陳歡，魏利軍

（哈藥集團(tuán)股份有限公司產(chǎn)品立項(xiàng)部 北京 100023）

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)以及中心法則被發(fā)現(xiàn)后，人類就設(shè)想著通過對(duì)遺傳信息的干預(yù)來治療疾病。隨著遺傳學(xué)的不斷發(fā)展，尤其是人類基因組測(cè)序工作完成后，疾病與基因之間的關(guān)系逐漸清晰，將遺傳物質(zhì)作為治療靶點(diǎn)已成為現(xiàn)實(shí)[1]。目前已上市核酸治療產(chǎn)品包括針對(duì)DNA的藥物或療法（含體外改變基因的細(xì)胞療法）、針對(duì)RNA的藥物以及核酸適配體。核酸藥物中與DNA有關(guān)的藥物分類眾多，涉及的技術(shù)領(lǐng)域龐雜?；贒NA的療法需要對(duì)遺傳物質(zhì)產(chǎn)生永久性變化，存在將外源性基因整合入患者基因組的風(fēng)險(xiǎn)；另外，其需要進(jìn)入細(xì)胞核才能發(fā)揮作用，提高了應(yīng)用難度。相對(duì)而言，RNA類藥物易于生產(chǎn)和遞送、具有較高的安全性，20余年來已取得了引人矚目的成果。本文主要針對(duì)RNA，包括反義寡核苷酸（ASO）、小干擾RNA（siRNA）、信使RNA（mRNA）以及微小RNA（miRNA）[2]的藥物遞送系統(tǒng)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。核酸適配體和CpG寡聚核苷酸通過特定結(jié)構(gòu)特征而非本身序列特征進(jìn)行識(shí)別，不納入本綜述范圍。

自福米韋生于1998年上市以來，迄今共有15款針對(duì)RNA的藥物上市。近年來，隨著技術(shù)日趨成熟，此類藥物的發(fā)展明顯有加速趨勢(shì)。2015年前僅有3款藥物上市，而2018年至今不足4年時(shí)間，已先后有12款藥物上市。

RNA藥物的發(fā)展不限于技術(shù)的進(jìn)步，其市場(chǎng)表現(xiàn)也相當(dāng)亮眼。2016年上市的用于治療脊髓性肌萎縮的藥物諾西那生鈉（商品名：Spinraza）的年銷售額自2018年起已連續(xù)4年超過10億美元，成為本領(lǐng)域首個(gè)“重磅炸彈”級(jí)藥物。2020年，新冠病毒導(dǎo)致的全球疫情促使輝瑞/BioNTech合作開發(fā)的疫苗BNT162b2（商品名：Comirnaty）和Moderna開發(fā)的疫苗mRNA-1273（商品名：Spikevax）于當(dāng)年12月相繼獲得FDA緊急使用授權(quán)，用于預(yù)防新冠病毒感染。財(cái)報(bào)顯示，Comirnaty和Spikevax在2021年全球總銷售額分別高達(dá)368億美元[3]和177億美元[4]。

根據(jù)沃森-克里克堿基配對(duì)規(guī)則，核酸藥物只需針對(duì)目標(biāo)基因適當(dāng)?shù)刂匦屡帕泻怂岬膲A基序列，就有望開發(fā)成具有生物特異性的藥物，避免了研發(fā)過程中的盲目性。在確定靶標(biāo)序列后，優(yōu)化設(shè)計(jì)核酸藥物的序列篩選耗時(shí)也遠(yuǎn)低于小分子化合物和抗體的篩選。相較于抗體藥物，核酸藥物不僅候選靶點(diǎn)更豐富，100個(gè)堿基以下的核酸藥物通常可以進(jìn)行化學(xué)合成，更容易保證批次間穩(wěn)定性和進(jìn)行質(zhì)量控制。核酸藥物的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)使其有望成為繼小分子和抗體之后的第三大類型藥物。

然而，核酸要進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮作用卻要面對(duì)多重障礙：首先，核酸藥物易被血漿和組織中RNase酶降解，并易被腎臟快速清除；其次，核酸具有天然的免疫原性，進(jìn)入體內(nèi)后易引起免疫反應(yīng)；另外，核酸藥物的相對(duì)分子質(zhì)量和負(fù)電荷讓其不能自由通過細(xì)胞膜；最后，核酸藥物進(jìn)入細(xì)胞后易被“卡”在內(nèi)吞小體中無法發(fā)揮功能。所以，自核酸藥物誕生以來，其開發(fā)過程中的主要問題一直是如何有效地對(duì)其進(jìn)行遞送[5]。

