劉偉，李淼，李桂祥，董曉民，高曉蘭，張安寧

（山東省果樹研究所，山東 泰安 271000）

桃（Prunus persica）是薔薇科桃屬的重要果樹之一，中國為桃最為重要的發(fā)源地，種質(zhì)資源豐富，類型多樣［1］，目前已在北京、南京和鄭州建立了國家級的桃種質(zhì)資源庫［2］。山東省是我國桃的重要產(chǎn)區(qū)之一，存在很多地方品種，其中最具代表性的是肥城桃、青州蜜桃、梁山蜜桃、蒙陰蜜桃等［3］。隨著我國桃育種技術(shù)的進步，優(yōu)良桃品種的選育和推廣栽培進展迅速，桃種質(zhì)資源的交流愈發(fā)頻繁，一些經(jīng)濟性狀良好的新品種取代了傳統(tǒng)的地方品種［4］，導致地方品種栽培面積急劇萎縮，種質(zhì)資源流失嚴重。而地方桃種質(zhì)資源具有突出的優(yōu)良性狀，是育種的重要基因庫，因此，為防止地方品種資源的進一步流失，收集、鑒定、評價地方桃種質(zhì)資源成為山東省桃品種資源和育種工作的重要課題之一。

傳統(tǒng)的形態(tài)學特征鑒定等雖然方法簡單，但極易受環(huán)境影響，同時需要專業(yè)的背景知識，實際應用受到很大限制。近年來，以PCR為代表的分子標記技術(shù)廣泛應用，為桃種質(zhì)資源的鑒定、親緣關(guān)系的遺傳分析等提供了良好的技術(shù)手段。其中，SSR（simple sequence repeats，簡單序列重復）標記呈現(xiàn)出多態(tài)性良好、檢測方便、穩(wěn)定性高等特點［5］，尤其是SSR熒光標記技術(shù)，可進行大批量樣本的精準檢測，在蘋果［6］、葡萄［7］、梨［8］等果樹的研究中發(fā)揮了重要作用。

目前，SSR熒光標記技術(shù)已經(jīng)成為桃屬植物遺傳多樣性和親緣關(guān)系評價的重要方法之一［9－11］，但基于該項技術(shù)構(gòu)建山東省桃種質(zhì)資源身份證并進行種質(zhì)鑒定的相關(guān)研究還未見報道。構(gòu)建山東地方桃種質(zhì)資源身份證，不僅有利于資源的合理利用和保護，而且能夠促進未來育種工作的進一步發(fā)展。因此，本研究通過篩選得到的多態(tài)性良好的10對SSR引物進行PCR擴增，利用SSR熒光標記毛細管電泳技術(shù)對擴增帶型進行分析，結(jié)合帶型編碼，構(gòu)建了60份山東省桃種質(zhì)資源的分子身份證，并進行聚類分析，旨在從分子水平對山東省桃種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進行探討，為資源的合理保護、正確評價和科學育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019年7月至2020年7月在山東省果樹研究所進行，所用60份桃種質(zhì)材料（表1）采自山東省果樹研究所桃種質(zhì)資源圃、肥城桃園藝所及青州市、梁山縣桃產(chǎn)地。每個品種選取幼嫩莖尖葉片，迅速液氮冷凍，帶回實驗室置于－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗所用桃種質(zhì)材料名稱及類型

1.2 SSR引物合成及篩選

采用HiPure Plant DNA Mini Kit（Magen）提取桃莖葉的基因組DNA，純化后克隆篩選，建立SSR富集文庫，從中開發(fā)并設計分布于桃16個連鎖群的30對引物。隨機選擇4份樣品（1，7，41和43）的總DNA，用30對引物進行PCR擴增，經(jīng)SDS－PAGE分析擴增條帶，篩選出擴增條帶清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性高的10對引物用于樣品擴增。正向引物的5′端加1個FAM熒光標記，所用引物均由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成（表2）。

