有限的中藥資源；利于中藥標(biāo)準(zhǔn)化、國際化等特點(diǎn)。本研究主要通過納米技術(shù)將姜黃素包載到脫氧膽酸基接枝的殼聚糖納米粒中，制備成載藥納米粒，希望此納米粒具有緩慢釋放藥物功能，降低姜黃素的不良反應(yīng)，提高藥物的療效、長時間維持藥效濃度，減少多次給藥對患者帶來的痛苦。同時通過觀察比較姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒和姜黃素原藥對體外培養(yǎng)的hRPE細(xì)胞的作用，為尋找一種新型的、緩釋的、安全有效地防治眼底新生血管性疾病的新藥物提供初步的理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：hRPE細(xì)胞(中山大學(xué)附屬眼科中心醫(yī)院提供，選第3～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn))。主要試劑：姜黃素(購自SIGMA公司)、胎牛血清(Biological Industries公司)。主要儀器設(shè)備：光學(xué)倒置顯微鏡(德國Leica MPS-30)、熒光顯微鏡Axioplan2 imaging(德國 Zeiss)。

1.2方法

1.2.1材料合成與制備

1.2.1.1姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒的合成將殼聚糖-脫氧膽酸放于PBS6.2中(按4mg/mL)，不斷攪拌使殼聚糖-脫氧膽酸膨脹溶解；稱取一定量姜黃素并溶解于四氫呋喃中；然后緩慢滴加姜黃素的四氫呋喃溶液至殼聚糖-脫氧膽酸溶液中，再緩慢滴加蒸餾水，繼續(xù)攪拌至少24h；在攪拌下升溫至40℃，使殘余的四氫呋喃揮發(fā)；最后在5 500轉(zhuǎn)下離心15min，下層沉淀為未負(fù)載的藥物，上清液即為殼聚糖-脫氧膽酸負(fù)載的姜黃素納米粒。

1.2.1.2異硫氰酸/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒的合成稱取殼聚糖-脫氧膽酸置于圓底燒瓶，滴加磷酸緩沖液(pH=6.2)，不斷攪拌使殼聚糖-脫氧膽酸溶解；取少量的熒光染料異硫氰酸熒光素溶于PBS6.2的緩沖液中，然后慢慢滴加至殼聚糖-脫氧膽酸溶液中，再緩慢滴加少量水，水滴加完后，繼續(xù)攪拌至少24h；高速離心(20 000g，20min)分離，棄去上層液體，下層沉淀液為負(fù)載異硫氰酸熒光素的殼聚糖-脫氧膽酸納米粒；加磷酸緩沖液溶解沉淀，可得到異硫氰酸/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒水溶液。

1.2.1.3異硫氰酸/姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒的合成稱取殼聚糖-脫氧膽酸置于圓底燒瓶，滴加磷酸緩沖液，不斷攪拌使殼聚糖-脫氧膽酸溶解；稱取少量姜黃素并溶解于四氫呋喃中；然后緩慢滴加姜黃素的四氫呋喃溶液至殼聚糖-脫氧膽酸溶液中，再取少量的異硫氰酸熒光素溶于PBS6.2的緩沖液中，然后慢慢滴加至殼聚糖-脫氧膽酸溶液中(避光)，繼續(xù)攪拌至少24h；在攪拌下升溫至40℃，使殘余的四氫呋喃揮發(fā)；5 500轉(zhuǎn)下離心15min，取上清液；高速離心(20 000g，20min)分離，棄去上層液體，下層沉淀液為負(fù)載異硫氰酸熒光素及姜黃素的殼聚糖-脫氧膽酸納米粒；加磷酸緩沖液溶解沉淀，可得到異硫氰酸/姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒水溶液。

1.2.1.4姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒的體外釋放采用動態(tài)透析法考察姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒在含20%乙醇的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=6.2，緩沖液:乙醇=80∶20，v/v；乙醇作為藥物的增溶劑)的釋放特征。將3.8mL姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒溶液(載藥量27.5%)裝入透析袋中，將透析袋放于196.2mL透析介質(zhì)中(含20%乙醇的磷酸鹽緩沖液，37.0℃，100r/min)，每隔一段時間取透析介質(zhì)溶液1.0mL，同時補(bǔ)充1.0mL介質(zhì)溶液。采用紫外分光光度法(λ=433nm)測定藥物的釋放量，藥物釋放率=(藥物釋放量/藥物總量)×100%。

