劉澤世，呼 瑞，李 靖，殷 鑒，耿 燕，白 露

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科， 陜西 西安 710004； 2. 西北婦女兒童醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室， 陜西 西安 710061； 3. 空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院檢驗(yàn)科， 陜西 西安 710032)

碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細(xì)菌(carbapenem-resistant enterobacterales,CRE)引起的感染與較高的發(fā)病率和病死率顯著相關(guān)，在CRE引起的血流感染中，病死率可高達(dá)53.1%[1-2]，患者疾病負(fù)擔(dān)重。一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)89% CRE產(chǎn)生碳青霉烯酶[3]，可用于治療產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌目細(xì)菌(carbapenemase-producing enterobacterales,CPE)的藥物極少，替加環(huán)素、黏菌素以及頭孢他啶/阿維巴坦是目前國(guó)內(nèi)主要的治療藥物。而對(duì)不同類型的碳青霉烯酶，頭孢他啶/阿維巴坦體外抗菌活性作用不同：頭孢他啶/阿維巴坦對(duì)金屬酶無效，但對(duì)絲氨酸酶、AmpC酶以及ESBL酶敏感[4-5]。據(jù)報(bào)道，對(duì)于CRE血流感染的治療，初始抗菌藥物的治療對(duì)提高患者生存率有重大的臨床意義[6]，因此，快速檢測(cè)血流感染中產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌目細(xì)菌并進(jìn)行碳青霉烯酶型的鑒定，對(duì)早期優(yōu)化抗菌藥物治療和提高生存率是必不可少的。本研究旨在評(píng)估兩種商品化膠體金試劑對(duì)碳青霉烯耐藥腸桿菌目細(xì)菌五種主要碳青霉烯酶[klebsiella pneumoniae carbapenemase(KPC)、new delhi metallo-β-lactamase(NDM)、verona integron-encoded metallo-β-lactamase(VIM)、imipenemase metallo-β-lactamase(IMP)、oxacillinase48(OXA)-48]的檢測(cè)能力，以期為臨床CPE的診斷、治療以及感染控制提供參考數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1菌株來源 復(fù)蘇西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院2019—2020年血培養(yǎng)標(biāo)本陽(yáng)性非重復(fù)CRE57株和碳青霉烯類敏感腸桿菌目(carbapenem-Sensitive Enterobacterales,CSE)22株，包括肺炎克雷伯菌41株，大腸埃希菌14株，陰溝腸桿菌12株，產(chǎn)酸克雷伯菌6株，弗氏檸檬酸桿菌3株，產(chǎn)氣腸桿菌3株。

1.2主要儀器與試劑 VITEK-Ⅱ-COMPACT鑒定儀(BioMérieux公司，法國(guó))，血平板、麥康凱平板(安圖公司，鄭州)，NG-Test CARBA 5檢測(cè)試劑盒及陽(yáng)性血培養(yǎng)物檢測(cè)樣品制備試劑盒(中生眾捷生物技術(shù)，長(zhǎng)沙)，金山川碳青霉烯酶耐藥檢測(cè)試劑(金山川科技發(fā)展有限公司，北京)。

1.3菌株鑒定 復(fù)蘇57株血培養(yǎng)細(xì)菌，經(jīng)VITEK-Ⅱ-COMPACT鑒定儀鑒定均為腸桿菌目細(xì)菌，且對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥。

1.4NG-Test CARBA5 滴入5滴(約150 μL)提取緩沖液于無菌EP管中；1 μL接種環(huán)取一環(huán)細(xì)菌樣本置于含150 mL提取緩沖液的EP管中，使用渦旋振蕩器混合振蕩幾秒鐘使之混合均勻；一次性移液管吸取100 μL制備好的混合液，加入到檢測(cè)卡盒上標(biāo)記了“S”的樣本孔，加樣后于室溫下放置15 min，在20 min內(nèi)讀取結(jié)果。

