栗敏，劉強(qiáng)，曹東東，邵夢(mèng)瑩，劉一帆，羅先香,2，李鋒民,2，鄭浩,2,*

1. 中國(guó)海洋大學(xué)近海環(huán)境污染控制研究所，海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266100 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室，青島 266237

微塑料(MPs)是指環(huán)境中<5 mm的塑料碎片或顆粒[1-2]，按其來源分為初生MPs和次生MPs[1]。初生MPs指直接排入環(huán)境中的塑料顆粒，如個(gè)人洗護(hù)產(chǎn)品中的塑料微珠和工業(yè)研磨劑等，次生MPs指環(huán)境中的塑料在物理、化學(xué)、生物因素的作用下破碎分解形成的小碎片和微粒[3]。由于其獨(dú)特的非天然聚合物結(jié)構(gòu)以及含有豐富的異生物質(zhì)，MPs具有“不易消亡或環(huán)境持久”的物理和化學(xué)綜合效應(yīng)[4]，可能對(duì)全球生態(tài)環(huán)境健康構(gòu)成重大風(fēng)險(xiǎn)，已經(jīng)成為全球性的熱點(diǎn)環(huán)境問題。最早MPs的研究主要聚焦于海洋和淡水生態(tài)系統(tǒng)[5]，陸地生態(tài)系統(tǒng)中MPs污染的研究起步較晚。然而，與水生生態(tài)系統(tǒng)相比，陸地生態(tài)系統(tǒng)可能更容易受到MPs的污染。據(jù)估計(jì)，每年釋放到陸地生態(tài)系統(tǒng)中的MPs豐度可能是釋放到水生生態(tài)系統(tǒng)中的MPs的4倍～23倍[6]。另外，陸地生態(tài)系統(tǒng)中的MPs也是水生生態(tài)系統(tǒng)中MPs污染的重要來源[7]。土壤MPs的污染現(xiàn)象廣泛存在，已在耕地、林地、草地和建設(shè)用地等土壤中均被檢出[8]。其中，農(nóng)田土壤系統(tǒng)被認(rèn)為是MPs的關(guān)鍵源匯之一[9]，也是MPs與土壤動(dòng)物、植物及微生物作用的熱點(diǎn)區(qū)域[10]。農(nóng)業(yè)地膜的殘留[11]、廢水灌溉[12]、土壤改良劑的使用[13]和大氣沉降[14]等是MPs進(jìn)入農(nóng)田土壤的主要途徑。聚乙烯(PE)地膜因其農(nóng)藝效益而被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)。據(jù)估計(jì)，20世紀(jì)末全世界每年有1.0×106t地膜用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[15]。僅在美國(guó)，2004年就使用了1.3×105t地膜[16]。在中國(guó)，地膜使用量在2015年增加到1.5×106t，地膜覆蓋面積達(dá)到1.8×107hm2以上[17]。地膜的大規(guī)模使用造成了土壤中MPs的廣泛殘留[10]。研究表明，MPs顆粒的累積及其化學(xué)添加劑(如抗氧化劑、穩(wěn)定劑和著色劑等)的浸出可顯著改變土壤理化性質(zhì)(如降低土壤容重、促進(jìn)水分蒸發(fā)和改變土壤結(jié)構(gòu)等)[18]，影響土壤碳(C)、氮(N)和磷(P)等養(yǎng)分元素的生物地球化學(xué)循環(huán)過程[19]，改變微生物群落結(jié)構(gòu)和土壤酶活性[20]，影響植物生長(zhǎng)[21]，危害土壤動(dòng)物生存[22]，進(jìn)而影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能。因此，關(guān)注MPs尤其是聚乙烯微塑料(PE-MPs)對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響，明確其潛在生態(tài)效應(yīng)對(duì)評(píng)估MPs的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