表2 引物信息

1.3 DNA提取以及PCR體系

采用HiPure Plant DNA Mini Kit（Magen）提取樣品總DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計檢測DNA質(zhì)量和濃度，并稀釋至50 ng·μL－1，－20℃保存?zhèn)溆?。SSR－PCR反應體系（共25μL）：ddH2O 19.3μL，dNTP（2.5 mmol·L－1）1μL，Taq酶10×Buffer 2.5μL，正、反向引物（20 μmol·L－1）各0.5μL，DNA模板1μL，Taq酶0.2 μL。PCR擴增程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，54℃退火35 s，72℃延伸40 s，35個循環(huán)；72℃延伸3 min。

1.4 SSR熒光標記毛細管電泳檢測

對PCR擴增產(chǎn)物進行純化，將甲酰胺與分子質(zhì)量內(nèi)標按100∶1的體積比混勻后，取15μL加入上樣板中，再加入1μL稀釋10倍的擴增產(chǎn)物，毛細管電泳儀ABI3730XL進行電泳分析。待電泳結(jié)束后，利用GeneMarker中的Fragment（Plant）片段分析軟件對毛細管電泳的原始數(shù)據(jù)進行分析，將分子質(zhì)量內(nèi)標Marker的位置與各樣品峰值的位置做比較，讀取片段大小。利用POPGENE 32軟件分析數(shù)據(jù)，獲得引物擴增的等位基因數(shù)、擴增帶型及樣品在不同SSR位點的基因多樣性、多態(tài)性信息含量和香農(nóng)指數(shù)。

1.5 分子身份證構(gòu)建

利用10對引物對60份樣品進行擴增，得到各樣品的指紋數(shù)據(jù)，將指紋數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為數(shù)字編碼，即分子身份證。轉(zhuǎn)換方法如下：將每對引物在某一樣品上擴增出的每一種帶型用阿拉伯數(shù)字1～9編碼，為保證每一種帶型只占一位數(shù)字，當帶型數(shù)大于9時，分別用a、b、c代表第10、11、12種帶型，依此類推，無帶用0表示；按照引物擴增帶型數(shù)由少到多的順序，將每個樣品在10對引物上的擴增帶型編碼串聯(lián)起來，即得到每個樣品以10位數(shù)字或字母表示的分子身份證［12］。

1.6 聚類分析

用NTSYS－pc Version 2.1軟件對SSR位點進行分析，以Dice相似系數(shù)采用非加權(quán)平均法（UPGMA）對60份桃種質(zhì)進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛細管電泳結(jié)果

如表3所示，利用10對SSR引物對60份桃種質(zhì)進行擴增，共檢測到58個等位位點，每對引物得到的等位位點在2～8個之間，平均每對引物5.8個；共擴增得到116個帶型，每對引物得到的帶型在3～18個之間，平均每對引物11.6個，擴增片段長度在109～270 bp之間。圖1為引物對P29對55和56號樣品的擴增帶型分析結(jié)果。10對引物的多態(tài)性信息含量在0.2044～0.7378之間，平均為0.5699；Nei’s基因多樣性指數(shù)在0.2311～0.7692之間，平均為0.6103；香農(nóng)指數(shù)在0.3927～1.6403之間，平均為1.2266。表明10對SSR引物為高多態(tài)性引物［13］，能夠有效顯示出60份桃種質(zhì)的遺傳多樣性。