1.5金山川碳青霉烯酶耐藥檢測(cè) 試劑盒與接種待測(cè)菌株血平板恢復(fù)至室溫后，于無菌EP管中滴加10滴樣本處理液，使用無菌接種環(huán)挑取適量菌株至EP管中，充分?jǐn)嚢?，使溶液混合混勻，用移液槍吸?0 μL稀釋后的樣本加至檢測(cè)卡的加樣孔處，10 min后讀取結(jié)果。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以PCR測(cè)序結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算NG-Test CARBA 5和金山川碳青霉烯酶耐藥檢測(cè)的敏感度、特異度。

2 結(jié) 果

2.1碳青霉烯酶基因的檢測(cè)對(duì)57株CRE和22株CSE采用PCR方法檢測(cè)碳青霉烯酶基因(blaKPC, blaNDM, blaOXA-48-like,blaIMP和blaVIM)。PCR所用引物與條件參考Poirel等的研究[7]。對(duì)PCR陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并應(yīng)用GenBank中Blast進(jìn)行序列比對(duì)。結(jié)果顯示，57株CRE均檢出碳青霉烯酶基因，包括blaKPC(n=26)、blaNDM(n=21)、blaIMP(n=3)、blaKPC+NDM(n=3)、blaNDM +IMP(n=4)。22株CSE菌株未檢測(cè)到任何碳青霉烯酶基因。

2.2膠體金免疫層析法酶型檢測(cè) 57株CRE經(jīng)NG-Test CARBA 5可檢測(cè)出酶型KPC(n=26)、NDM(n=21)、IMP(n=3)、KPC+NDM(n=3)和IMP+NDM(n=4)。經(jīng)金山川碳青霉烯酶耐藥檢測(cè)可檢測(cè)出酶型KPC(n=27)、NDM(n=23)、IMP(n=3)、KPC+NDM(n=2)和IMP+NDM(n=2)。大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣克雷伯菌和弗氏檸檬酸桿菌均產(chǎn)單一酶型，兩種檢測(cè)方法結(jié)果一致。肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌檢出單酶型和雙酶型，其中，單酶型菌株經(jīng)NG-Test CARBA 5和金山川碳青霉烯酶耐藥檢測(cè)結(jié)果一致；雙酶型檢測(cè)時(shí)，NG-Test CARBA 5均可檢測(cè)出，而金山川碳青霉烯酶耐藥檢測(cè)在兩種酶型時(shí)，部分菌株可檢測(cè)到兩種酶型，部分菌株僅可檢測(cè)出一種酶型，存在漏檢KPC或IMP。兩種方法均未檢測(cè)出VIM和OXA-48-like酶型。22株CSE經(jīng)兩種方法檢測(cè)均未檢出任何酶型。見表1。

表1 157株CRE和22株CSE經(jīng)NG-Test CARBA 5和金山川碳青霉烯酶耐藥檢測(cè)酶型檢測(cè)結(jié)果Table 1 Isoenzyme test results of 57 CRE and 22CSE by NG-Test CARBA 5 and Jinshanchuan carbapenemase resistance test

3 討 論

碳青霉烯酶的快速檢測(cè)有助于預(yù)防和控制產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌所引起的院內(nèi)傳播和感染。而快速鑒定碳青霉烯酶的類型有助于指導(dǎo)治療產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌的感染。據(jù)報(bào)道，blaKPC-2和blaNDM是我國(guó)碳青霉烯類抗生素耐藥腸桿菌中最常見的碳青霉烯酶基因[8]。我國(guó)耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，CRE耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻，肺炎克雷伯菌作為CRE中耐藥率上升最快的細(xì)菌，其對(duì)碳青霉烯類藥物(美羅培南)的耐藥率已由2005年的2.9%攀升至2020年的26.4%。中國(guó)一項(xiàng)CRE碳青霉烯酶分布調(diào)查顯示[9]，產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌目細(xì)菌高97.4%，在成人和兒童中分別流行KPC-2和NDM酶，對(duì)產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌目細(xì)菌快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)，有助于合理選擇抗菌藥物治療，減緩細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，預(yù)防和控制產(chǎn)酶菌株的傳播。此外，若能進(jìn)一步快速準(zhǔn)確的區(qū)分碳青霉烯酶類型，對(duì)指導(dǎo)產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌目細(xì)菌感染的治療具有重要意義。據(jù)報(bào)道，大多數(shù)產(chǎn)KPC-2或OXA-48樣碳青霉烯酶菌株對(duì)國(guó)內(nèi)2019年新上市的酶抑制劑復(fù)合制劑頭孢他啶/阿維巴坦有抗菌活性，相反，產(chǎn)金屬酶(NDM、VIM、IMP)菌株對(duì)頭孢他啶/阿維巴坦不敏感，臨床需根據(jù)藥敏結(jié)果考慮使用其他抗菌藥物，如替加環(huán)素、黏菌素或氨曲南/阿維巴坦[10]。