植物在生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)和信息傳遞中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，也是人類食物的重要來源。因此，了解MPs對(duì)植物，尤其是蔬菜等農(nóng)作物的影響，是MPs風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和目前研究的熱點(diǎn)[23]。近年來，越來越多的研究表明，MPs可通過直接或間接作用促進(jìn)或抑制植物生長(zhǎng)[21-28]。Qi等[21]率先關(guān)注了土壤MPs污染對(duì)作物生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)大顆粒(7 mm×6 mm)和小顆粒(0.05～1 mm)MPs暴露均顯著抑制了小麥(Triticumaestivum)的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)，且可生物降解地膜的抑制程度強(qiáng)于聚乙烯地膜。Boots等[22]隨后發(fā)現(xiàn)聚乳酸MPs(65.6 μm)可以抑制黑麥草(Loliumperenne)的發(fā)芽和地上部的生長(zhǎng)。更有甚者，Lozano和Rillig[24]發(fā)現(xiàn)MPs污染會(huì)改變植物群落結(jié)構(gòu)，影響植物物種的優(yōu)勢(shì)度。然而，一些研究也發(fā)現(xiàn)MPs污染促進(jìn)了植物的生長(zhǎng)。例如，de Souza Machado等[25]發(fā)現(xiàn)聚酰胺和聚酯MPs均不同程度地促進(jìn)了洋蔥(Alliumfistulosum)的生長(zhǎng)。Lian等[26]通過發(fā)芽和水培實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)聚苯乙烯納米塑料(PS-NPs)對(duì)小麥種子萌發(fā)沒有影響，但通過調(diào)節(jié)能量代謝和氨基酸代謝促進(jìn)了幼苗的生長(zhǎng)。植物根系由于具有固著、吸收和儲(chǔ)藏等多方面的功能，在植物生長(zhǎng)發(fā)育及對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[27]。Sun等[28]首次發(fā)現(xiàn)帶正電荷的PS-NPs會(huì)在擬南芥(Arabidopsisthaliana)根系聚集，誘導(dǎo)活性氧的積累和根系分泌物的產(chǎn)生，抑制植物生長(zhǎng)和幼苗發(fā)育；然而帶負(fù)電的PS-NPs對(duì)擬南芥的影響較小，但會(huì)通過質(zhì)外體途徑進(jìn)入維管束并在植物根系累積。Li等[23]發(fā)現(xiàn)微米及亞微米的塑料顆?？梢酝ㄟ^植物根系裂縫進(jìn)入根系，并通過蒸騰作用傳輸?shù)街参锏那o和葉中?？梢?，除對(duì)植物的直接毒性外，小粒徑的MPs還可能進(jìn)入植物體，破壞植物內(nèi)各細(xì)胞和分子的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。因此，植物毒性研究中關(guān)注MPs的粒徑效應(yīng)至關(guān)重要。另外，MPs對(duì)植物的影響也與其形狀、表面性質(zhì)、內(nèi)源污染物、濃度和植物類型等密切相關(guān)[24-28]。但是，目前MPs對(duì)植物生長(zhǎng)的影響及機(jī)制尚存在很多不確定性，MPs對(duì)土壤中高等植物特別是典型農(nóng)作物的直接毒性研究相對(duì)較少，對(duì)蔬菜種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)綜合影響的研究仍處于起步階段。

西紅柿(Lycopersiconesculentum)和辣椒(CapsicumannuumL.)是世界上最重要的蔬菜作物之一，在全球范圍內(nèi)的使用量逐年升高[29-30]。且其作為雙子葉植物的代表，研究MPs對(duì)其不同生長(zhǎng)階段的影響具有重要的科學(xué)意義。因此，本研究以PE-MPs為代表，利用發(fā)芽實(shí)驗(yàn)和盆栽實(shí)驗(yàn)探究不同粒徑的PE-MPs在不同污染濃度下對(duì)典型蔬菜西紅柿和辣椒種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的影響。研究結(jié)果將為農(nóng)業(yè)土壤生態(tài)系統(tǒng)中MPs生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用PE-MPs購(gòu)于上海陽勵(lì)機(jī)電科技有限公司，其由塑料原料微粒研磨制得。塑料粒徑分別為1 000目、250目和80目，分別命名為PE-S、PE-M和PE-L。供試土壤采自山東省招遠(yuǎn)市(37.43N, 120.33E)農(nóng)田表層土(0～20 cm)。土壤經(jīng)自然風(fēng)干后過2 mm篩備用。土壤pH為4.98，總碳(TC)為1.37%，總氮(TN)為0.17%。供試西紅柿和辣椒種子購(gòu)買于青島嶗山區(qū)北龍口種子站。

1.2 MPs的表征

利用ATR-FTIR光譜儀(Tensor 27，Bruker Optics，德國(guó))確定塑料類型。利用貝克曼分析儀(LS I3 320，Beckman Coulter，美國(guó))測(cè)定PE-MPs顆粒的粒徑分布。利用HITACHI S-4800掃描電鏡分析3種PE-MPs的表面形態(tài)結(jié)構(gòu)特征。利用元素分析儀(MicroCube，Elementar，德國(guó))測(cè)定PE-MPs中C和H的含量。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行，取平均值并計(jì)算PE-MPs樣品中的H/C的原子比。利用物理化學(xué)吸附儀(Autosorb-1C-TCD Ready，Quantachrome，美國(guó))通過N2吸附-解吸法測(cè)定其比表面積、孔體積和平均孔徑[31]。PE-MPs浸出液的提取和分析采用如下方法[32]：土壤和超純水以1∶5的比例在室溫下150 r·min-1震蕩30 min，靜置8 h，用0.45 μm醋酸纖維濾膜過濾得到土壤溶液。之后分別向含有30 mL超純水和土壤水溶液(土水比為1∶5)的頂空瓶中添加0.75 g PE-MPs，在室溫下150 r·min-1振蕩14 d，過0.45 μm醋酸纖維濾膜，收集濾液，以備溶解性有機(jī)碳(DOC)測(cè)定。分別使用pH計(jì)(AB150，Thermo Fisher Scientific，美國(guó))和TOC分析儀(Elementar TOC-Vcpn，Shimadzu，日本)以超純水和土壤溶液作為空白對(duì)照，測(cè)定浸出液pH值和DOC的含量。

1.3 發(fā)芽實(shí)驗(yàn)

