楊星九張文龍史旭東李夢媛張國新高苒*

(1. 中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心,北京 100021;2. 國家人類疾病動物模型資源庫,北京 100021;3. 國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室,北京 100021;4. 北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術(shù)研究中心,北京 100021)

肺癌是目前全球死亡率最高、且發(fā)生率第二的癌癥[1]。目前肺癌治療的主要方案是手術(shù)結(jié)合放療和系統(tǒng)性化療,然而在大多數(shù)臨床病例中,肺癌仍然表現(xiàn)出明顯的不良預后,肺癌患者的五年生存率明顯低于其他癌癥患者。對于肺癌研究而言,仍需要不斷研究肺癌發(fā)展的機制,探索化療藥物對肺癌的治療作用[2],而理想的肺癌動物模型是肺癌研究中的重要工具和研究橋梁。

肺癌動物模型主要包括化學誘導模型、基因工程模型、移植瘤模型等。相較于前兩種模型而言,肺癌移植瘤模型因具備制備周期短、重復性高、易于跟蹤等優(yōu)點,在研究中被廣泛應用[3]。

目前肺癌研究中應用較為常用的移植瘤疾病動物模型主要有兩種,其一是肺癌的小鼠皮下移植瘤模型,另一種是經(jīng)小鼠尾靜脈注射形成的肺部轉(zhuǎn)移瘤模型。前者操作簡便,但是腫瘤發(fā)生發(fā)展脫離了肺部原本的微環(huán)境[3]。后者所構(gòu)建的模型,相比于原發(fā)性肺癌的發(fā)生,更近似于模擬臨床患者腫瘤的肺部轉(zhuǎn)移而非發(fā)生情況。此外,尾靜脈途徑構(gòu)建的肺轉(zhuǎn)移瘤模型的腫瘤結(jié)節(jié)多而隨機,難以對轉(zhuǎn)移性肺腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程進行跟蹤和評價[4]。這兩種模型在模擬臨床肺癌病例時,均存在一定缺陷[5]。

為了更好的模擬臨床肺癌病例,直接將腫瘤定植于小鼠肺的造模方式應運而生,即肺癌原位移植瘤模型。原位移植瘤的造模方法主要包括通過氣道移植和從胸骨外直接注射兩種方式。由于缺乏精確定位,其肺癌造模結(jié)果依然存在腫瘤結(jié)節(jié)多發(fā)、不易準確跟蹤的可能[6-7]。為了解決上述問題,我們對前人方法進行了改進,通過影像學CT確認模型所需進針深度及進針位置,采用立體定位儀,精確控制進針位置、進針深度與進針角度,使用微量注射器精確控制細胞注射體積,將腫瘤細胞直接接種于小鼠肺部,建立了一種小鼠肺癌原位移植瘤模型。相較于之前的模型研究,原位移植瘤模型具有原發(fā)于肺部、定植位置明確、腫瘤結(jié)節(jié)單發(fā)等優(yōu)點,更貼近于臨床患者肺癌的發(fā)生及發(fā)展,并可利用分子影像學技術(shù)對腫瘤發(fā)展過程進行示蹤記錄。

1 材料與方法

1.1 材料

6只6周齡SPF級C57BL/6J雄性小鼠,體重16 ~ 18 g,購買自北京華阜康生物科技有限公司【SCXK(京)2019-0008】。飼養(yǎng)期間各組小鼠自由飲水,飼喂普通維持飼料由北京華阜康生物科技有限公司提供。飼養(yǎng)環(huán)境:晝夜各半循環(huán)照明,濕度恒定,溫度控制在22 ~ 25℃,飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所動物房【SYXK(京)2019-0039】。所有操作均符合中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所倫理學要求(IACUC GR21003)。

1.1.2 細胞

LLC小鼠肺癌細胞(國家實驗細胞資源共享平臺,中國)。

1.1.3 主要試劑與儀器

Luc過表達慢病毒(吉凱基因,中國),0.25%胰酶-EDTA(Gibco,美國),PBS(Gibco,美國),Matrigel(BD,美國),D-Luciferin(泛博生化),CD3抗體(abcam,ab16669),CD19抗體(abcam,ab245235),F4/80抗體(abcam,ab16911),Ly6G抗體(abcam,ab25377),Ki-67抗體(abcam,ab16667),CD31抗體(CST,77699),α-SMA抗體(abcam,ab124964),Vimentin抗體(CST,5741S),E-cadherin抗體(CST,14472S)。Inveon微型CT掃描儀(西門子,德國),小鼠立體定位儀(正華生物,中國),30 g微量注射器(Hamilton,美國)。