解決核酸藥物的遞送有2種思路，一種是對(duì)核酸結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，使其性質(zhì)穩(wěn)定并躲避免疫系統(tǒng)的識(shí)別；另一種是利用藥物遞送系統(tǒng)。

不同于小分子化合物其藥理學(xué)和藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)均由分子結(jié)構(gòu)決定，核酸藥物的藥理學(xué)性質(zhì)更多地由核酸序列決定，而藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)更多地由化學(xué)修飾的骨架和配體決定。這使得可以在不改變核苷酸序列的前提下，對(duì)核酸藥物進(jìn)行化學(xué)改造，從而對(duì)其藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)單獨(dú)進(jìn)行優(yōu)化[6]。目前已有多種成功的修飾方案，如磷酸連接基團(tuán)中的一個(gè)氧換成硫和糖環(huán)2位修飾等。改造核酸分子需要從多方面進(jìn)行考慮，主要包括分子穩(wěn)定性、藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)、堿基配位親和力，以及避開免疫系統(tǒng)等。因?yàn)锳SO、siRNA和mRNA等藥物都需要在各種酶[如核糖核酸酶（RNase）、Argonaute 2蛋白（Ago 2）和RNA聚合酶]的作用下才能發(fā)揮作用，還必須確保修飾后能夠被相關(guān)的功能酶所識(shí)別[7]。

化學(xué)修飾可以在一定程度上提高核酸藥物的化學(xué)穩(wěn)定性、降低免疫原性，但并不能完全解決其跨膜問題，多種針對(duì)核酸藥物的遞送系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生。遞送系統(tǒng)可以分為病毒載體和非病毒載體兩類，病毒載體一般使用基因修飾的病毒，如慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒等，其遞送效率高并可以產(chǎn)生持續(xù)性的治療效果，而且可以將核酸藥物遞送至細(xì)胞核，這對(duì)于以DNA為靶點(diǎn)的藥物至關(guān)重要。病毒載體的主要劣勢(shì)在于其可能將病毒的基因組插入患者染色體，安全性存在爭議。另外，免疫原性、較小的包裝容量、高生產(chǎn)難度均在一定程度上限制了其使用[8]，目前大部分獲批上市的核酸治療藥物均采用非病毒載體。其中，使用度較高的有脂質(zhì)納米顆粒遞送系統(tǒng)、生物偶聯(lián)遞送系統(tǒng)以及外泌體（exosome）載體幾類。

1 脂質(zhì)納米顆粒遞送系統(tǒng)

基于脂質(zhì)的納米載體是核酸藥物遞送領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。脂質(zhì)本身即是細(xì)胞膜的主要成分，其易于與細(xì)胞膜的磷脂雙分子層相融合，可以提高納米載體的細(xì)胞攝入。而且，脂質(zhì)易于購買、生物相容性好、可生物降解，還可以通過化學(xué)修飾提高載體靶向性。目前研究涉及的脂質(zhì)納米載體包括脂質(zhì)復(fù)合物（lipoplex）、脂質(zhì)聚合物復(fù)合物（lipopolyplex）、層狀納米顆粒（layer-by-layer nanoparticle，LbLNP）、固體脂質(zhì)納米粒（solid lipid nanoparticle，SLN）、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（nanostructured lipid carrier，NLC），以及穩(wěn)定的核酸脂質(zhì)粒子（stable nucleic acid-lipid particle，SNALP）等。

1.1 脂質(zhì)復(fù)合物

通過電性吸引將核酸藥物與陽離子脂質(zhì)[如溴化三甲基-2，3-二油酰氧基丙基銨（DOTAP）、氯化三甲基-2，3-二油烯氧基丙基銨（DOTMA）等]混合后直接形成脂質(zhì)復(fù)合物是最簡單的遞送思路。脂質(zhì)復(fù)合物的表面帶正電荷，便于結(jié)合帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜繼而進(jìn)入細(xì)胞[9]，但其在體內(nèi)環(huán)境中會(huì)不可避免地與帶負(fù)電荷生物大分子發(fā)生作用，導(dǎo)致帶負(fù)電荷的核酸藥物被置換從而發(fā)生泄漏，同時(shí)產(chǎn)生電荷相關(guān)的生理毒性[10]。另外，脂質(zhì)復(fù)合物劑型穩(wěn)定性不理想，需要在使用前即時(shí)配制。