本研究選取西紅柿和辣椒為受試植物進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)。發(fā)芽試驗(yàn)具體步驟如下：將種子浸泡在30%的H2O2中30 min進(jìn)行表面消毒，用蒸餾水沖洗5次后，于飽和CaSO4溶液中浸泡過夜后，用蒸餾水沖洗3次后備用。分別取不同質(zhì)量的PE-MPs配制濃度依次為0%、0.1%、0.5%、1%、2%和5%(m%)的懸浮液。于含有雙層無菌濾紙的培養(yǎng)皿(90 mm)中，分別放入20粒受試種子，隨后分別加入5 mL不同濃度的PE-MPs懸浮液。每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)平行。所有培養(yǎng)皿置于25 ℃的生物培養(yǎng)箱(KRC-250CL，Keelrein，中國(guó))中黑暗培養(yǎng)。西紅柿和辣椒分別培養(yǎng)12 d和14 d。每天補(bǔ)充水分，同時(shí)記錄西紅柿和辣椒種子的發(fā)芽數(shù)并在培養(yǎng)結(jié)束后量取幼苗的根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)。種子發(fā)芽勢(shì)(RE)、發(fā)芽率(GR)和種子活力指數(shù)(SVI)的計(jì)算利用如下公式[28]：

(1)

(2)

(3)

式中：M1為發(fā)芽過程中日發(fā)芽種子數(shù)最大時(shí)的發(fā)芽數(shù)量；M2為發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束時(shí)發(fā)芽種子的數(shù)量；M為供測(cè)種子總數(shù)；S為發(fā)芽種子莖長(zhǎng)；R為發(fā)芽種子根長(zhǎng)。

1.4 盆栽實(shí)驗(yàn)

選取上述西紅柿和辣椒種子進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)。具體步驟為：向供試土壤中分別加入不同質(zhì)量的PE-MPs，使其濃度依次為0%、0.1%、0.5%、1%、2%和5%(m%)。PE-MPs的濃度是依據(jù)農(nóng)田土壤中MPs的環(huán)境濃度(0.004%～1.88%)和植物毒理學(xué)試驗(yàn)暴露濃度(0～16%)確定的[8,33-34]。將80 g混勻后的土壤裝于預(yù)清洗的花盆(60 mm×28 mm×53 mm)中，加入蒸餾水使其達(dá)到最大持水量(WHC)的60%，活化2 d后，在每個(gè)花盆中播3粒種子。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。置于溫室中光照培養(yǎng)30 d。每天定時(shí)稱量澆水至60%WHC，且定期隨機(jī)改變花盆位置，盡量減小光照帶來的系統(tǒng)誤差。培養(yǎng)結(jié)束后，采集植物幼苗，分為地上部和地下部根系，記錄生物量鮮質(zhì)量。用蒸餾水將植株根系沖洗干凈，濾紙吸干水分，利用根系掃描儀(10000XL，Epson Scanning，日本)，運(yùn)用WinRHIZO軟件(Prp.2005，Regent，加拿大)分析根系形態(tài)。之后地上部和地下部于105 ℃下殺青30 min后，于60 ℃烘干至恒質(zhì)量，記錄生物量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016和Origin 2018進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的處理分析及圖表繪制。雷達(dá)圖可以用來反映某種污染物對(duì)生物相關(guān)參數(shù)的影響[35]。使用Origin 2018繪制PE-MPs對(duì)植物生長(zhǎng)綜合影響的雷達(dá)圖。采用SPSS 20.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析(Duncan檢驗(yàn)，P=0.05)。使用R 4.0.3軟件(Corrplot 軟件包)對(duì)PE-MPs的性質(zhì)和植物的各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果(Results)

2.1 微塑料的基本性質(zhì)

PE-MPs的FTIR光譜如圖1(a)所示。3種粒徑的PE-MPs均在2 920 cm-1和2 852 cm-1出現(xiàn)了較強(qiáng)的吸收峰，這主要是由于PE聚合物中—CH2—的C—H的不對(duì)稱振動(dòng)和C—H的對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起[36]。此外在1 466 cm-1和723 cm-1處也出現(xiàn)了2個(gè)較小的吸收峰，分別歸因于—(CH2)n—中的C—H的變形振動(dòng)和—(CH2)n—中的C—C的搖擺振動(dòng)。這些特征峰的出現(xiàn)與PE的標(biāo)準(zhǔn)紅外譜峰[36]及文獻(xiàn)報(bào)道中PE的特征峰一致[37]，說明所購(gòu)買的受試材料種類符合要求。另外，元素分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)PE-MPs的整體C含量達(dá)到了84.9%～85.3%，H含量為13.6%～16.2%(表1)，說明其含碳量較高，且與其他2種粒徑相比，PE-M的含碳量最大。3種PE-MPs的H∶C比為1.91～2.29，與根據(jù)其分子式計(jì)算的理論值非常接近[38]，進(jìn)一步說明這3種粒徑的塑料顆粒均為PE-MPs。通過粒徑分析發(fā)現(xiàn)PE-S、PE-M和PE-L的平均粒徑分別為23、54和155 μm(圖1(b)～(d))，符合預(yù)期的粒徑要求。SEM的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了粒徑的差異(圖1(e)～(j))。且觀察表面形貌可發(fā)現(xiàn)，PE-S表面褶皺，大多為不規(guī)則的微米級(jí)顆粒，片層狀及孔隙結(jié)構(gòu)較多，許多粒徑較小的顆粒聚合在一起形成粒徑略大的微球。PE-M的形狀大多數(shù)為近似球形，個(gè)別呈棒狀，表面有裂痕。PE-L多為近似球形或棒狀顆粒，但其表面相對(duì)光滑平整，裂隙結(jié)構(gòu)較少。這與比表面積分析的結(jié)果一致(表1)。PE-MPs的比表面積相對(duì)較小，整體約在0.543～1.363 m2·g-1，其中PE-S的比表面積最大。此外，PE-MPs的微孔體積和平均孔徑分別為0.0016～0.0120 cm3·g-1和9.06～35.1 nm，且隨粒徑降低，其微孔體積和平均孔徑逐漸增大(圖1(k)～(l))。