1.2 方法

1.2.1 熒光素酶報告基因細胞構(gòu)建

模型選用LLC小鼠肺癌細胞,購買自國家實驗細胞資源共享平臺,用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)條件37℃,5% CO2。Luc過表達慢病毒購買自上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司,將LLC細胞制備成濃度為5×104/mL的細胞懸液,接種2 mL于6孔細胞培養(yǎng)板中,于24 h后進行慢病毒感染。慢病毒的轉(zhuǎn)染嚴格按照吉凱基因慢病毒使用操作手冊進行。病毒感染72 h后,用6 μg/mL puromycin篩選細胞,并用3 μg/mL puromycin維持培養(yǎng)。構(gòu)建成為LLC-luc細胞。

小學語文選取的課文，大多都是來源于生活，是對生活的一種體驗。其實對于核心文化素質(zhì)的培養(yǎng)也是這樣，從生活中讓學生體驗到文化素質(zhì)的意義，那學生的綜合素質(zhì)和情感都會更進一步提升。在語文課堂上和平時生活中，教師可以讓學生仔細體會生活，通過對生活的感悟來提升自己的理解感知能力，從而激發(fā)情感，教化育人。例如，學習古詩《靜夜思》時，教師就可以運用體驗式教學，聯(lián)合學生的實際或者自身的故事，給學生講述離開親人的無奈與痛楚，從而引導學生對于掛念父母親人的這種思鄉(xiāng)之情的體會和理解。并激發(fā)出學生孝順父母的情感，達到情感和主旨的再次升華。這樣對于學生體驗式的培養(yǎng)，也有助于提高學生的核心素質(zhì)。

1.2.2 細胞注射懸液制備

將LLC-luc細胞培養(yǎng)至匯合度達到80%,用0.25%胰酶-EDTA(Gibco,美國)消化成為單細胞懸液。1200 r/min,5 min離心后保留細胞沉淀,用PBS(Gibco,美國)吹洗1次再離心后,用預冷PBS重懸計數(shù),使細胞濃度達到107/mL。Matrigel(BD,美國)提前置于4℃融化,用預冷槍頭按體積比1∶1與細胞懸液混合,制備成細胞注射懸液,置于冰上。

1.2.3 肺原位移植瘤模型構(gòu)建

模型選用C57BL/6J小鼠。手術(shù)前用1%戊巴比妥鈉注射液麻醉,注射劑量100 mg/kg。將小鼠左前肢腋下至肋骨下沿處皮膚備皮。小鼠向右側(cè)面位放置于小鼠立體定位儀操作臺面上,用乙醇和碘伏消毒,切開皮膚,肌肉,暴露左側(cè)肋骨。用30 g微量注射器吸取細胞注射懸液,于腋下第三、四肋骨間,垂直進針3.5 mm,緩慢注射10 μL細胞注射懸液,細胞注射量為5 × 104個。退針后縫合肌肉,皮膚(圖1A)。為確保注射位置正確,對進針小鼠進行CT照射,可見注射器針頭達胸腔左側(cè)肺位置(圖1B)。將術(shù)后小鼠放置于溫暖環(huán)境,待小鼠清醒后正常飼養(yǎng)。對照組小鼠執(zhí)行同樣手術(shù)操作,不注射細胞,僅注射PBS/Matrigel混合液10 μL。

圖1 小鼠肺原位腫瘤造模方法Note. A. Injection site of the othotopic cancer model. B. Injection site of the othotopic cancer model by CT imaging. Figure 1 Modeling of the othotopic cancer model

1.2.4 CT跟蹤原位移植瘤生長

分別于模型構(gòu)建第7、14、21天,用含2%異氟醚的醫(yī)用氧(1 L/min)麻醉小鼠,置于Inveon微型CT掃描儀上。采用360°旋轉(zhuǎn),240次旋轉(zhuǎn),2次縮小基質(zhì)尺寸,60 kV電壓,400 μA電流,曝光時間800 ms,視場30 mm × 30 mm,獲得小鼠胸部三維顯微CT圖像。采用中,高倍鏡采集18 min,獲得了30 μm的有效各向同性分辨率,所有后處理分析均采用高速CT重建系統(tǒng)(COBRA,SIEMENS臨床前解決方案)進行。