表3 10對SSR熒光引物對60份山東桃種質(zhì)的擴增結(jié)果

圖1 引物P29對不同樣品擴增產(chǎn)物的帶型分析

2.2 分子身份證編碼

按照表2所示的引物順序，將每對引物在不同樣品上擴增得到的帶型按照由少到多的順序排列并將其編碼進行串聯(lián)，即得到60份桃種質(zhì)資源的分子身份證（表4）。對應位置編碼相同則表明該引物在不同樣品上得到了相同的擴增帶型。結(jié)果（表5）表明，在供試的60份山東地方桃種質(zhì)資源中，得到了44個不同類型的分子身份證代碼，其中，基地3號肥桃、基地5號肥桃、基地4號肥桃、基地7號－肥桃、基地6號－肥桃與香肥桃共享同一分子身份證代碼；肥17號、肥47、肥51－82、肥51－28與大葉白里肥桃共享同一分子身份證代碼；5311與大葉紅里肥桃共享同一分子身份證代碼；梁山蜜桃4號、梁山蜜桃3號、梁山蜜桃2號、梁山蜜桃1號分子身份證代碼相同；中華壽桃和寒露蜜分子身份證代碼相同；珍品王桃和蓬仙15分子身份證代碼相同；秋彤和肥39分子身份證代碼相同，但這兩個品種有待于進一步驗證。通過分子身份證代碼，將供試的60份山東地方桃種質(zhì)進行了合理的區(qū)分。

表4 10對SSR引物的擴增帶型

表5 供試60份桃種質(zhì)的分子身份證代碼

2.3 聚類分析

根據(jù)10對SSR引物對60份山東桃種質(zhì)的擴增數(shù)據(jù)，以Dice相似系數(shù)采用UPGMA聚類，得到桃系統(tǒng)關(guān)系樹，如圖2所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，在遺傳相似系數(shù)為0.46時，可以將60份山東地方桃種質(zhì)資源分為5組：第Ⅰ組包括3個品種，分別為1、2號和32號；第Ⅱ組24個品種，包含17個肥城桃品種，并聚為一支，其中，19、20、21、22、23、30號親緣關(guān)系較近，24、29、31、35號親緣關(guān)系較近，26、27、33號親緣關(guān)系較近，說明肥城桃群體基因組相對保守，受外來品種基因組滲入影響較小；第Ⅲ組包含9個桃品種，分別是4、6、40、16、17、54、39、38、36號，其中，4號和6號親緣關(guān)系較近，16號和17號親緣關(guān)系較近；第Ⅳ組包含22個桃品種，其中，48、49、50、51、52、53、55、57號為8個美國遺傳背景的桃品種，與山東本地桃背景相差較大，區(qū)分明顯；第Ⅴ組包含2個品種，分別是25號和56號，這兩個品種可能存在其他基因組的滲入，與其他桃品種相差較大?？梢?，聚類分析結(jié)果與分子身份證代碼分析結(jié)果相符，共享同一分子身份證代碼的品種在系統(tǒng)關(guān)系樹中遺傳相似系數(shù)相同。

圖2 基于10對SSR引物的60份山東桃種質(zhì)聚類分析結(jié)果

3 討論

SSR標記技術(shù)兼顧高準確性和高穩(wěn)定性。目前，SSR擴增產(chǎn)物的檢測主要有銀染技術(shù)和熒光標記技術(shù)2種，銀染技術(shù)分析效率較低，無法進行批量操作，且有害人體健康；熒光標記技術(shù)解決了銀染技術(shù)存在的種種問題，更適合多樣本操作，同時具有更高的靈敏度和準確性。郝晨陽等［14］對銀染技術(shù)和SSR熒光標記技術(shù)進行了詳細對比，證實SSR熒光標記技術(shù)處理效率更高，更加經(jīng)濟實惠。魯敏等［15］對40份梨種質(zhì)資源的研究也表明，SSR熒光標記技術(shù)得到的數(shù)據(jù)重復性和準確性均較高。結(jié)合本試驗結(jié)果，SSR熒光標記技術(shù)能夠準確高效地對擴增帶型進行大小判別。

近年來，桃種質(zhì)資源的SSR引物數(shù)量增長迅速［16］；盡管桃基因組相應染色體上都標記有大量的SSR位點信息，但實際研究中可用的SSR數(shù)量仍然較少，因此，相應研究將有助于桃目的基因定位、種質(zhì)資源鑒定以及遺傳進化等課題的開展［17］。葉宇蕓等［18］通過NCBI數(shù)據(jù)庫的ESTs信息開發(fā)了20對SSR引物，并用于對成都平原主栽的40份桃種質(zhì)進行分子身份證構(gòu)建，得到平均等位基因數(shù)3.4個；李雄偉等［19］通過48個SSR標記對國內(nèi)外669份桃品系的遺傳多樣性進行分析，篩選出16個多態(tài)性高的標記，可用于構(gòu)建基于SSR分子標記的桃種質(zhì)分子指紋數(shù)據(jù)庫；陳霽等［20］利用16對SSR引物對42份觀賞桃品種進行擴增，得到平均等位基因數(shù)7.75個。本研究通過10對SSR引物構(gòu)建了60份山東桃種質(zhì)的分子身份證，共檢測得到58個SSR等位位點和116個擴增帶型，平均每對引物得到SSR等位位點5.8個，擴增帶型11.6個。