表1 聚乙烯微塑料(PE-MPs)的物理化學(xué)性質(zhì)Table 1 The physicochemical properties of polyethylene microplastics (PE-MPs)

此外，不同粒徑的PE-MPs在超純水中浸出液的pH存在差異(圖1(m))。與PE-M、PE-L相比，PE-S的pH較高，這可能是由于小粒徑的PE-MPs中的抗氧化劑和穩(wěn)定劑等添加劑(如二苯甲酮-3)更易釋放導(dǎo)致的[39]。土壤溶液中，不同粒徑的PE-MPs浸出液pH無顯著差異，這主要是因?yàn)橥寥廊芤壕哂幸欢ǖ木彌_能力。PE-MPs在超純水中DOC的釋放量為0.02～0.08 mg·g-1(以C計(jì))(圖1(n))。PE-S釋放的DOC濃度遠(yuǎn)高于PE-M和PE-L。Romera-Castillo等[40]在PE浸出液中檢測(cè)到低濃度的DOC(0.26～8.9 μg·cm-2(以C計(jì)))，這與我們的研究結(jié)果一致。另外，PE-MPs在土壤溶液中DOC的釋放量(0.14～0.32 mg·g-1(以C計(jì)))遠(yuǎn)高于超純水體系，這可能是由于土壤復(fù)雜的環(huán)境加劇了PE-MPs中添加劑的釋放。

圖1 PE-MPs的基本性質(zhì)注：(a) FTIR；(b)～(d) 粒徑分布；(e)～(j) SEM；(k) PE-MPs的N2吸附曲線；(l) PE-MPs的孔徑分布；(m) pH；(n)～(o) 溶解性有機(jī)碳(DOC)；不同字母表示不同處理之間存在顯著差異(P<0.05)。Fig. 1 Characterization of PE-MPsNote: (a) FTIR; (b)～(d) Size diameter; (e) ～(j) SEM; (k) N2 adsorption isotherms of PE-MPs; (l) Pore distribution of PE-MPs; (m) pH; (n)～(o) Dissolved organic carbon (DOC); different letters indicate significant difference between different treatments (P<0.05).

2.2 微塑料對(duì)西紅柿和辣椒種子發(fā)芽的影響

PE-MPs對(duì)2種作物種子發(fā)芽的影響如圖2所示。對(duì)西紅柿而言，PE-S僅在5%的暴露濃度下顯著抑制了種子RE和GR，抑制程度分別為31.1%和25.1%(圖2(a)～(b))。0.1%、1%、2%和5%暴露濃度下，西紅柿種子的莖長(zhǎng)顯著降低(圖2(c))，而在1%～5%的暴露濃度下，其根長(zhǎng)受到顯著抑制(圖2(d))。SVI可反映GR和生長(zhǎng)量的綜合狀況。PE-S僅在高濃度(5%)下顯著抑制了西紅柿的SVI，抑制率達(dá)到50.8%(圖2(e))。與PE-S相比，PE-M在1%～5%的暴露濃度下均顯著抑制了西紅柿種子的RE(圖2(a))，但僅在2%的暴露濃度下抑制西紅柿種子的GR，抑制率達(dá)到14.2%(圖2(b))。與RE類似，西紅柿的莖長(zhǎng)在1%～5%的暴露濃度下受到顯著抑制，抑制率為11.5%～34.7%(圖2(c))。但僅5%暴露濃度的PE-M顯著降低了其根長(zhǎng)(圖2(d))。此外，2%和5%濃度的PE-M暴露顯著降低了西紅柿的SVI(圖2(e))。對(duì)于PE-L，0.5%～5%濃度的MPs暴露均顯著抑制了西紅柿的RE、GR和種子根長(zhǎng)，抑制程度分別為16.1%～24.5%、13.7%～17.8%和7.82%～16.3%(圖2(a)～(b), 圖2(d))。但PE-L對(duì)西紅柿莖長(zhǎng)的影響呈現(xiàn)低促高抑的趨勢(shì)，在0.1%的濃度下顯著促進(jìn)了西紅柿莖長(zhǎng)，在2%和5%的暴露濃度下則對(duì)西紅柿莖長(zhǎng)呈現(xiàn)抑制效果(圖2(c))。此外，PE-L在1%～5%的暴露濃度下均不同程度降低了西紅柿的SVI，降低程度達(dá)到17.8%～33.7%(圖2(e))。且不同粒徑的PE-MPs在不同濃度下對(duì)西紅柿種子萌發(fā)的影響存在差異。在0.1%的暴露濃度下，PE-M顯著提高了西紅柿種子的GR。但在0.1%、1%和5%的暴露濃度下，與PE-L相比，對(duì)PE-S對(duì)西紅柿莖長(zhǎng)的抑制程度更大。而僅在5%的暴露濃度下，PE-MPs對(duì)西紅柿根長(zhǎng)的影響表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)。