1.2 脂質(zhì)聚合物復(fù)合物

脂質(zhì)聚合物復(fù)合物系將陽離子聚合物[如聚乙烯亞胺（PEI）、聚賴氨酸（PLL）、聚精氨酸、聚酰胺-胺樹形分子（PAMAM dendrimer）等]與核酸藥物形成的表面帶正電的聚合物復(fù)合物通過電性吸引包裹脂質(zhì)雙分子層得到，形成的納米顆粒表面基本不帶正電荷。相較于脂質(zhì)復(fù)合物，脂質(zhì)體聚合物復(fù)合物可以顯著提高遞送效率，且穩(wěn)定性明顯提高[11]。通過加入透明質(zhì)酸或肝素對(duì)復(fù)合物表面進(jìn)行修飾，其免疫刺激性可進(jìn)一步降低[12]。

1.3 層狀納米顆粒

層狀納米顆粒通過序列的電性作用將核酸藥物包裹進(jìn)多層的納米顆粒。中心穩(wěn)定的納米核心及各層材料的選擇對(duì)相鄰層之間的吸附至關(guān)重要。Choi等[13]使用電負(fù)性的聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）顆粒作為核心，首先將聚精氨酸（poly-L-Arg）吸附至核心表面以產(chǎn)生帶正電荷的表面，再以電負(fù)性的siRNA進(jìn)行覆蓋，再覆蓋一層帶正電荷的聚精氨酸，最后用偶聯(lián)了CD20抗體的帶負(fù)電荷的透明質(zhì)酸覆層。該多層納米顆粒最外層的負(fù)電荷層可以避免產(chǎn)生正電荷相關(guān)毒性，其在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中未見明顯的毒性。但層狀納米顆粒的材料選擇要求較高且制備工藝復(fù)雜、重現(xiàn)性差，限制了其應(yīng)用。

1.4 固體脂質(zhì)納米粒和納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體

固體脂質(zhì)納米粒具有低熔點(diǎn)的固體陽離子脂質(zhì)核心，核酸藥物吸附于載體基質(zhì)表面，通過外圍的表面活性劑使之穩(wěn)定。但研究發(fā)現(xiàn)，SLN可能會(huì)隨著內(nèi)部固體脂質(zhì)晶體的逐漸生長導(dǎo)致藥物泄漏[14]。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體為其升級(jí)版本，在基質(zhì)中摻入少量的液體脂質(zhì)，降低了脂質(zhì)核心的結(jié)晶程度，不僅提高了載藥量，還具有更好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性[15]。由于固態(tài)脂質(zhì)核也可進(jìn)行載藥，固體脂質(zhì)納米粒和納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體可以對(duì)親脂性藥物進(jìn)行遞送。使用固體脂質(zhì)納米粒對(duì)Bcl-2 siRNA和紫杉醇同時(shí)包載，體外結(jié)果顯示這2種藥物可以同時(shí)釋放[16]。

1.5 穩(wěn)定的核酸脂質(zhì)粒子

SNALP是一種含有可離子化陽離子脂質(zhì)的脂質(zhì)納米粒（LNP），由可離子化脂質(zhì)、結(jié)構(gòu)脂質(zhì)、PEG脂質(zhì)及膽固醇組成，可有效阻止核酸藥物在內(nèi)源性環(huán)境中的降解，將藥物遞送至細(xì)胞內(nèi)[17]?；谄浼夹g(shù)和商業(yè)上的成功導(dǎo)致的巨大影響，許多文獻(xiàn)中的LNP均特指SNALP。目前，已有3個(gè)使用此類遞送系統(tǒng)的產(chǎn)品獲批上市，分別為阿尼拉姆公司開發(fā)的治療遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（hATTR）的siRNA藥物patisiran（商品名：Onpattro），以及用于預(yù)防新冠病毒感染的mRNA疫苗Comirnaty和Spikevax。

可離子化陽離子脂質(zhì)的使用和微流控混合技術(shù)[18]的出現(xiàn)使得載藥顆粒的表面基本不帶電?？呻x子化陽離子脂質(zhì)在酸性條件下帶正電荷，而在體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)的環(huán)境中幾乎不帶電。脂質(zhì)納米粒制備時(shí)，在pH約4的條件下，通過快速混合脂質(zhì)的乙醇溶液和核酸的水溶液，可形成實(shí)心的脂質(zhì)顆粒。將其透析除去乙醇后，于近中性的水溶液中保存?zhèn)溆茫|(zhì)顆粒表面近中性[19]。