通常認為，當位點多態(tài)性信息含量＞0.5時，該引物即為高度多態(tài)性信息引物［21］。本研究中，10對SSR引物平均多態(tài)性信息含量為0.5699，其中多態(tài)性信息含量大于0.5的有8對，占比80%，充分說明本研究所采用的SSR引物多態(tài)性較高，能夠有效地對60份山東桃種質(zhì)進行鑒定。原因可能有兩點：第一，本研究所用引物是從30對引物中二次篩選而來；第二，供試材料自身具備豐富的遺傳多樣性，從而使得引物的多態(tài)性信息含量升高。

迄今為止，SSR指紋圖譜的研究結(jié)果通常以分子身份證［22］和品種聚類圖［23］的形式呈現(xiàn)，二者各有特點。分子身份證是由品種指紋圖譜數(shù)據(jù)抽象化而來，無法直觀顯示品種間的指紋信息；品種聚類圖只能夠通過遺傳相似系數(shù)呈現(xiàn)品種之間遺傳距離的遠近，不能將品種區(qū)分開，也不能顯示SSR多樣性信息。本研究綜合采用了分子身份證和品種聚類圖兩種形式，有效規(guī)避了兩種形式的不足，兩種形式所得結(jié)果一致，即共享同一分子身份證代碼的品種在系統(tǒng)關(guān)系樹中也具有相同的遺傳相似系數(shù)。

不同研究采用的分子身份證構(gòu)建方法亦有不同［24，25］，本研究采用的是數(shù)字（0～9）和字母（26個小寫英文字母）相結(jié)合的方式，通過將引物擴增的帶型按照由小到大的順序排列并進行編碼，得到各品種的分子身份證代碼。本研究選取的10對SSR引物平均多態(tài)性信息含量為0.5699，具備良好的多態(tài)性，其中多態(tài)性信息含量數(shù)值高于平均值的有8對，理論上能夠區(qū)分836個桃種質(zhì)資源。本研究選取的60份山東桃種質(zhì)均得到了合理的區(qū)分，得到的分子身份證信息可用于品種資源的鑒定和分類。

地方種質(zhì)資源往往蘊含著高產(chǎn)、抗逆等優(yōu)良性狀，全面研究山東地方桃種質(zhì)資源遺傳多樣性還需要進一步擴大地方桃種質(zhì)資源的樣品，同時結(jié)合形態(tài)學、細胞學等技術(shù)，多角度、多層面系統(tǒng)研究地方品種的遺傳關(guān)系，從而為正確評價山東地方桃種質(zhì)資源創(chuàng)新和育種實踐提供理論支持。此外，隨著人類活動和自然環(huán)境的影響，越來越多的桃種質(zhì)資源遭到破壞甚至滅絕，因此，對山東地方桃種質(zhì)資源進行廣泛而有效地收集、保護、評價和利用已成為一項比較緊迫的任務。本研究初步構(gòu)建了60份山東桃種質(zhì)的分子身份證，今后將納入更多種質(zhì)進一步完善山東地方桃種質(zhì)資源庫。

4 結(jié)論

本研究采用SSR熒光標記毛細管電泳檢測技術(shù)構(gòu)建了60份山東桃種質(zhì)的分子身份證，得到的SSR引物具備較高的多態(tài)性信息，將有助于山東地方桃品種資源的鑒定、遺傳多樣性評價、親緣關(guān)系分析等各項研究工作的順利開展。