對(duì)辣椒而言，PE-S僅在0.1%的暴露濃度下顯著提高了其RE，但在0.5%和5%的暴露濃度下顯著抑制了其GR(圖2(f)～(g))。且PE-S在5%的暴露濃度下均顯著抑制了辣椒的莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)和SVI(圖2(h)～(j))。區(qū)別于PE-S，PE-M對(duì)辣椒RE無顯著影響(圖2(f))，但在5%的濃度下顯著降低了辣椒的GR、莖長(zhǎng)和根長(zhǎng)(圖2(h)～(i))，且在0.1%、0.5%、2%和5%濃度的PE-M暴露下均顯著抑制了其SVI，抑制程度為9.27%～45.4%(圖2(j))。對(duì)PE-L而言，僅在5%的濃度下促進(jìn)了辣椒的RE(圖2(f))，但對(duì)其GR無顯著影響(圖2(g))。PE-L在高濃度(2%和5%)下均顯著抑制了辣椒種子莖的生長(zhǎng)(圖2(h))，但對(duì)根長(zhǎng)的影響呈現(xiàn)低濃度促進(jìn)高濃度抑制的趨勢(shì)(圖2(i))。此外，高濃度的PE-L也顯著抑制了辣椒的SVI，且在5%暴露濃度下抑制程度最大(圖2(j))。

圖2 PE-MPs對(duì)西紅柿(a)～(e)和辣椒(f)～(j)種子萌發(fā)的影響注：RE表示種子發(fā)芽勢(shì)；GR表示發(fā)芽率；SVI表示種子活力指數(shù)；不同字母表示不同處理之間存在顯著差異(P<0.05)。Fig. 2 Effect of PE-MPs on seed germination of tomato (a)～(e) and pepper (f)～(j)Note: RE stands for germination potential; GR stands for germination rate; SVI stands for seedling vigour index; different letters indicate significant difference between different treatments (P<0.05).

不同粒徑的PE-MPs在不同濃度下對(duì)辣椒種子萌發(fā)的影響存在差異。在5%的暴露濃度下，與PE-M和PE-L相比，PE-S顯著降低了辣椒種子RE和SVI。此外，高濃度(5%)暴露下，PE-M和PE-S對(duì)辣椒根長(zhǎng)的影響也存在顯著差異，與PE-M相比，PE-S對(duì)其抑制程度更大。

2.3 微塑料對(duì)農(nóng)作物幼苗生長(zhǎng)的影響

為了更好地模擬植物在MPs污染土壤中的生長(zhǎng)狀況，本研究通過盆栽實(shí)驗(yàn)，探究了3種粒徑PE-MPs對(duì)農(nóng)作物幼苗生長(zhǎng)的影響(圖3)。結(jié)果顯示，對(duì)西紅柿而言，僅5%暴露濃度的PE-S顯著抑制了其株高和地上部鮮質(zhì)量，抑制程度分別為19.1%和28.7%。但對(duì)地下部鮮質(zhì)量和植物干質(zhì)量無顯著影響(圖3(a)～(c))。而不同濃度的PE-M暴露對(duì)西紅柿幼苗生長(zhǎng)無顯著影響。此外，不同濃度PE-L暴露對(duì)西紅柿株高和幼苗干質(zhì)量無顯著影響，但0.5%暴露濃度的PE-L會(huì)顯著促進(jìn)西紅柿地上部鮮質(zhì)量，且在0.1%、1%和2%的暴露濃度下對(duì)其地下部分鮮質(zhì)量的抑制程度最大(圖3(a)～(c))。對(duì)辣椒而言，不同濃度的PE-S暴露對(duì)其株高、幼苗鮮質(zhì)量和地下部鮮質(zhì)量無顯著影響，但5%暴露濃度的PE-S會(huì)顯著抑制辣椒地上部鮮質(zhì)量，抑制程度達(dá)到40.1%(圖3(d)～(f))。而PE-M和PE-L對(duì)辣椒幼苗生長(zhǎng)無顯著影響。

圖3 PE-MPs對(duì)西紅柿(a)～(c)和辣椒(d)～(f)幼苗生長(zhǎng)的影響注：不同字母表示不同處理之間存在顯著差異(P<0.05)。Fig. 3 Effect of PE-MPs on seedling growth of tomato (a)～(c) and pepper (d)～(f)Note: Different letters indicate significant difference between different treatments (P<0.05).