目前臨床實(shí)驗(yàn)室開展了諸如Carba NP試驗(yàn)、改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)、碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)等表型檢測(cè)方法檢測(cè)碳青霉烯酶。Carba NP試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，并可快速(4～6 h)得出陽(yáng)性結(jié)果，檢測(cè)碳青霉烯酶的敏感度在73%～100%不等，適合所有臨床微生物實(shí)驗(yàn)室開展，但此方法因某些特殊試劑有效期短，需自制，顏色判斷受主觀因素和培養(yǎng)基種類的影響，且對(duì)于某些類型碳青霉烯酶(如OXA-48，-23)檢測(cè)水平較低，不推薦作為常規(guī)檢測(cè)方法[11-13]。值得注意的是，雖然近年來上市了一些基于Carba NP試驗(yàn)的商品化試劑，如Neo-Rapid Carb screen，Carb Blue screen和in-house Carba NP等，但依然未克服對(duì)OXA-48-like型碳青霉烯酶檢測(cè)敏感度低的弊端[14-15]。

改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)(modifified carbapenem inactivation methods,mCIM)檢測(cè)碳青霉烯酶敏感度為93%～100%、特異度為97%～100%，當(dāng)mCIM和EDTA-CIM 檢測(cè)金屬碳青霉烯酶時(shí)，敏感度為89.3%，特異度為98.7%。聯(lián)合使用可判斷出腸桿菌目細(xì)菌產(chǎn)生碳青霉烯酶的種類，但此種方法的不足之處在于需過夜孵育，延長(zhǎng)臨床周轉(zhuǎn)時(shí)間，若存在同時(shí)產(chǎn)絲氨酸酶和金屬β-內(nèi)酰胺酶的菌株，eCIM會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果[16]。

同樣，碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)也需過夜孵育，其在檢測(cè)產(chǎn)單一酶型(KPC和金屬酶)時(shí)敏感度高(100%)，但檢測(cè)同時(shí)產(chǎn)KPC和金屬酶的菌株敏感度和特異度分別為96.8%和98.8%[17]，且無法檢測(cè)到OXA-48酶。在腸桿菌中用硼酸衍生物(boronic acid derivatives，BA)和吡啶二羧酸(dipicolinic acid，DPA)/乙二胺四乙酸進(jìn)行的碳青霉烯酶抑制試驗(yàn)。鑒定A、B和OXA-48類碳青霉烯酶的敏感性為95%、90%和100%，特異度為96%至100%[18]。

