李文紅，程 英，金劍雪，周宇航，李鳳良

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，貴陽 550006)

【研究意義】我國(guó)十字花科蔬菜上發(fā)生的蚜蟲主要有桃蚜[Myzuspersicae(Sulzer)]、甘藍(lán)蚜[Brevicorynebrassicae(L.)]和蘿卜蚜[Lipaphiserysimi(Kaltenbach)]等[1-2]。菜蚜分布廣、繁殖快、危害重，加之傳播病毒病，常使蔬菜產(chǎn)量、品質(zhì)和食用價(jià)值顯著下降?；瘜W(xué)防治為當(dāng)前防控菜蚜的主要手段，然因其容易導(dǎo)致田間抗藥性、農(nóng)藥殘留等問題，亟需開發(fā)綠色可持續(xù)的防控措施?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】氣味結(jié)合蛋白(Odorant binding protein，OBP)和化學(xué)感受蛋白(Chemosensory protein，CSP)是兩類水溶性的小分子蛋白家族，是昆蟲化學(xué)感受過程中信息素和氣味的識(shí)別載體[3-5]。化學(xué)感受在蚜蟲取食、交配、繁殖、驅(qū)避天敵等生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。蚜蟲依賴化學(xué)信號(hào)(如植物的揮發(fā)物和種內(nèi)特異的信息素)精準(zhǔn)定位寄主、選擇配偶和避免天敵等[6]。研究蚜蟲與蚜蟲、植物、天敵、競(jìng)爭(zhēng)者和互利者之間的互作將有助于探究新的環(huán)境友好型防治策略。目前,隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)、棉蚜(Aphisgossypii)、麥長(zhǎng)管蚜(Sitobionavenae)和桃蚜(M.persicae)等蚜蟲的多個(gè)OBP和CSP基因已被鑒定[7-10],桃蚜中發(fā)現(xiàn)9個(gè)OBP基因和9個(gè)CSP基因，甘藍(lán)蚜中只鑒定OBP3基因序列，蘿卜蚜中只鑒定出OBP3和OBP7基因[10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】為豐富甘藍(lán)蚜和蘿卜蚜的OBP和CSP基因序列，通過生物信息學(xué)方法，基于已公開上傳的甘藍(lán)蚜和蘿卜蚜的SRA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)甘藍(lán)蚜和蘿卜蚜的OBP和CSP基因進(jìn)行鑒定?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對(duì)3種菜蚜(桃蚜、甘藍(lán)蚜和蘿卜蚜)的OBP和CSP基因進(jìn)行序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)分析，為菜蚜氣味識(shí)別和化學(xué)感受相關(guān)研究和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 甘藍(lán)蚜和蘿卜蚜本地轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的建立

桃蚜OBP和CSP基因鑒定已有報(bào)道，故本文擬通過生物信息學(xué)鑒定甘藍(lán)蚜和蘿卜的OBP和CSP基因。在NCBI網(wǎng)站下載SRA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)SRX2355992(甘藍(lán)蚜，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=SRX2355992)和SRX2362226(蘿卜蚜，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=SRX2362226)，然后進(jìn)行從頭組裝和注釋。采用Trimmomatic軟件(http://www.usadellab.org/cms/uploads/supplementary/ Trimmomatic)對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)(raw data)進(jìn)行接頭序列的去除和序列的過濾以得到高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)(clean data)。采用Trinity 軟件(http://trinityrnaseq.sourceforge.net/)對(duì)clean data進(jìn)行從頭組裝。針對(duì)拼接得到的unigene序列，使用BLASTX比對(duì)(BLAST+ 2.7.1，比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)：E≤10-5)NR、string、KEGG數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行基因功能注釋，建立甘藍(lán)蚜和蘿卜蚜本地轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。

1.2 甘藍(lán)蚜和蘿卜蚜OBP和CSP基因序列的挖掘

基于報(bào)道的豌豆蚜和桃蚜OBP和CSP基因的氨基酸序列[7，10-11]，采用Bioedit軟件的本地BLAST程序，在甘藍(lán)蚜和蘿卜蚜本地轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行tBLASTn查找可能的甘藍(lán)蚜和蘿卜蚜OBP和CSP基因的核酸序列，再采用ExPASy在線翻譯網(wǎng)站(https://web.expasy.org/translate/)預(yù)測(cè)對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，用于下一步構(gòu)建進(jìn)化樹和序列比對(duì)分析。