2.4 微塑料對(duì)植物根系的影響

PE-MPs對(duì)幼苗根系形態(tài)的影響如表2所示。在2%和5%的暴露濃度下，PE-S會(huì)顯著促進(jìn)西紅柿的根長(zhǎng)，促進(jìn)程度分別為57.4%和39.2%。但不同濃度的PE-S暴露對(duì)西紅柿根體積、根面積和根尖數(shù)均無顯著影響。此外，不同濃度下PE-M和PE-L暴露對(duì)西紅柿根系形態(tài)無顯著影響(表2)。對(duì)辣椒而言，在不同暴露濃度下，不同粒徑的PE-MPs對(duì)辣椒根系形態(tài)均無顯著影響(表2)。

表2 PE-MPs對(duì)西紅柿和辣椒根系發(fā)育的影響Table 2 Effects of PE-MPs on root development of tomato and pepper

不同粒徑PE-MPs對(duì)作物發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)階段的綜合影響如圖4所示。不同濃度PE-MPs暴露下，西紅柿和辣椒的生長(zhǎng)狀況存在差異。對(duì)西紅柿而言，高濃度的PE-S和PE-L暴露均抑制了其生長(zhǎng)，而PE-M對(duì)其影響程度較小。對(duì)辣椒而言，在高濃度下不同粒徑的PE-MPs均顯著抑制其生長(zhǎng)，且PE-S對(duì)其影響程度較大。PE-MPs對(duì)作物的影響與培養(yǎng)環(huán)境相關(guān)，在更為復(fù)雜的土壤環(huán)境中，PE-MPs對(duì)作物的影響程度減弱。這一結(jié)果與發(fā)芽和盆栽實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致。對(duì)PE-MPs特性與植物生長(zhǎng)參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析(圖5)，發(fā)現(xiàn)PE-MPs粒徑與RE呈顯著負(fù)相關(guān)，與發(fā)芽莖長(zhǎng)呈顯著正相關(guān)，平均孔徑影響程度與之相反，這說明在發(fā)芽實(shí)驗(yàn)中粒徑越小、平均孔徑越大，對(duì)種子萌發(fā)的影響程度越大。此外，在幼苗生長(zhǎng)階段，PE-MPs的比表面積與株高呈顯著正相關(guān)，微孔體積與地下鮮質(zhì)量和地上干質(zhì)量呈顯著正相關(guān)，這說明在土壤環(huán)境中MPs的孔隙越多，可能越有利于植物生長(zhǎng)。

圖4 PE-MPs對(duì)西紅柿(a)～(c)和辣椒(d)～(f)種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)影響的總覽圖Fig. 4 Overview of the effects of PE-MPs on germination and seedling growth of tomato (a)～(c) and pepper (d)～(f)

3 討論(Discussion)

3.1 微塑料對(duì)西紅柿和辣椒種子發(fā)芽的影響

種子萌發(fā)是植物生長(zhǎng)、發(fā)育繁殖的決定性過程，是植物生命周期中最關(guān)鍵的階段[41]，對(duì)生物多樣性的形成具有重要的生態(tài)意義。污染物對(duì)種子萌發(fā)的影響是判斷其對(duì)植物毒性效應(yīng)的首要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)隨著暴露濃度的增加，PE-MPs對(duì)植物種子萌發(fā)率和活力抑制程度增強(qiáng)(圖2)。這可能是由于PE-MPs在種子表皮和根毛上積累，造成物理堵塞，降低種子活性導(dǎo)致的(圖2)。這與Bosker等[42]的研究結(jié)果一致，其發(fā)現(xiàn)MPs可能在水芹種子(LepidiumsativumL.)的表皮和根系積累，抑制種子萌發(fā)和根系生長(zhǎng)。此外，PE-MPs對(duì)種子發(fā)芽的抑制效果也可能與其有毒添加劑的浸出高度相關(guān)。在發(fā)芽后期，高濃度(5%)MPs對(duì)幼苗莖長(zhǎng)和根長(zhǎng)抑制最顯著，這可能是由于PE-MPs有毒添加劑的釋放導(dǎo)致了活性氧積累[26]，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生氧化應(yīng)激[20]，且碳水化合物相關(guān)代謝酶活性受限，損害了植物自身的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[43]。Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)MPs粒徑與種子RE呈顯著負(fù)相關(guān)，與發(fā)芽種子莖長(zhǎng)呈正相關(guān)，說明PE-MPs的粒徑對(duì)種子萌發(fā)具有重要影響(圖5)。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能是由于PE-MPs粒徑越大，在種子表皮越易聚集，物理堵塞效果更強(qiáng)，導(dǎo)致發(fā)芽勢(shì)顯著降低。但隨根系的伸長(zhǎng)及根毛的發(fā)育，物理堵塞對(duì)其影響程度逐漸減小。MPs添加劑的積累誘導(dǎo)的氧化損傷成為抑制種子發(fā)芽的主要因素。PE-MPs的粒徑越小，其浸出液的pH越高、DOC含量越大，對(duì)植物根系的損傷可能越劇烈。此外，小粒徑的MPs更易進(jìn)入植物組織[23]，并在根中積累，堵塞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸，因而，粒徑越小，對(duì)發(fā)芽種子莖長(zhǎng)的抑制程度越強(qiáng)。目前已有大量研究表明，納米(1～100 nm)、亞微米(100 nm～1 μm)和微米(1～5 μm)尺寸的MPs可被擬南芥、小麥等植物根系吸收，并通過蒸騰作用在植物體內(nèi)遷移擴(kuò)散[22, 28]。微塑料進(jìn)入植物體的方式主要包括質(zhì)外體途徑、木質(zhì)部通路和裂縫進(jìn)入模式[22, 26, 28]。本研究發(fā)現(xiàn)，在5%的暴露濃度下，與其他2種粒徑相比，PE-S對(duì)種子萌發(fā)的抑制程度更大，這可能是由于PE-S中存在的亞微米級(jí)塑料(圖2(a)～(b))，通過質(zhì)外體通路及裂縫進(jìn)入模式在作物中積累，進(jìn)而抑制植物生長(zhǎng)[22, 28]。然而，Lian等[26]研究發(fā)現(xiàn)0.01～10 mg·L-1的PS-NPs對(duì)小麥種子萌發(fā)沒有影響，且對(duì)其幼苗生長(zhǎng)呈現(xiàn)促進(jìn)效果。這主要是由于PS-NPs暴露調(diào)節(jié)了小麥能量代謝和氨基酸代謝水平，加速了能量的產(chǎn)生過程。這種差異可能與植物和MPs的類型差異有關(guān)。不同植物具有不同的種皮結(jié)構(gòu)和根結(jié)構(gòu)，對(duì)外界脅迫的響應(yīng)存在差異。而不同種類的MPs由于顆粒本身化學(xué)結(jié)構(gòu)及添加劑的不同對(duì)植物的影響存在差異。因此，為了更好地了解土壤-植物系統(tǒng)中塑料殘留對(duì)植物萌發(fā)的影響，需要進(jìn)一步研究不同粒徑和類型的MPs暴露對(duì)不同植物的生態(tài)效應(yīng)。