SNALP對(duì)肝細(xì)胞的高親和力通過載脂蛋白E（ApoE）實(shí)現(xiàn)。PEG脂質(zhì)解離后，ApoE可吸附在SNALP表面，形成高效靶向的配體，與肝細(xì)胞表面的脂蛋白受體結(jié)合，觸發(fā)胞飲而被內(nèi)攝[20]。SNALP通過胞飲進(jìn)入靶細(xì)胞后，內(nèi)涵體膜上內(nèi)向的質(zhì)子泵作用導(dǎo)致內(nèi)涵體中的pH值降低?？呻x子化的陽離子脂質(zhì)逐漸被質(zhì)子化而帶正電荷，內(nèi)源性的陰離子脂質(zhì)與陽離子脂質(zhì)結(jié)合，形成錐形結(jié)構(gòu)，破壞雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致核酸藥物被釋放入胞質(zhì)，繼而發(fā)揮作用[21]。但研究顯示，內(nèi)涵體逃逸的時(shí)間窗口很短，只有很少一部分SNALP可以從內(nèi)涵體中逃逸，從而影響了藥效的發(fā)揮[22]。

目前，可離子化陽離子脂質(zhì)是SNALP研究的熱點(diǎn)。對(duì)其優(yōu)化可以獲得更好的治療效果。在Onpattro的研發(fā)過程中，通過不斷的優(yōu)化，在合成了300多種陽離子脂質(zhì)并進(jìn)行試驗(yàn)后，可離子化陽離子脂質(zhì)的優(yōu)選解離常數(shù)（pKa）為6.2 ～ 6.5左右。該pKa范圍既可以保證在內(nèi)涵體pH值下，大部分脂質(zhì)可被質(zhì)子化而與內(nèi)源的陰離子脂質(zhì)作用，導(dǎo)致內(nèi)涵體的破裂；同時(shí)又可以保證在循環(huán)系統(tǒng)中LNP表面基本不帶電荷，不被免疫系統(tǒng)清除。最終，Onpattro制劑中使用了DLinMC3DMA，其結(jié)構(gòu)與DLin-KC2-DMA接近，且pKa均為6.4，可以使治療效果提高10倍[19]。Spikevax和Comirnaty制劑中使用的可離子化陽離子脂質(zhì)分別為SM-102和ALC-0315。不同于DLinMC3DMA，二者在脂質(zhì)疏水性尾部中摻入了酯基結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的引入使脂質(zhì)能更快地在體內(nèi)代謝清除，提高了產(chǎn)品的耐受性。同時(shí)，二者分枝狀尾部的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)使得在內(nèi)涵體逃逸過程中更易于形成錐形結(jié)構(gòu)，便于核酸藥物進(jìn)入胞質(zhì)[23]。

在脂質(zhì)納米粒中加入PEG脂質(zhì)，可使SNALP大小在100 nm以下，其粒徑可進(jìn)一步通過調(diào)整PEG脂質(zhì)和結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的比例實(shí)現(xiàn)。使用PEG脂質(zhì)的一個(gè)問題是其會(huì)抑制SNALP與ApoE的結(jié)合，從而影響其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。使用含有肉豆蔻基的PEG脂質(zhì)解決了該問題：在顆粒的形成和藥品儲(chǔ)存期間，此類脂質(zhì)會(huì)聚合于LNP表面；而在生理狀態(tài)下，其可以逐漸解離，從而形成無包裹的顆粒被細(xì)胞攝取[24]。目前已上市產(chǎn)品中，Onpattro使用的PEG脂質(zhì)為PEG2000-C-DMG，Spikevax和Comirnaty中使用的則分別是PEG2000-DMG和PEG2000-DTA（ALC-0159）。上述3個(gè)LNP產(chǎn)品由基本相同比例的4種脂質(zhì)組成，但含siRNA和mRNA的LNP中可電離脂質(zhì)氮與寡核苷酸磷酸的物質(zhì)的量的比值分別為3和6。由于含mRNA的LNP的上述比值明顯大于siRNA，二者形成的SNALP在結(jié)構(gòu)上存在一定差異。研究顯示，mRNA在SNALP中更靠近中心，而siRNA更靠近表面。而且，載mRNA的SNALP中會(huì)形成含有溶劑的小泡，且mRNA在小泡中可能會(huì)與帶正電荷的脂質(zhì)分離[25]。

SNALP通過一系列巧妙的設(shè)計(jì)獲得了商業(yè)上的成功，但其存在的問題也比較明顯。首先，其遞送效率有限，為達(dá)到治療效果需要較高的給藥劑量。但是，作為一種使用了多種脂質(zhì)輔料的注射劑，輔料的毒性不可忽視。另外，PEG脂質(zhì)被報(bào)道可引起超敏反應(yīng)，陽離子脂質(zhì)也具有一定的促炎性。例如，Onpattro在注射之前需要使用抗組胺藥和激素藥物控制[26]。隨著同樣靶向肝臟的更高效遞送系統(tǒng)——N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc）偶聯(lián)遞送系統(tǒng)的出現(xiàn)，SNALP已逐漸退出siRNA遞送領(lǐng)域。但對(duì)于生物利用度更差、荷電更高的mRNA及CRISPR基因編輯藥物，LNP遞送系統(tǒng)目前仍是解決其遞送難題最有效的方式。

