徐富權(quán) 蔣運(yùn)剛 黃朝沖

（四川省資陽(yáng)市雁江區(qū)小院鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，四川資陽(yáng) 641316）

豬細(xì)小病毒?。≒orcine parvovirus disease）是由豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus,PPV）感染引起的一種生殖障礙疾病，PPV可以感染任何年齡段的母豬，但妊娠母豬的癥狀最為明顯，表現(xiàn)為母豬流產(chǎn)，產(chǎn)下木乃伊胎、病弱胎、畸形胎；感染該病毒后母豬表現(xiàn)再懷孕困難、發(fā)情不穩(wěn)定，仔豬感染后引起皮炎和腹瀉[1]。繁殖障礙的嚴(yán)重程度取決于毒株的致病性和母豬所處的妊娠期。一般在母豬妊娠30 d內(nèi)感染，主要導(dǎo)致胚胎死亡或被母體重吸收；母豬妊娠30～70 d感染，主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎；母豬妊娠70 d后感染，一般不引起病害，母豬多能正常產(chǎn)仔，但所產(chǎn)仔豬常常帶有抗體并長(zhǎng)期帶毒[2]。PPV經(jīng)常與豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）、豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）等的1種或幾種形成混合感染[3]，給生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大損失。

豬細(xì)小病毒為DNA病毒，在分類(lèi)上為細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬。豬細(xì)小病毒的外觀(guān)具有多形性，一般呈對(duì)稱(chēng)的20面體結(jié)構(gòu)，六角形或圓球形[4]。病毒粒子直徑約為20 nm，粒子表面沒(méi)有囊膜，相對(duì)分子量為1.4×106[5]。豬細(xì)小病毒有2個(gè)ORF[6]，其主要編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，主要參與病毒基因組的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等[7]。豬細(xì)小病毒在原代和傳代細(xì)胞中均可以很好地增殖，并可使正常細(xì)胞產(chǎn)生病變[8]。豬細(xì)小病毒只有1種血清型[9]，不具有很強(qiáng)的變異能力。豬細(xì)小病毒對(duì)外界環(huán)境極不敏感，對(duì)熱不敏感，給予豬細(xì)小病毒70℃處理2 h，豬細(xì)小病毒仍然可以進(jìn)行感染[10]。對(duì)一般的消毒劑、紫外線(xiàn)、酸性環(huán)境抵抗力很強(qiáng)。

目前為止，全球共發(fā)現(xiàn)7種基因型的PPV，PPV1是最早于法國(guó)發(fā)現(xiàn)的經(jīng)典基因型，從污染的細(xì)胞中分離獲得[11]，PPV1是被公認(rèn)的最常見(jiàn)的基因型，也是造成損失最嚴(yán)重的基因型，目前已在美國(guó)、韓國(guó)、巴西等國(guó)家廣泛分布，在我國(guó)的湖南、吉林、安徽、廣西、山東、福建等地廣泛流行。PPV2～PPV6通過(guò)宏基因組測(cè)序等檢測(cè)技術(shù)陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)[12]。新型細(xì)小病毒PPV7是Palinski于2016年利用宏基因組測(cè)序在美國(guó)健康成年豬的直腸拭子中首次發(fā)現(xiàn)的，經(jīng)鑒定認(rèn)為是一種新的基因型[13]。本文通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)四川地區(qū)豬的流產(chǎn)胎兒、死胎等樣品進(jìn)行檢測(cè)、鑒定，對(duì)豬細(xì)小病毒病在四川地區(qū)的流行進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與保存

采集2020—2021年四川地區(qū)具有流產(chǎn)情況的豬場(chǎng)樣品，樣品類(lèi)型為流產(chǎn)胎兒或胎兒組織、木乃伊胎、畸形胎或畸形胎組織、流產(chǎn)胎衣等，用干凈的收集管收集，做好標(biāo)記，記錄樣品來(lái)源及時(shí)間，運(yùn)輸時(shí)用冰袋維持低溫環(huán)境，帶回實(shí)驗(yàn)室-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

本試驗(yàn)主要試劑DL 2 000 Marker、GreenView核酸染料、2×Taq PCR Master Mix購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物名稱(chēng)與序列

參考中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《豬細(xì)小病毒病檢疫技術(shù)規(guī)范》 （SN/T 1919—2016）中豬細(xì)小病毒1型特異性上下游引物序列，由上海生工生物工程技術(shù)公司合成引物。

1.4 樣品組織處理及DNA提取

準(zhǔn)備組織剪、鑷子、研缽，利用酒精棉球?qū)⑵骶呒爸車(chē)h(huán)境進(jìn)行灼燒滅菌，待其冷卻至室溫后，用鑷子小心夾出待測(cè)組織，用組織剪剪取組織中心未被污染的區(qū)域置于研缽中，于-70℃冰箱凍存5 min，5 min后取出快速研磨，研磨后繼續(xù)凍存3 min，取出后繼續(xù)研磨，至無(wú)明顯組織團(tuán)塊，加入1 mL生理鹽水研磨均勻，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，8 000 rpm離心2 min，取上清液進(jìn)行DNA提取[14]。提取的DNA置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 PCR檢測(cè)引物

1.5 PCR檢測(cè)

PCR反應(yīng)體系為 20 μL，2×PCR Master mix10 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O補(bǔ)足至20μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于1%含核酸染料的瓊脂糖凝膠中。電泳后，用凝膠成像分析系統(tǒng)觀(guān)察拍照，記錄檢測(cè)結(jié)果。

1.6 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)GenBank收錄的不同PPV1毒株的VP2基因序列，使用DNAstar生物學(xué)軟件Megalign方法進(jìn)行序列同源性分析，并通過(guò)MEGA6鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