圖5 PE-MPs特性與植物生長(zhǎng)參數(shù)的相關(guān)性分析注：從藍(lán)色到紅色代表皮爾遜相關(guān)系數(shù)從-1到1的變化，*表示P<0.05。Fig. 5 Pearson correlation analysis of basic properties of PE-MPs and plant growthNote: Colors from blue to red represent changes in the Pearson correlation coefficient from -1 to 1, and * represents P<0.05.

3.2 微塑料對(duì)作物幼苗生長(zhǎng)的影響

作物幼苗期是其生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，幼苗期作物的生長(zhǎng)發(fā)育直接影響果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)，是植物生命周期中的重要階段。由于幼苗期作物的脆弱性和敏感性，探究該階段污染物對(duì)幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響對(duì)于明確污染物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)具有重大意義。大量的研究發(fā)現(xiàn)氧化鋅、氧化鈦等納米顆粒暴露可以內(nèi)化到植物中，在植物幼苗和細(xì)胞水平上造成毒性效應(yīng)[44]。區(qū)別于納米材料，MPs具有非天然聚合物結(jié)構(gòu)以及含有豐富的異生物質(zhì)，具有物理和化學(xué)綜合效應(yīng)，其對(duì)幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響不容忽視[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，5%暴露濃度的PE-S會(huì)顯著抑制西紅柿和辣椒幼苗的生長(zhǎng)。這可能是由于PE-MPs在植物根部聚集，阻礙植物對(duì)水分及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收進(jìn)而抑制植物生長(zhǎng)[45](圖6)。此外，MPs添加劑如抗氧化劑(三亞磷酸酯、二十八烷基二硫化物)、穩(wěn)定劑(氧化鈣、碳酸鎂)、阻燃劑(氫氧化鋁、三氧化二銻)和著色劑(銅、不溶性有機(jī)顏料)等的浸出也是抑制植物生長(zhǎng)的重要因素[46]。這些化學(xué)物質(zhì)可能改變幼苗中活性氧(ROS)代謝酶的活性[28]，擾亂植物中的氧化還原穩(wěn)態(tài)[20]、碳水化合物代謝和植物激素調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)而抑制其生長(zhǎng)[43]。此外，進(jìn)入土壤中的MPs還可以通過改變土壤結(jié)構(gòu)，影響土壤肥力和養(yǎng)分，改變土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)影響植物生長(zhǎng)[18-20]。本研究中，與發(fā)芽實(shí)驗(yàn)相比，盆栽實(shí)驗(yàn)PE-MPs對(duì)作物的毒性顯著降低(圖2和圖3)。這可能是由于土壤作為一個(gè)較復(fù)雜的生態(tài)體系，作物在其中的生長(zhǎng)受到土壤理化性質(zhì)、酶和微生物等多種因素的調(diào)節(jié)。PE-MPs暴露后，能有效促進(jìn)土壤團(tuán)聚體的形成，降低植物根部的穿透阻力，改善土壤通氣性，進(jìn)而降低PE-MPs對(duì)植物的毒性[18]。目前大量的研究基于水培體系[26, 41, 44]，由于培養(yǎng)體系相對(duì)單一，忽視了MPs在復(fù)雜土壤環(huán)境中的生態(tài)效應(yīng)，可能高估了MPs的生態(tài)毒性。此外，微生物在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，PE-MPs暴露可能緩解其他污染物對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，進(jìn)而緩解植物微生物組的變化，調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育[47]。Dong等[48]發(fā)現(xiàn)聚苯乙烯、聚四氟乙烯和砷共同暴露降低了土壤中變形菌門(Proteobacteria)的豐度，增加了綠彎菌門(Chloroflexi)和酸桿菌門(Acidobacteria)的豐度，且MPs的加入抑制了砷對(duì)根際土壤微生物和化學(xué)性質(zhì)的影響。MPs對(duì)土壤的影響很大程度上取決于MPs的濃度和暴露時(shí)間[9]。本研究中，可能由于土壤復(fù)雜的物理環(huán)境，微生物的作用促進(jìn)了土壤C、N、P等養(yǎng)分循環(huán)，提升了土壤的養(yǎng)分有效性[19]。土壤作為一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，殘留的MPs也可能富集其他污染物(如抗生素、有機(jī)污染物)[49]，部分耐藥菌及人類致病菌也可能在其上定殖，從而加劇MPs的植物毒性[4]，這需要未來進(jìn)一步研究。