1.2.1.5透射電子顯微鏡觀察納米粒形態(tài)分別取少量殼聚糖-脫氧膽酸納米粒和姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒溶液分別滴至銅網(wǎng)支持膜上，用濾紙將多余的液體吸除，待自然干燥后用2%磷鎢酸染色，晾干后在透射電鏡下觀察二者的形態(tài)。

1.2.2異硫氰酸/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒及異硫氰酸/姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒與hRPE細(xì)胞的相互作用取對數(shù)生長期的hRPE細(xì)胞以1.0×105/cm2的密度接種于24孔板中，每孔500μL DMEM-F12培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后，細(xì)胞貼壁，更換新的培養(yǎng)基，分別加入異硫氰酸/殼聚糖-脫氧膽酸和異硫氰酸/姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒溶液，使溶液中殼聚糖-脫氧膽酸的最終濃度為1.0mg/mL。CO2培養(yǎng)箱內(nèi)避光培養(yǎng)1、3、5d后，棄去培養(yǎng)基，并用PBS溶液沖洗3次，加入新的培養(yǎng)基，然后在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察和照相。

2結(jié)果

2.1姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒合成及其載藥量及負(fù)載效率的測定所合成的姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒溶液為淡黃色，并可見丁達(dá)爾(Tyndall)現(xiàn)象(圖1A、B)。

圖1 合成的姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒溶液 A：合成的淡黃色姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒溶液；B：納米粒溶液的丁達(dá)爾(Tyndall)現(xiàn)象。

2.2姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒的體外釋放姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒在溶液中的釋放行為見圖2，藥物從納米粒中釋放96h后達(dá)到平衡，累積釋放藥物量為31.6%。

圖2 姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米微粒的體外釋放。

2.3納米粒形態(tài)通過透射電子顯微鏡觀察可見未負(fù)載藥物的殼聚糖-脫氧膽酸納米微粒呈球形或類球形，大小均一，粒徑約30～50nm(圖3A)；負(fù)載姜黃素的殼聚糖-脫氧膽酸納米微粒粒徑明顯增大，約70～100nm(圖3B)。

圖3 殼聚糖-脫氧膽酸納米微粒負(fù)載藥物前后的透射電鏡照片 A：未負(fù)載藥物的殼聚糖-脫氧膽酸納米微粒，粒徑約30～50nm；B：負(fù)載姜黃素的殼聚糖-脫氧膽酸納米微粒，載藥量27.5%，粒徑約70～100nm。

2.4異硫氰酸/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒及異硫氰酸/姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒與hRPE細(xì)胞的相互作用

2.4.1異硫氰酸/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒異硫氰酸/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒與hRPE細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，倒置熒光顯微鏡下觀察1、3、5d后納米粒與細(xì)胞相互作用的關(guān)系見圖4。

圖4 異硫氰酸/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒與hRPE細(xì)胞的相互作用 A：作用1d后，殼聚糖-脫氧膽酸納米粒大部分仍位于近細(xì)胞膜的部位(可能于細(xì)胞膜表面，或剛透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中)；B：作用3d后，殼聚糖-脫氧膽酸納米粒逐漸向細(xì)胞核聚集，大部分位于細(xì)胞核周圍；C：作用5d后，殼聚糖-脫氧膽酸納米粒已進(jìn)入細(xì)胞核，且殼聚糖-脫氧膽酸納米粒可能在細(xì)胞內(nèi)溶酶體的作用下部分降解，可見熒光染料擴(kuò)散到整個細(xì)胞中，在熒光圖中可看到細(xì)胞的輪廓，且細(xì)胞核區(qū)域的熒光較強(qiáng)。

2.4.2異硫氰酸/姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒異硫氰酸/姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒與hRPE細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，倒置熒光顯微鏡下觀察1、3、5d后納米粒與細(xì)胞相互作用的關(guān)系見圖5?？梢姷酱硕咧g的相互關(guān)系與空載的殼聚糖-脫氧膽酸納米粒具有相似的過程。

圖5 異硫氰酸/姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒與hRPE細(xì)胞的相互作用 A：作用1d后，殼聚糖-脫氧膽酸納米粒大部分仍位于近細(xì)胞膜的部位(可能于細(xì)胞膜表面，或剛透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中)；B：作用3d后，姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒逐漸向細(xì)胞核聚集，大部分位于細(xì)胞核周圍；C：作用5d后，姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒已進(jìn)入細(xì)胞核。