本文所述脂質(zhì)納米載體中，SNALP不論在技術(shù)還是商業(yè)上均最為成熟。脂質(zhì)聚合物復(fù)合物協(xié)同了脂質(zhì)復(fù)合物的高穩(wěn)定性、可接受的細(xì)胞攝入以及聚合物復(fù)合物粒徑均勻可控、高轉(zhuǎn)染效率、內(nèi)涵體逃逸的優(yōu)勢(shì)，也是目前研究較為集中的一類載體，但由其聚合物低生物相容性引發(fā)的細(xì)胞毒性仍是阻礙其進(jìn)一步發(fā)展的主要原因。隨著對(duì)脂質(zhì)納米載體生物學(xué)功能、其發(fā)揮作用關(guān)鍵限速步驟的深入研究和逐步理解，很有可能會(huì)出現(xiàn)進(jìn)一步完善的藥用材料或納米顆粒形式[11,27]。

2 生物偶聯(lián)遞送系統(tǒng)

目前已上市的基于生物偶聯(lián)遞送系統(tǒng)的產(chǎn)品使用的均為GalNAc偶聯(lián)遞送系統(tǒng)。人類去唾液酸糖蛋 白 受 體（aslaloglyeoprotein receptor，ASGPR）主要表達(dá)在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中，人體肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的ASGPR數(shù)量約為50萬個(gè)。GalNAc可與ASGPR發(fā)生特異性結(jié)合，利用此特性可以將GalNAc與核酸藥物偶聯(lián)并進(jìn)行肝臟靶向遞送。GalNAc偶聯(lián)物與ASGPR結(jié)合后，通過細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入內(nèi)涵體，隨著內(nèi)涵體成熟過程中伴隨的酸化，GalNAc偶聯(lián)物與ASGPR解離，GalNAc在溶酶體中降解從而將核酸藥物帶入細(xì)胞內(nèi)，ASGPR重新循環(huán)至肝細(xì)胞表面。GalNAc偶聯(lián)物的遞送非常高效，ASGPR單次循環(huán)時(shí)間約15 min，1個(gè)ASGPR可以循環(huán)使用約200次[5,28-29]。由于肝臟的血流量大且含有有孔內(nèi)皮，注射1次偶聯(lián)藥物后可以充分?jǐn)z取并維持?jǐn)?shù)月的效果。

GalNAc-siRNA通過細(xì)胞表面的ASGPR被網(wǎng)格蛋白包被小泡攝入，轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)涵體。隨著核內(nèi)涵體pH值 降 低，GalNAc-siRNA從ASGPR釋 放，ASGPR循環(huán)至細(xì)胞表面。GalNAc-siRNA一直存在于成熟的內(nèi)涵體中。盡管攝取和遞送至內(nèi)涵體較快，但研究顯示，在內(nèi)涵體中只有不到0.01%的GalNAc-siRNA進(jìn)入胞質(zhì)[5]。因此，內(nèi)涵體逃逸是此種遞送方式的限速步驟。

目前主要有2種策略用于多價(jià)GalNAc共軛物的合成。一種是在固相載體上預(yù)組裝一個(gè)多價(jià)GalNAc配體，而后與核酸藥物連接，阿尼拉姆的產(chǎn)品開發(fā)即基于此種策略[30]?；跇渲罘肿庸羌艿腉alNAc配體與ASGR的親和力取決于糖基的結(jié)構(gòu)、數(shù)量，以及糖基和樹枝狀結(jié)構(gòu)分支點(diǎn)之間間隔子的疏水性和長度。ASGPR對(duì)末端GalNAc的親和力比半乳糖高大約50倍；當(dāng)間隔子長度為2 nm時(shí)，共軛物對(duì)核酸的轉(zhuǎn)運(yùn)效果最好；三觸角和四觸角GalNAc設(shè)計(jì)相對(duì)于其他設(shè)計(jì)更加有效[31]。另一種則是在固相合成寡聚核苷酸的過程中基于單價(jià)GalNAc亞磷酰胺的多步摻入。該方法允許更靈活的設(shè)計(jì)和價(jià)位，而且合成步驟更少，其可以快速驗(yàn)證不同設(shè)計(jì)策略及連接子[32]。使用線性多價(jià)聚合策略，Dicerna公司開發(fā)了基于GalXC平臺(tái)的siRNA藥物。在該獨(dú)特平臺(tái)上，折疊的四核苷酸環(huán)結(jié)構(gòu)用于連接siRNA的2條鏈。每個(gè)核苷酸上通過2'位連接1個(gè)GalNAc，可最多接4個(gè)GalNAc。