1.2.5 生物素酶活體熒光成像檢測

分別于模型構(gòu)建第7、14、21天,小鼠腹腔注射15 mg/mL濃度D-Luciferin,注射量為10 μL/g體重。注射10 min后,使用含2%異氟烷的醫(yī)用氧(1 L/min)誘導麻醉小鼠,使用PerkinElmer Lumina III小動物活體光學成像系統(tǒng)檢測小鼠體內(nèi)LLC-luc細胞活體熒光。

1.2.6 HE染色及免疫組化染色

腫瘤移植后第21天,小鼠脫頸處死后,取小鼠全肺置于福爾馬林中固定。經(jīng)過脫水浸蠟包埋切片后,對移植瘤肺部進行HE染色和免疫組化染色。免疫組化抗體為:CD3,CD19,F4/80,Ly6G+,Ki-67,CD31,α-SMA,vimentin,E-cadherin。

2 結(jié)果

2.1 同種原位移植腫瘤成功定植于左肺

LLC-luc細胞肺原位接種后第14天,CT影像學觀察原位移植小鼠胸腔,可見左側(cè)肺部存在單發(fā)性結(jié)節(jié)造影(圖2A),HE病理可見腫瘤邊緣存在一定浸潤性生長(圖2B)。解剖后與未接種腫瘤細胞的小鼠肺相比,明顯可見小鼠左側(cè)肺部存在單發(fā)性結(jié)節(jié)(圖2C)。HE病理結(jié)果表明,該肺上單發(fā)性結(jié)節(jié)為腫瘤組織,與正常小鼠肺組織相比其細胞核仁明顯,可見有絲分裂(圖2D)。LLC-luc細胞經(jīng)肺原位接種后成功定植于左肺。

圖2 正常肺與肺原位模型肺臟器對比Note. A. Comparison of horizontal, coronal and sagittal CT images between uninoculated tumor mice and othotopic lung model. Red arrow. Tumor angiography. B. HE results of the lung of the othotopic cancer model. Red arrow. Mitosis. Yellow arrow. Tumor infiltration. C. Comparison of the lungs of the unvaccinated tumor mice and the lungs of the orthotopic cancer model. Yellow arrows. Tumor nodules. D. Comparison of HE in lung tissues of unvaccinated tumor mice and the orthotopic cancer model. Red arrow. Mitosis.Figure 2 Comparison of the normal lung tissue and the lung tissue of the orthotopic cancer model

2.2 小鼠肺原位腫瘤分子影像學示蹤觀察

LLC-luc細胞肺原位移植后,分別于術(shù)后第7、14、21天進行CT影像學觀察(圖3A)。通過高速CT重建系統(tǒng)對CT造影體積進行計算,繪制出肺原位移植瘤的生長曲線,可觀察到肺原位移植瘤體積隨時間變化逐漸增長(圖3B)。通過熒光素酶活體熒光成像檢測術(shù)后第7、14、21天的LLC-luc細胞肺原位移植瘤模型小鼠,可見LLCluc細胞定植成功后,僅原位定植于肺部,且其發(fā)光強度隨著時間變化逐漸增強,說明腫瘤體積逐漸增長(圖3C)。

圖3 對小鼠肺原位腫瘤體積進行跟蹤觀察Note. A. Tumor growth of the lung of orthotopic cancer model by CT imaging. Red arrow. Tumor angiography. B. Tumor volume curve by CT imaging in the lung of orthotopic cancer model. C. In vivo imaging fluorescence of tumor growth.Figure 3 Observation of the volume of the othotopic cancer model in mice

2.3 肺原位腫瘤模型的免疫學特征

通過肺原位腫瘤免疫組化實驗探究腫瘤的免疫細胞浸潤情況,可以觀察到與正常肺組織相比,腫瘤內(nèi)部存在一定量的T細胞(圖4)浸潤,B細胞、巨噬細胞及中性粒細胞(圖4)浸潤不明顯。

圖4 肺原位模型的免疫學特征Figure 4 Immunological characteristics of the orthotopic lung cancer model

2.4 肺原位腫瘤模型增殖及微環(huán)境特征

通過對肺原位腫瘤進行免疫組化染色,與正常肺組織相比,可以觀察到原位腫瘤組織中Ki67呈陽性(圖5),腫瘤組織生長旺盛。通過CD31染色可見腫瘤內(nèi)部分布大量微小血管(圖5)。對腫瘤相關(guān)成纖維細胞標志物α-SMA染色可見(圖5),腫瘤組織中腫瘤相關(guān)成纖維細胞浸潤明顯。該腫瘤模型在腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化方面,腫瘤組織E-鈣黏蛋白表達缺失(圖5),波形蛋白Vimentin表達明顯(圖5),表明腫瘤組織在模型構(gòu)建過程中發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。文獻報道腫瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān),由此肺原位模型的腫瘤組織存在轉(zhuǎn)移的潛質(zhì)。