3討論

高分子化合物是制備納米控釋系統(tǒng)的主要載體材料，常以天然的大分子體系和合成的可生物降解的聚合物體系為主。殼聚糖是一種天然高分子聚合物，是至今為止唯一發(fā)現(xiàn)的帶陽離子性質(zhì)的堿性氨基多糖。殼聚糖在自然界中廣泛存在于低等生物菌類、藻類的細(xì)胞，節(jié)支動物蝦、蟹、昆蟲的外殼等。殼聚糖具有較好的可降解性、生物相容性和黏附性[11]。殼聚糖包裹還可以提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和適用性[12-13]。因此殼聚糖廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健、生物工程等領(lǐng)域[14]。遠(yuǎn)在幾千年前《本草綱目》中早已有蟹殼粉的記錄，可見古人早已將殼聚糖作為醫(yī)療之用。在本研究中所合成的姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒是選用了殼聚糖-脫氧膽酸為藥物載體，殼聚糖-脫氧膽酸是采用EDC作耦合劑，在殼聚糖上接枝脫氧膽酸，合成具有兩親性的改性殼聚糖，該聚合物在水溶液中可形成納米粒。納米藥物的緩釋機(jī)制一般認(rèn)為有：(1)吸附或連接于粒子表面的藥物與納米粒脫離；(2)納米膠束內(nèi)部的藥物不斷向外擴(kuò)散；(3)納米膠束本身不斷被降解，藥物不斷地從膠束內(nèi)被釋放出來。

本研究通過合成脫氧膽酸基接枝的殼聚糖衍生物負(fù)載姜黃素納米粒，并進(jìn)行擴(kuò)散釋放實(shí)驗(yàn)法及利用熒光染料的示蹤作用，在倒置熒光顯微鏡下觀察異硫氰酸/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒與hRPE細(xì)胞相互作用情況。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)藥物從納米粒中的釋放表現(xiàn)為突釋和緩釋兩個階段，藥物從納米粒中釋放96h后達(dá)到平衡，累積釋放藥物量為31.6%，其中前20h為突釋階段，藥物釋放達(dá)19.9%。體外擴(kuò)散釋放實(shí)驗(yàn)證明了本研究所合成的負(fù)載姜黃素納米粒具有緩慢釋放功能。倒置熒光顯微鏡下觀察異硫氰酸/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒與hRPE細(xì)胞的作用發(fā)現(xiàn)，異硫氰酸/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒與細(xì)胞作用1d后，納米粒大部分仍位于近細(xì)胞膜的部位(可能在細(xì)胞膜表面，也可能在細(xì)胞質(zhì)中)；作用3d后，納米粒逐漸向細(xì)胞核會聚，且大部分位于細(xì)胞核周圍；作用5d后，可看到納米微粒已進(jìn)入細(xì)胞核，且在細(xì)胞內(nèi)溶酶體的作用下納米微?？赡苡胁糠纸到猓瑹晒馊玖蠑U(kuò)散至整個細(xì)胞中，在熒光圖中可看到細(xì)胞的輪廓，且細(xì)胞核區(qū)域的熒光較強(qiáng)。即隨著時間的延長，納米微粒由細(xì)胞外進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并逐漸降解。在細(xì)胞與納米粒相互作用過程中，我們分析認(rèn)為可能是殼聚糖含有帶正電的氨基基團(tuán)，而細(xì)胞膜表面蛋白多糖帶負(fù)電。有研究顯示聚陽離子的納米?？梢酝ㄟ^納米粒表面的正電荷與細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的蛋白多糖非特異性靜電結(jié)合被吞噬進(jìn)入細(xì)胞[15]。另有研究發(fā)現(xiàn)由于姜黃素在納米粒中呈現(xiàn)緩釋趨勢增加了藥物的內(nèi)吞作用[16]。因此，本研究中殼聚糖-脫氧膽酸納米?？赡芡ㄟ^電荷的相互作用而與細(xì)胞吸附，也可能是殼聚糖經(jīng)過了脫氧膽酸改性，具有兩親性，而更易與細(xì)胞膜作用。然而，本研究僅觀察了殼聚糖-脫氧膽酸納米粒與hRPE細(xì)胞在不同時間內(nèi)的相互作用關(guān)系，但這些作用與納米粒的粒徑大小、濃度之間的相互關(guān)系如何尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。本研究為進(jìn)一步耦聯(lián)特異性VEGF抗體制備靶向載藥納米粒及進(jìn)行體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)提供了研究基礎(chǔ)，為尋找一種新型的、持久的、安全有效防治眼底新生血管性疾病的新藥物提供了初步的理論依據(jù)。