使用LNP遞送系統(tǒng)的第1個(gè)核酸藥物Onpattro上市后，阿尼拉姆公司卻并沒有將其已相對(duì)成熟的LNP技術(shù)用于其他核酸藥物的遞送，而是將研發(fā)重點(diǎn)轉(zhuǎn)向GalNAc偶聯(lián)遞送系統(tǒng)。一方面，這是由于阿尼拉姆并不獨(dú)立擁有LNP遞送平臺(tái)的知識(shí)產(chǎn)權(quán)，該平臺(tái)的大部分專利技術(shù)由外部授權(quán)獲得。但更主要的原因在于GalNAc偶聯(lián)核酸藥物更好的市場(chǎng)前景。以治療hATTR的藥物vutrisiran（商品名：Amvuttra）為例，其相較于Onpattro的靜脈注射，使用皮下注射的給藥方式；相較于Onpattro每3周1次的給藥頻率，vutrisiran給藥頻率降至每3個(gè)月1次，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。在一項(xiàng)名為HELIOS-A的Ⅲ期臨床研究中，與安慰劑組相比，vutrisiran組患者主要評(píng)價(jià)指標(biāo)呈統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性改善。相對(duì)于patisiran對(duì)照組，vutrisiran組實(shí)現(xiàn)了血清轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（TTR）水平的快速和持續(xù)降低，較基線平均降低88%，達(dá)到非劣效性標(biāo)準(zhǔn)[33]。目前，全球已有5個(gè)使用GalNAc偶聯(lián)遞送系統(tǒng)的siRNA藥物上市，均由阿尼拉姆公司開發(fā)，分別為治療急性肝卟啉癥（AHP）的givosiran（商品名：Givlaari）、治療原發(fā)性高膽固醇血癥的inclisiran（商品名：Leqvio）、治療原發(fā)性高草酸尿癥1型（PH1）的lumasiran（商品名：Oxlumo），以及上述治療hATTR的藥物vutrisiran。

由于GalNAc偶聯(lián)遞送系統(tǒng)的高靶向性，此前使用直接給藥的ASO類產(chǎn)品目前亦開始使用此類技術(shù)遞送。研究顯示，未偶聯(lián)的ASO主要（高于70%）被肝臟的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞攝取，而使用三觸角GalNAc樹枝狀結(jié)構(gòu)偶聯(lián)的ASO則大部分被遞送至肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。此種遞送結(jié)果的變化導(dǎo)致體內(nèi)藥效提升約60倍[34]。目前Ionis公司已有多個(gè)使用GalNAc偶聯(lián)遞送系統(tǒng)的ASO類藥物進(jìn)入臨床。

不同于LNP由藥用輔料引起的毒性，GalNAc偶聯(lián)藥物的主要副作用在于其肝毒性。這主要來源于其寡聚核苷酸及代謝物在細(xì)胞內(nèi)的積聚以及其引發(fā)的脫靶效應(yīng)[35]。隨著GalNAc偶聯(lián)物有效性的提高，如何降低其副作用已成為近期的研究熱點(diǎn)。

研究人員通過鎖核酸（LNA）技術(shù)修飾的寡核苷酸來控制GalNAc-siRNA的作用持續(xù)時(shí)間。REVERSIR是一種與siRNA種子區(qū)互補(bǔ)的LNA修飾的寡核苷酸，與GalNAc-siRNA具有高結(jié)合力，1次皮下注射TTR-siRNA對(duì)應(yīng)的REVERSIR后可在小鼠中逆轉(zhuǎn)TTR-siRNA引起的反應(yīng)，從而控制TTR-siRNA作用的時(shí)間[36]。乙二醇核酸（glycol nucleic acid，GNA）是一種非環(huán)核酸，采用GNA修飾的核酸結(jié)合力明顯低于天然核酸。在siRNA的反義鏈的7位和8位（種子區(qū)）進(jìn)行GNA修飾可以在不削弱活性的基礎(chǔ)上降低脫靶效應(yīng)[37]?；旌瞎羌埽╩ixed backbone，MBB）即將硫代磷酸骨架部分替換回正常的磷酸骨架。MBB-ASO的設(shè)計(jì)具有降低ASO與特定細(xì)胞蛋白結(jié)合引起的不依賴于雜交的毒性的潛力。研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于全PS設(shè)計(jì)，GalNAc共軛的MBB-ASO表現(xiàn)出相似或提升的活性，這為同時(shí)降低毒性和提升活性的化學(xué)設(shè)計(jì)提供了另一種思路[38]。