與表型檢測(cè)方法相比，免疫層析法能快速簡(jiǎn)便地對(duì)臨床上分離菌株進(jìn)行碳青霉烯酶檢測(cè)。有研究表明，NG-Test CARBA 5在血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中的敏感度和特異度分別在95.8%～97.7%和93.3%～96.1%之間[19-20]。NG-Test CARBA 5可以快速檢測(cè)五種碳青霉烯酶：KPC、OXA-48-like、IMP、NDM和VIM，金山川碳青霉烯酶耐藥檢測(cè)亦可五種主要碳青霉烯酶：KPC、NDM、VIM、IMP、OXA-48。NG-Test CARBA 5和金山川碳青霉烯酶耐藥檢測(cè)均是膠體金免疫層析法，一個(gè)測(cè)試盒即可完成對(duì)五種的酶型的測(cè)定，20 min內(nèi)即可得到結(jié)果。對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥腸桿菌目細(xì)菌已在全球蔓延，如何盡早檢出并針對(duì)不同酶型進(jìn)行優(yōu)化治療成為關(guān)鍵問題[21]。因此，檢測(cè)碳青霉烯酶基因(如blaKPC、blaOXA-48、blaIMP、blaNDM和blaVIM)對(duì)于感染的控制和選擇合適的抗感染治療均至關(guān)重要。 盡早的檢出五種酶型，可以及時(shí)將頭孢他啶阿維巴坦與其他β-內(nèi)酰胺/ β-內(nèi)酰胺酶抑制劑聯(lián)合使用。五種酶型是腸桿菌目細(xì)菌常見的碳青霉烯酶型，可以區(qū)分絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶與金屬β-內(nèi)酰胺酶，不僅有助于優(yōu)化抗生素管理，改善預(yù)后，甚至可以預(yù)防出現(xiàn)進(jìn)一步耐藥[22-23]。

本研究中，57株CRE分離株和22株CSE分離株經(jīng)NG-Test CARBA 5和金山川碳青霉烯酶耐藥檢測(cè)。無論單一酶型或雙酶型時(shí)，NG-Test CARBA 5對(duì)KPC、NDM、IMP、KPC+NDM和NDM+IMP的檢測(cè)率均為100%，且與PCR結(jié)果一致，沒有假陽(yáng)性。金山川碳青霉烯酶耐藥檢測(cè)可有效檢測(cè)單一酶型，且與NG-Test CARBA 5符合率可達(dá)100%。但當(dāng)存在雙酶型時(shí)，金山川碳青霉烯酶耐藥檢測(cè)部分菌株可檢測(cè)出雙酶型，部分菌株只能檢測(cè)出其中一種酶型，存在漏檢IMP或KPC酶型，這可能與兩條帶表達(dá)的強(qiáng)度有關(guān)[24-25]。金山川碳青霉烯酶耐藥檢測(cè)沒有假陽(yáng)性。

兩種膠體金方法操作簡(jiǎn)單，能快速準(zhǔn)確的區(qū)分碳青霉烯酶酶型，有助于簡(jiǎn)化臨床上常規(guī)檢測(cè)碳青霉烯酶的工作流程，適用于臨床快速診斷碳青霉烯酶并進(jìn)行酶型區(qū)分，為臨床提供確切的碳青霉烯酶型別，優(yōu)化治療方案。而可能由于VIM流行率較低的原因，本次研究中并未檢測(cè)到VIM。NG-Test CARBA 5和金山川碳青霉烯酶耐藥檢測(cè)無法區(qū)分OXA-48-like的變異體(OXA-48-、OXA-181-、OXA-163-、OXA-232-和OXA-405型碳青霉烯酶)，如果菌株存在上述變異體型碳青霉烯酶，則可能被認(rèn)為未產(chǎn)OXA-48-like碳青霉烯酶，從而得到假陰性結(jié)果。這些檢測(cè)方法的檢測(cè)范圍有限，僅涵蓋了常見的碳青霉烯酶，可能會(huì)漏檢其他碳青霉烯酶，如GES、IMI和GIM等。本實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)到VIM和OXA-48酶，其原因之一可能是因?yàn)閂IM和OXA-48在我國(guó)流行率不高，二是標(biāo)本量不充分，未能涵蓋到這兩種酶型，我們?nèi)孕枋占a(chǎn)VIM和OXA-48酶菌株，以期對(duì)兩種膠體金方法檢測(cè)五種主要的碳青霉烯酶的性能進(jìn)行更全面的評(píng)估。

總之，兩種試劑都為檢測(cè)所有常見碳青霉烯酶提供了一種新的方法，適合于大面積初篩以確定是否產(chǎn)碳青霉烯酶，兩種檢測(cè)方法結(jié)合使用可以更好的減少CRE的發(fā)生率，在控制感染暴發(fā)應(yīng)用前景廣闊[26]。