劉 平，程瑩瑩，蔡海燕，楊 森，武建軍，丁銀秀，3

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)系，銀川 750004；2.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，銀川 750001；3.寧夏回族自治區(qū)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，銀川 750004）

顳葉癲癇是最常見(jiàn)的難治性癲癇[1]。癲癇發(fā)作時(shí)引起的海馬神經(jīng)發(fā)生與癲癇易感性、繼發(fā)性海馬功能障礙等密切相關(guān)，其具體機(jī)制不明。研究[2-3]證實(shí)，反復(fù)的癲癇發(fā)作或癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus，SE）下，嚴(yán)重影響動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能，且癲癇發(fā)作后引起海馬萎縮和苔蘚樣出芽，進(jìn)一步加重了動(dòng)物認(rèn)知功能減退。經(jīng)典的Wnts/β-catenin信號(hào)通路是參與腦內(nèi)神經(jīng)發(fā)生、癲癇形成的關(guān)鍵途徑[4]。因此，闡明癲癇發(fā)作時(shí)海馬神經(jīng)發(fā)生與Wnts/β-catenin信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制的關(guān)系，對(duì)癲癇的靶向防治尤為重要。本實(shí)驗(yàn)以SD癲癇大鼠為研究對(duì)象，探討SD大鼠癲癇發(fā)作后海馬區(qū)膠質(zhì)纖維狀酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、Wnt3a、p-β-catenin和β-catenin表達(dá)的變化情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取體質(zhì)量為150～180 g的雄性SPF級(jí)SD大鼠32只，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)的溫度保持在20℃左右，相對(duì)濕度恒定（45%～55%）。常規(guī)攝食、飲水，讓大鼠適應(yīng)環(huán)境3 d后，進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（Con組）、癲癇模型組（SE 1 d、SE 7 d和SE 14 d）共4組，每組SD大鼠8只。

1.2 主要試劑和儀器

氯化鋰、匹羅卡品購(gòu)自Sigma公司；兔抗GFAP、兔抗Wnt3a、兔抗p-β-catenin和兔抗β-catenin購(gòu)自Abcam公司；總蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒以及相應(yīng)的HRP二抗購(gòu)自凱基生物公司；高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自Thermo Fisher公司，Amersham Imager 600凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自GE醫(yī)療公司。

1.3 方法

1.3.1 癲癇大鼠模型的制備及效果評(píng)價(jià) 采用國(guó)際公認(rèn)并廣泛使用的腹腔注射氯化鋰-匹羅卡品（lithium-pilocarpine）動(dòng)物模型制備方法：癲癇模型組大鼠腹腔注射氯化鋰（3 mmol·kg-1），18～20 h后腹腔注射匹羅卡品（30 mg·kg-1）；Con組大鼠注射0.9%生理鹽水（3 mmol·kg-1）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物癲癇發(fā)作分級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)采用Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（0級(jí)為無(wú)抽搐發(fā)作；Ⅰ級(jí)為面部陣攣；Ⅱ級(jí)為節(jié)律性點(diǎn)頭發(fā)作；Ⅲ級(jí)為單側(cè)前肢抽搐；Ⅳ級(jí)為雙前肢抽搐；Ⅴ級(jí)為四肢抽搐或失去平衡、跳躍并跌倒等）。若動(dòng)物出現(xiàn)Ⅳ級(jí)及以上癥狀且發(fā)作45～60 min，則證明造模成功，立即注射水合氯醛（10 mg·kg-1），終止發(fā)作。

造模后注意大鼠保暖、保持呼吸道通暢、提供足夠的飲水及食物。造模后第1天，密切觀察大鼠飲水、進(jìn)食次數(shù)和進(jìn)食量是否正常，將SE 1 d組大鼠處死，取腦備用；造模后第2天和第8天，SE 7 d組和SE 14 d組大鼠分別進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。在此過(guò)程中，觀察大鼠癲癇小發(fā)作或大發(fā)作的持續(xù)時(shí)間或頻次，且在各組相應(yīng)的時(shí)間節(jié)點(diǎn)處死大鼠，取新鮮腦組織-80℃冰箱保存。