目前，生物偶聯(lián)遞送系統(tǒng)的研究已擴(kuò)展到了肝臟外的其他組織，偶聯(lián)配體包括脂質(zhì)、多肽、抗體，以及核酸適配體，多項(xiàng)研究已取得令人鼓舞的結(jié)果。胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）受體（GLP-1R）在胰腺β細(xì)胞上表達(dá)，使用GLP-1R偶聯(lián)ASO在體內(nèi)和體外均能成功地將ASO遞送到胰腺β細(xì)胞，且沒有影響肝臟和其他組織中相關(guān)的基因的表達(dá)，具有較好的組織和細(xì)胞選擇性[39]。轉(zhuǎn)鐵蛋白是一種可結(jié)合鐵離子的糖蛋白，其通過轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor，TfR，也稱CD71，顯著表達(dá)于骨骼肌和心肌中）將鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。將抗CD71抗體的Fab段直接與修飾后的靶向肌肉生長抑制素的siRNA偶聯(lián)，對(duì)小鼠靜脈注射給藥后，其在心肌和骨骼肌中均顯示出沉默效果[40]。膽固醇偶聯(lián)的siRNA已被用于沉默肝臟中編碼Apolipoprotein B的mRNA[41]以及小鼠骨骼肌中編碼myostatin的mRNA[42]。HIV轉(zhuǎn) 錄 激 活 蛋 白（trans-activator protein，Tat）是一種細(xì)胞穿透肽，可運(yùn)載外源性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，其與siRNA偶聯(lián)后可顯著提高siRNA的遞送能力[43]。

3 外泌體載體

外泌體是細(xì)胞外囊泡中最小的一類，大小約40 ～ 150 nm，是由細(xì)胞內(nèi)多泡體（multivesicular body，MVB）與細(xì)胞膜融合后，釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中的膜性囊泡。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體。外泌體攜帶有宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等物質(zhì)，可以被目標(biāo)細(xì)胞自然吸收，是細(xì)胞間信息交換和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)拿浇?。外泌體結(jié)構(gòu)類似于單層脂質(zhì)體，含有圍繞于水性核的兩親性脂質(zhì)雙分子層。目前已在外泌體中發(fā)現(xiàn)的核酸類物質(zhì)包括mRNA、miRNA及病毒RNA、tRNA等多種RNA[44]。

作為天然的細(xì)胞間信息載體，外泌體較人工遞送載體具有明顯的優(yōu)勢(shì)。首先，外泌體的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)和較小的尺寸使其可以跨過包括血腦屏障在內(nèi)的主要的生物屏障。其次，外泌體生物相容性好，不會(huì)引起免疫反應(yīng)。再次，相比于脂質(zhì)對(duì)親水性物質(zhì)較低的包封率，外泌體的包裝效率顯著提升。最后，不同來源的外泌體對(duì)受體細(xì)胞的選擇性不同，通過選擇合適來源的外泌體，可使其成為高選擇性的遞送工具。相比于目前已較為成熟的LNP和GalNAc偶聯(lián)遞送系統(tǒng)，外泌體在非肝靶向的核酸藥物遞送方面具有良好的應(yīng)用潛力[45]。

目前尚無上市的外泌體產(chǎn)品，但許多關(guān)于核酸藥物外泌體遞送的研究已取得令人鼓舞的成績，其遞送的核酸藥物包括siRNA、miRNA、mRNA等。Wahlgren等[46]將外源性絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）siRNA導(dǎo)入不同的人源血漿外泌體中，發(fā)現(xiàn)外泌體可將siRNA遞送至人單核細(xì)胞，并引發(fā)MAPK-1基因沉默。Munoz等[47]發(fā)現(xiàn)，通過轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，使外泌體載有抗miRNA-9寡核苷酸（anti-miR-9）后，可通過外泌體向多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）細(xì)胞傳遞anti-miR-9。Tsai等[48]將編碼SARS-CoV-2刺突蛋白和核殼體蛋白的mRNA載入外泌體，進(jìn)行肌肉注射后，發(fā)現(xiàn)該外泌體可誘導(dǎo)小鼠對(duì)二者持久的體液和細(xì)胞免疫。