圖6 PE-MPs對(duì)植物生長(zhǎng)的影響Fig. 6 Effect of PE-MPs on plant growth

植物多樣性是陸地生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵屬性，有超過30萬種可食用的植物，構(gòu)成了人類的主要食物來源[50]。因植物具有較高的遺傳多樣性，它們對(duì)外界刺激和環(huán)境脅迫的反應(yīng)可能不同，因此預(yù)期會(huì)出現(xiàn)物種依賴性反應(yīng)[51]。本研究發(fā)現(xiàn)，PE-MPs對(duì)西紅柿和辣椒的毒性效果存在差異(圖3)。不同植物的種皮結(jié)構(gòu)和根系結(jié)構(gòu)(木質(zhì)部和韌皮部)的差異可能會(huì)影響種皮對(duì)污染物的滲透能力，這可能是導(dǎo)致物種依賴反應(yīng)的關(guān)鍵因素之一[44]。不同植物除了遺傳多樣性的差異外，種子大小也可能是影響種子萌發(fā)和生長(zhǎng)的重要因素。粒徑較小的種子因具有較高的表面積與體積比而有助于促進(jìn)植物與污染物的相互作用[51]。另外，目前的研究大多只關(guān)注了MPs暴露對(duì)單一植物生長(zhǎng)的影響，忽視了MPs對(duì)植物群落的影響。當(dāng)前僅有一篇文章報(bào)道了MPs暴露會(huì)改變溫帶草原生態(tài)系統(tǒng)中植物群落的結(jié)構(gòu)，影響植物物種的優(yōu)勢(shì)度，但對(duì)于其他環(huán)境尤其是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中植物群落的影響尚無報(bào)道。因此，在以后的實(shí)驗(yàn)中要關(guān)注不同種類植物對(duì)MPs的響應(yīng)，尤其應(yīng)關(guān)注MPs對(duì)植物群落的影響，以加深對(duì)MPs在土壤-植物生態(tài)系統(tǒng)中的環(huán)境行為和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的認(rèn)識(shí)。

3.3 微塑料對(duì)植物根系的影響

根系是植物的重要組成部分，它具有固著、支撐、吸收、輸導(dǎo)、合成、儲(chǔ)藏和繁殖等多方面的功能，在生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)和能量循環(huán)中發(fā)揮著十分重要的作用[27]。植物面對(duì)環(huán)境脅迫時(shí)可以通過促進(jìn)根系延伸來應(yīng)對(duì)壓力環(huán)境[52]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著暴露濃度的增加，PE-S會(huì)顯著促進(jìn)西紅柿幼苗根系的伸長(zhǎng)，而對(duì)辣椒而言，PE-M對(duì)其影響更大(表2)。這可能是由于進(jìn)入土壤中的PE-MPs降低了土壤容重，增加了土壤孔隙度和通氣性[18]，促進(jìn)了植物根系在土壤中的延伸，誘導(dǎo)根系脅迫導(dǎo)致的。此外，也有大量研究表明MPs暴露會(huì)降低植物根系水通道蛋白的活性，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，改變根系抗氧化酶的含量，降低根系生物量[20, 42]。如Sun等[28]研究發(fā)現(xiàn)PS-NH2納米塑料可以誘導(dǎo)根系分泌物的形成，促進(jìn)根中活性氧的積累，改變根表皮細(xì)胞的形狀，促進(jìn)根成熟區(qū)腫脹，加劇根系損傷。MPs對(duì)植物根系的影響可能與塑料類型、粒徑、濃度以及植物種類有關(guān)。因此，在以后的實(shí)驗(yàn)中要關(guān)注不同種類和粒徑的MPs對(duì)植物根系形態(tài)及發(fā)育的影響，以明確MPs對(duì)植物生長(zhǎng)的潛在脅迫。

本研究采用不同濃度的PE-MPs探究其對(duì)不同植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響。然而，本研究未測(cè)定PE-MPs暴露前后土壤相關(guān)指標(biāo)的變化情況以及微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，不能確定影響幼苗生長(zhǎng)的直接或間接因素，也未考慮MPs顆粒本及其添加劑對(duì)植物生長(zhǎng)影響的貢獻(xiàn)。因此。未來的研究應(yīng)進(jìn)一步揭示MPs特性及其添加劑釋放的規(guī)律，明確MPs性狀與毒性效應(yīng)之間的內(nèi)在機(jī)制，揭示MPs顆粒本身與添加劑對(duì)植物生長(zhǎng)影響的貢獻(xiàn)度。此外，本研究的另一個(gè)局限是選取單一塑料在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，未來的研究中應(yīng)該選取不同類型的MPs進(jìn)行田間實(shí)驗(yàn)，確定不同種類的微塑料對(duì)自然條件下植物生長(zhǎng)的影響。