1.3.2 水迷宮實(shí)驗(yàn) 水迷宮由一直徑為180 cm的圓形塑膠桶、攝像頭及透明站臺(tái)組成，水池分為第一、二、三、四象限，將平臺(tái)放置于第三象限中心位置。從第一象限開(kāi)始作為大鼠入水點(diǎn)，依次放入水中，每天上午、下午分別進(jìn)行一次實(shí)驗(yàn)。共訓(xùn)練5 d，每個(gè)象限60 s，記錄4個(gè)象限中大鼠的逃避潛伏期，第6天記錄大鼠定位巡航的路程，巡航實(shí)驗(yàn)結(jié)束后記錄大鼠首次穿越平臺(tái)的時(shí)間和60 s內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)。

1.3.3 Western blot實(shí)驗(yàn) 將大鼠麻醉后，斷頭取腦，大部分新鮮腦組織-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ⌒〔糠趾ｑR組織提取總蛋白，進(jìn)行蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。入一抗，分別是：兔抗GFAP（1∶20 000）、兔抗Wnt3a（1∶1 000）、兔抗p-β-catenin（1∶500）和兔抗β-catenin（1∶10 000），4℃搖床過(guò)夜，次日入相應(yīng)的HRP二抗1～2 h。凝膠成像儀采集圖像，進(jìn)行蛋白條帶灰度分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的行為學(xué)改變

癲癇模型組SD大鼠腹腔注射氯化鋰-匹羅卡品后，早期發(fā)現(xiàn)大鼠有點(diǎn)頭、面部、肢體抽搐、流涎等癥狀，進(jìn)而出現(xiàn)后腿站立、前腿抬起并且出現(xiàn)跌倒、全身抽搐強(qiáng)直等癲癇持續(xù)狀態(tài)的行為學(xué)改變。Con組大鼠未觀察到以上的異常行為學(xué)改變。與Con組比較，癲癇模型組大鼠精神萎靡或躁狂不安、活動(dòng)減少、進(jìn)食飲水量減少、體質(zhì)量增加緩慢或未增加。

2.2 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 定位巡航實(shí)驗(yàn) 與Con組比較，SE 7 d組、SE 14 d組大鼠第2～5天逃避潛伏時(shí)間增長(zhǎng)，SE 14 d組大鼠第3～5天逃避潛伏時(shí)間短于SE 7 d組（P均＜0.05），見(jiàn)圖1A。與Con組比較，SE 7 d、SE 14 d組大鼠60 s內(nèi)定位巡航的路程增長(zhǎng)，SE 14 d組大鼠60 s內(nèi)定位巡航的路程較SE 7 d組短（P均＜0.05），見(jiàn)圖1B。

2.2.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 與Con組比較，SE 7 d組大鼠首次穿越平臺(tái)所用時(shí)間延長(zhǎng)，SE 14 d組大鼠首次穿越平臺(tái)所用時(shí)間較SE 7 d組少（P均＜0.05），見(jiàn)圖1C。與Con組比較，SE 7 d組、SE 14 d組大鼠在60 s內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)減少，SE 14 d組大鼠在60 s內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)多于SE 7 d組（P均＜0.05），見(jiàn)圖1D。

圖1 各組大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的變化情況

2.3 各組大鼠海馬區(qū)GFAP和Wnt3a蛋白含量的變化

蛋白分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SE 7 d組、SE 14 d組大鼠GFAP和Wnt3a蛋白灰度值均較Con組和SE 1 d組增加，SE 14 d組大鼠GFAP和Wnt3a蛋白灰度值高于SE 7 d組（P均＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠海馬區(qū)GFAP和Wnt3a蛋白含量的變化

2.4 各組大鼠海馬區(qū)p-β-catenin和β-catenin蛋白含量的變化

Western blot蛋白分析結(jié)果顯示，與Con組和SE 1 d組比較，SE 7 d組、SE 14 d組大鼠p-βcatenin蛋白含量均減少，β-catenin蛋白含量增加（P均＜0.05）；SE 14 d組大鼠p-β-catenin蛋白含量少于SE 7 d組，β-catenin蛋白含量高于SE 7 d組（P均＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠海馬區(qū)p-β-catenin和β-catenin蛋白含量的變化