目前，已有多個(gè)外泌體產(chǎn)品進(jìn)入臨床研究階段[49]。在一項(xiàng)臨床試驗(yàn)（NCT03608631）中，含有靶向KrasG12D突變基因的siRNA的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體正被用于治療胰腺癌。而伊斯法罕醫(yī)科大學(xué)的臨床研究（NCT03384433）正在探索攜帶miR-124的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對(duì)缺血性心臟病的治療作用。Codiak BioSciences發(fā)現(xiàn)了2種高度豐富的外泌體蛋白PTGFRN和BASP1，使用這些蛋白質(zhì)作為支架可將感興趣的治療性分子引導(dǎo)到外泌體的表面或內(nèi)腔。其表面荷載ASO的外泌體療法exoASOSTAT6可選擇性靶向腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）并精確破壞STAT6信號(hào)傳導(dǎo)，在癌癥模型動(dòng)物中產(chǎn)生顯著的抗腫瘤活性[50]。目前在該領(lǐng)域已涌現(xiàn)出一批創(chuàng)新型公司，如Codiak BioSciences、EVOX Therapeutics、Tavec Pharmaceuticals、Carmine Therapeutics、Anjarium and Micromedmark Biotech等；而如羅氏、禮來、武田等大型跨國藥企則通過與之合作，進(jìn)入了這條賽道。

將核酸藥物載入外泌體的方法主要分為2類。一類先通過適當(dāng)手段對(duì)外泌體進(jìn)行純化，再將核酸藥物負(fù)載到純化后的外泌體，如電穿孔法、孵育法、超聲法等。此類方法相對(duì)簡單，但裝載效率低且不易控制。由于母細(xì)胞及外泌體類型的不同，即使相同裝載方法的裝載效率也會(huì)存在較大的差異，而且載入過程中可能會(huì)破壞膜蛋白的天然生理功能。據(jù)報(bào)道，電穿孔法可能會(huì)引起外泌體及siRNA的聚集。另一類則通過對(duì)產(chǎn)生外泌體的母細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使其直接產(chǎn)生包含核酸藥物的外泌體。使用該方法除裝載目標(biāo)藥物外，還可以對(duì)外泌體表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，使其具有更好的靶向性。已有多項(xiàng)研究成功使用該方法將母細(xì)胞中的miRNA高表達(dá)后轉(zhuǎn)染至外泌體，未來該方法可能成為外泌體裝載核酸藥物的主流選擇[51]。

盡管外泌體作為藥物遞送載體優(yōu)勢(shì)明顯，其臨床應(yīng)用目前仍存在諸多需要克服的障礙，如外泌體的純化、分析、規(guī)?；a(chǎn)，以及核酸藥物（尤其是相對(duì)分子質(zhì)量較大的mRNA）的載入、外泌體進(jìn)入靶細(xì)胞后如何避免溶酶體降解等[52]。

4 結(jié)語

經(jīng)過近半個(gè)世紀(jì)的積累，遞送技術(shù)逐漸成熟，使核酸藥物進(jìn)入了快速增長期。核酸藥物在治療遺傳性疾病方面具有天然優(yōu)勢(shì)，為眾多罕見病患者提供了寶貴的治療機(jī)會(huì)。用于治療成人原發(fā)性高膽固醇血癥或混合性血脂異常的siRNA藥物inclisiran的獲批標(biāo)志著核酸藥物在技術(shù)上已逐漸獲得了監(jiān)管機(jī)構(gòu)的進(jìn)一步認(rèn)可，進(jìn)入了對(duì)安全性要求高但市場(chǎng)更為廣闊的慢病領(lǐng)域。核酸藥物遞送技術(shù)的發(fā)展呈現(xiàn)出平臺(tái)化的特點(diǎn)，在遞送技術(shù)相對(duì)成熟后，基于相同技術(shù)平臺(tái)開發(fā)類似藥物的速度會(huì)明顯加快。借助前期脂質(zhì)納米粒的技術(shù)沉淀，Moderna公司的mRNA新冠疫苗從疫苗序列選擇設(shè)計(jì)完成到首次人體給藥，合計(jì)僅耗時(shí)63 d，展現(xiàn)了超乎以往想象的效率[53]。可以預(yù)見，已有的技術(shù)平臺(tái)未來也非常有希望應(yīng)用于體內(nèi)基因編輯等新的治療領(lǐng)域。

同時(shí)，核酸藥物的遞送仍面臨眾多技術(shù)挑戰(zhàn)。如何進(jìn)一步提高遞送效率、降低遞送系統(tǒng)的毒性、實(shí)現(xiàn)對(duì)其他肝臟外組織和器官的特異性遞送將是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。伴隨著對(duì)核酸體內(nèi)作用機(jī)制和相關(guān)疾病認(rèn)識(shí)的進(jìn)一步深入，核酸藥物遞送系統(tǒng)必將迎來新的突破和發(fā)展，助力于提供安全有效的個(gè)性化治療方案，使更多患者受益。