表2 PPV參考序列

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果

將樣品用VP2基因設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖進(jìn)行電泳，結(jié)果見(jiàn)圖1，PCR結(jié)果顯示20份樣品中有7份樣品為PPV1陽(yáng)性，擴(kuò)增出445 bp的特異性片段，符合預(yù)期。

圖1 豬細(xì)小病毒VP2基因擴(kuò)增凝膠成像圖

2.2 測(cè)序及序列分析

將擴(kuò)增得到的目的條帶送至成都有康生物科技有限公司測(cè)序后通過(guò)NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)，比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該病毒序列與GenBank中的韓國(guó)毒株KF9（登錄號(hào)：MH447550.1）VP2基因同源性為96%。

在NCBI上下載PPV1不同株的VP2基因片段序列，利用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，目的序列與吉林長(zhǎng)春毒株DJH24（登錄號(hào)：MK0923 84）、湖南毒株HuN 1（登錄號(hào)：MH183298）聚為一支（圖2），核苷酸序列之間一致性為96.56%。

圖2 豬細(xì)小病毒VP2基因部分序列的系統(tǒng)樹(shù)

3 討論

豬細(xì)小病毒對(duì)妊娠母豬產(chǎn)生的危害較大，母豬一旦感染，將會(huì)影響整胎仔豬的質(zhì)量。豬細(xì)小病毒病的主要傳染源是帶毒的公豬和母豬，病毒能通過(guò)胎盤(pán)垂直傳播，檢測(cè)時(shí)除了采集死胎、病弱胎、木乃伊胎的組織，還可以采集臍帶血液、胎衣、母豬的陰道分泌物、子宮排泄物等。種公豬也是危險(xiǎn)的傳染源，病毒可以在公豬的精液、精索、附睪、性腺中復(fù)制[15]，公豬的精液采集之后，應(yīng)該先進(jìn)行細(xì)小病毒的篩查，檢測(cè)結(jié)果為陰性后方可給母豬授精。初產(chǎn)母豬比經(jīng)產(chǎn)母豬更容易感染，因此，在初產(chǎn)母豬授精、妊娠階段更應(yīng)該做好細(xì)小病毒的防護(hù)隔離，做好疫苗注射計(jì)劃。有條件的養(yǎng)豬場(chǎng)還應(yīng)該進(jìn)行豬細(xì)小病毒抗體水平的檢測(cè)。

從生物安全角度來(lái)講，豬細(xì)小病毒的凈化比疫苗注射更有效、更重要。但因豬細(xì)小病毒抵抗力較強(qiáng)，因此，要想使一個(gè)無(wú)感染的豬場(chǎng)保持下去，必需采取嚴(yán)格的衛(wèi)生措施。盡量堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，如必須引進(jìn)種豬，應(yīng)從無(wú)疫情豬場(chǎng)引進(jìn)[16]，且引進(jìn)前需進(jìn)行豬細(xì)小病毒的篩查，引進(jìn)后進(jìn)行必要的隔離。妥善處理感染母豬產(chǎn)下的死胎、病弱胎、木乃伊胎及胎衣，對(duì)污染的尸體、污物、場(chǎng)地進(jìn)行嚴(yán)格的消毒，做好無(wú)害化處理工作[17]。

疫苗預(yù)防是公認(rèn)的預(yù)防豬細(xì)小病毒病、提高母豬抵抗力和繁殖率的有效方法[18]。養(yǎng)豬場(chǎng)做好生物安全的同時(shí)，也應(yīng)該做好疫苗免疫計(jì)劃，妊娠母豬應(yīng)嚴(yán)格按照疫苗免疫計(jì)劃進(jìn)行疫苗注射。豬細(xì)小病毒疫苗有活疫苗和滅活疫苗[19]?；钜呙绠a(chǎn)生的抗體滴度高，維持時(shí)間長(zhǎng)；滅活疫苗維持時(shí)間較短，一般只有半年，可在配種前幾周進(jìn)行免疫[20]。免疫后應(yīng)測(cè)定抗體效價(jià)，抗體效價(jià)高于1∶80時(shí)，即可抵抗豬細(xì)小病毒感染[21]。無(wú)論是初產(chǎn)母豬，還是經(jīng)產(chǎn)母豬，每次配種前都應(yīng)進(jìn)行免疫注射。謹(jǐn)慎選擇疫苗，如果疫苗使用不當(dāng)會(huì)造成人為傳入病情，最好使用滅活疫苗。延遲分娩的母豬應(yīng)該使用前列腺烯醇及時(shí)引產(chǎn)，防止胎兒在子宮中腐敗滯留，腐蝕子宮膜，引起子宮內(nèi)膜炎，導(dǎo)致母豬下次配種不易受孕[22]。

從本試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，近段時(shí)間，四川地區(qū)的養(yǎng)豬場(chǎng)感染豬細(xì)小病毒的情況較為嚴(yán)重，在抽樣調(diào)查的20份病樣中，有7份病樣是豬細(xì)小病毒陽(yáng)性，在抽樣調(diào)查的病樣中豬細(xì)小病毒感染率為35%。此病發(fā)病率呈現(xiàn)升高趨勢(shì)的原因可能與未曾免疫或免疫程序不科學(xué)，引種不慎有關(guān)。為此，四川省各個(gè)豬場(chǎng)應(yīng)加強(qiáng)豬細(xì)小病毒病的引種檢疫及免疫工作，實(shí)施科學(xué)的免疫程序。

4 小結(jié)

綜上所述，四川地區(qū)豬細(xì)小病毒陽(yáng)性毒株與湖南地區(qū)的HuN 1毒株和吉林長(zhǎng)春的DJH24毒株有高度的同源性，證明此毒株在中國(guó)西南、中部、東北地區(qū)廣泛傳播，且并未進(jìn)行較大程度的變異。