3 討論

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的疾病之一。近年來(lái)新型抗癲癇藥物的不斷問(wèn)世，對(duì)癲癇患者有一定的治療效果，但仍有約30%的癲癇最終轉(zhuǎn)化為難治性癲癇。顳葉癲癇是最常見(jiàn)的難治性癲癇，占難治性癲癇的50%～70%[1]。研究[5-6]表明，海馬與大鼠的學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能密切相關(guān)，海馬硬化是顳葉癲癇最常見(jiàn)的病理改變，其基本特征為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞異常增生和苔蘚纖維出芽。癲癇發(fā)作后反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞異常激活，促進(jìn)了海馬神經(jīng)發(fā)生的增強(qiáng)[7]。GFAP特異地表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，可以作為星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物。本研究以腹腔注射氯化鋰-匹羅卡品成功建立癲癇動(dòng)物模型，通過(guò)蛋白電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SE 7 d組和SE 14 d組癲癇大鼠海馬GFAP蛋白表達(dá)水平升高，在癲癇早期（1～14 d），其蛋白表達(dá)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈上調(diào)趨勢(shì)，提示當(dāng)癲癇發(fā)作后反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞異常激活，與有關(guān)報(bào)道[7]一致。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，癲癇大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力較Con組大鼠差。在定位巡航實(shí)驗(yàn)中，SE 7 d組、SE 14 d組大鼠逃避潛伏期和巡航路程均較長(zhǎng)；空間探索實(shí)驗(yàn)中，在60 s內(nèi)SE 7 d組、SE 14 d組大鼠首次通過(guò)平臺(tái)的時(shí)間延長(zhǎng)，且穿越平臺(tái)的次數(shù)減少。以上結(jié)果提示癲癇發(fā)作后影響海馬神經(jīng)發(fā)生，促使大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下降，這可能與其神經(jīng)元丟失、減少及異常放電等多個(gè)因素密切相關(guān)[8]。

經(jīng)典的Wnts/β-catenin信號(hào)通路是神經(jīng)發(fā)生所必需的保守的發(fā)育性信號(hào)通路[9]，在創(chuàng)傷性腦損傷后，Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵分子被激活，與神經(jīng)元存活和穩(wěn)態(tài)相關(guān)的多種基因，如Bcl-1、Cyclin D1和c-myc表達(dá)上調(diào)，并且涉及這個(gè)信號(hào)通路的相關(guān)基因的變異和失活，最終導(dǎo)致海馬神經(jīng)發(fā)育不全和整個(gè)大腦畸形，從而誘發(fā)癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生。β-catenin在維持機(jī)體正常生理功能中起著重要的作用，癲癇發(fā)作時(shí)β-catenin分子表達(dá)含量增高，增多的β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，刺激細(xì)胞的增殖[10]。Wnts蛋白，尤其是Wnt3是神經(jīng)發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控因子。實(shí)驗(yàn)[11]表明，Wnt3a由周?chē)?xì)胞分泌，并與靶細(xì)胞表面的Frizzled受體和共受體Lrp5/6結(jié)合，在Wnts分子通道關(guān)閉的情況下，細(xì)胞質(zhì)中的Axin/APC/GSK-3β蛋白復(fù)合物使β-catenin磷酸化，胞內(nèi)β-catenin維持在較低水平，其不能進(jìn)入核內(nèi)參與細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程。有研究[12]發(fā)現(xiàn)，癲癇急性期引起神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)異常增多，提示抑制急性期海馬神經(jīng)發(fā)生可能降低癲癇的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，同時(shí)反饋調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵分子可能有助于緩解癲癇的發(fā)作。本研究發(fā)現(xiàn)，SD大鼠癲癇發(fā)作后Wnt3a和β-catenin蛋白表達(dá)含量增高，且在癲癇發(fā)作早期隨時(shí)間的延長(zhǎng)有上調(diào)趨勢(shì)。但p-β-catenin蛋白含量在癲癇發(fā)作早期無(wú)明顯變化，SE 14 d組p-β-catenin蛋白含量低于Con組，提示在癲癇發(fā)作后，Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵分子Wnt3a被激活，β-catenin磷酸化過(guò)程受抑制，胞內(nèi)游離的β-catenin含量增高，從而轉(zhuǎn)入核內(nèi)，參與細(xì)胞的增殖和分化進(jìn)程。對(duì)于Wnt信號(hào)通路上關(guān)鍵分子的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)是否對(duì)認(rèn)知、記憶、精神等產(chǎn)生影響還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，癲癇發(fā)作后大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，大鼠海馬GFAP、Wnt3a、β-catenin和p-β-catenin蛋白的表達(dá)異常。因此推測(cè)Wnts/β-catenin信號(hào)通路可能參與調(diào)控癲癇的發(fā)生、發(fā)展，至于Wnts/β-catenin信號(hào)通路如何發(fā)揮作用仍需進(jìn)一步深入研究。