圖5 肺原位腫瘤模型增殖及微環(huán)境特征Figure 5 Characteristics of proliferation and microenvironment of the orthotopic lung cancer model

3 討論

合適的腫瘤動物模型對于肺癌研究有著不可或缺的作用。與皮下移植瘤腫瘤小鼠模型和肺轉(zhuǎn)移腫瘤模型相比,雖然肺癌原位小鼠模型在構(gòu)建技術(shù)上有一定難度,但是原位模型中腫瘤發(fā)生微環(huán)境更貼近于臨床肺癌的實際情況。不論是腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤免疫還是藥物呈遞過程,肺癌原位小鼠模型在模擬臨床病程的過程中均有一定的優(yōu)勢[3]。目前研究中常用的肺癌原位小鼠模型主要包括化學誘導模型、基因工程模型、肺原位移植瘤模型等[3]。其中化學誘導模型是通過注射或鼻飼致癌劑的方法,誘發(fā)小鼠肺癌。常用的致癌誘變劑有烏拉坦等[8-9]。該模型發(fā)病周期長、發(fā)生位點不明確、難以跟蹤監(jiān)測,且與大部分臨床病例腫瘤發(fā)生機制不符;基因工程模型是通過胚胎編輯技術(shù),對小鼠的癌基因進行突變,使得小鼠生長過程中自發(fā)肺癌。基因工程模型根據(jù)模型設(shè)計所需,可以定時定向突變肺部基因,肺癌發(fā)生機制與臨床相似。如K-ras突變肺癌模型是代表性模型之一[10],其模型與K-ras突變的臨床病例有著很高的相似性。然而該模型仍存在發(fā)病周期長,示蹤監(jiān)測困難等缺點[11]。近年來,肺原位移植瘤模型也逐漸出現(xiàn)在研究中。肺原位移植瘤模型則是通過原位注射或手術(shù)移植等方法,直接將肺癌細胞株原位接種定植于小鼠肺部[6-7]。相較于化學誘導模型和基因工程模型,該模型可以快速完成腫瘤的形成,且腫瘤定植位點明確,便于跟蹤監(jiān)測腫瘤生長。本文中的肺原位移植瘤模型,由于小鼠肺葉結(jié)構(gòu)為一葉左肺,四葉右肺,因此將肺癌組織單一接種于小鼠左肺,便于腫瘤生長位點的一致性。免疫組化染色證明,模型中腫瘤組織具有分裂旺盛,血供豐富,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生等特點。本模型構(gòu)建方法明確,可重復性好,利用分子影像學手段可對腫瘤生長進行明確地示蹤觀察,適用于腫瘤生長相關(guān)研究或化療藥的探索。因此,肺癌原位小鼠模型是研究肺癌發(fā)生發(fā)展的有力工具之一。

在腫瘤治療中,免疫系統(tǒng)起到多方面作用。一方面免疫細胞,包括T細胞、M1型巨噬細胞、DC細胞等,會對腫瘤組織起到殺傷作用,抑制腫瘤生長[12]。通過抑制免疫檢查點,例如PD-1/PD-L1的結(jié)合,能有效提高免疫細胞對腫瘤的殺傷作用[13]。另一方面,部分免疫細胞,例如M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞,在腫瘤生長及浸潤轉(zhuǎn)移方面會起到趨化效果[14]。因此本文的模型構(gòu)建選用的是免疫系統(tǒng)健全的C57BL/6J小鼠,以及該小鼠同源肺癌細胞系LLC細胞。相較于前人研究中,用人源肺癌細胞接種于免疫缺陷小鼠的模型[15],本模型特點在于免疫系統(tǒng)完全參與到了小鼠肺癌生長過程中,可明確觀察到免疫細胞對腫瘤組織的浸潤,對于腫瘤生長過程中的免疫系統(tǒng)作用的研究能起到有用的幫助,更好地模擬了臨床肺癌病例中遇到的問題和困難。

相較于其他肺癌原位模型,本模型亦存在不足,由于腫瘤細胞來源不是人源細胞,在模型構(gòu)建過程中,可能會由于人鼠之間的基因差異,導致分子機制存在差別。為了解決這個問題,在未來的研究中,我們將探索利用人源肺癌細胞和人源化小鼠,構(gòu)建免疫人源化肺原位移植瘤小鼠模型,為臨床前研究提供更符合臨床病例的研究工具。