1.3 多序列比對(duì)、Motif分析和進(jìn)化樹構(gòu)建

采用ClustalX軟件對(duì)多個(gè)序列進(jìn)行比對(duì)(參數(shù)選擇為默認(rèn)設(shè)置)；采用Genedoc軟件[12]對(duì)比對(duì)的結(jié)果進(jìn)行手動(dòng)編輯、結(jié)果顯示設(shè)置以及序列間相似度計(jì)算；采用SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0/)預(yù)測(cè)蛋白N端是否含有信號(hào)肽。采用MEME在線網(wǎng)站(http://meme.sdsc.edu)對(duì)所有OBP和CSP序列進(jìn)行Motif分析，參數(shù)設(shè)置為最小寬度=5、最大寬度=10、查找Motif最大數(shù)目=8。采用MEGA 7.0.26 軟件[13]的鄰位相鄰算法(Neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap分析重復(fù)數(shù)為1000，替換方法為poisson model，其它參數(shù)選擇為默認(rèn)設(shè)置。

1.4 3種菜蚜OBP三維結(jié)構(gòu)同源建模

采用NCBI的PSI-BLAST在線程序在蛋白組三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank)中對(duì)3種菜蚜OBP和CSP序列進(jìn)行查找。采用SWISS MODEL在線服務(wù)器(https://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行同源建模，參數(shù)選擇為默認(rèn)設(shè)置。采用DeepViewer 軟件(SWISS-PdbViewer,https://spdbv.vital-it.ch/)對(duì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行顯示設(shè)置。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種菜蚜OBPs和CSPs基因的鑒定

通過對(duì)建立的甘藍(lán)蚜和蘿卜蚜本地轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行BLAST查找，得到甘藍(lán)蚜12個(gè)OBP基因和8個(gè)CSP基因序列，蘿卜蚜12個(gè)OBP基因和12個(gè)CSP基因序列；基于Wang[10]和Filipe[11]報(bào)道的桃蚜OBP和CSP基因序列以及豌豆蚜OBP和CSP基因序列，通過序列比對(duì)和BLAST查找，共得到桃蚜13個(gè)OBP基因和9個(gè)CSP基因序列。同樣基于Zhou[7]和Filipe[11]報(bào)道的豌豆蚜OBP和CSP基因序列，通過序列比對(duì)和NCBI在線BLAST核對(duì)，共得到豌豆蚜17個(gè)OBP基因全長(zhǎng)序列和10個(gè)CSP基因全長(zhǎng)序列(表1)。

2.2 甘藍(lán)蚜、蘿卜蚜、桃蚜和豌豆蚜OBPs和CSPs基因的序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(圖1～4)發(fā)現(xiàn)，3種菜蚜甘藍(lán)蚜、蘿卜蚜和桃蚜OBP和CSP基因序列在豌豆蚜中均有相對(duì)應(yīng)的直系同源基因，因此參考豌豆蚜的OBP和CSP基因命名對(duì)3種菜蚜OBP和CSP基因進(jìn)行命名(表1)。序列比對(duì)結(jié)果表明，直系同源基因在3種菜蚜之間相似度較高，3種菜蚜的OBP2、OBP3、OBP4、OBP5、OBP8和OBP13相似度均在90%以上；但相同物種的不同OBP基因間相似度較低，均不超過30%(表2，圖1)。3種菜蚜的CSP2、CSP4、CSP5、CSP6和CSP7的相似度都在90%以上，但相同物種的不同CSP基因間相似度較低，均不超過40%(表3，圖2)。從4種蚜蟲(甘藍(lán)蚜、蘿卜蚜、桃蚜和豌豆蚜)OBP和CSP基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹中也發(fā)現(xiàn)類似特征(圖3～4)，即直系同源基因的同源性高，而不同基因的同源性較低，分化程度高。

表1 桃蚜、甘藍(lán)蚜和蘿卜蚜轉(zhuǎn)錄組中鑒定得到的OBPs和CSPs

圖中灰色標(biāo)示半胱氨酸，倒三角和黑框標(biāo)示保守半胱氨酸模式序列Highlights with gray color indicates show cysteines,inverted triangles and black box indicate conversed cysteine pattern sequences.圖1 甘藍(lán)蚜、蘿卜蚜和桃蚜的OBP基因序列比對(duì)Fig.1 Sequence comparison of OBP genes of B.brassicae,L.erysimi and M.persicae

三角標(biāo)示保守半胱氨酸模式序列，黑底白字顯示相似度100%的氨基酸位點(diǎn)，灰底白字顯示相似度80%的氨基酸位點(diǎn)Inverted triangles indicates conversed cysteine pattern sequence, white letters with black shading indicates amino acid sites with 100% similarity and white letters with gray shading indicates amino acid sites with 80% similarity圖2 甘藍(lán)蚜、蘿卜蚜和桃蚜CSP基因序列比對(duì)Fig.2 Sequence comparison of CSP genes of B.brassicae,L.erysimi and M.persicae

2.3 保守序列分析和Motif預(yù)測(cè)

通過SignalP 5.0在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)豌豆蚜和3種菜蚜(甘藍(lán)蚜、蘿卜蚜、桃蚜)OBP和CSP基因序列的信號(hào)肽發(fā)現(xiàn)，除MperOBP13、MperOBP16、BbraOBP10、BbraOBP13、LeryOBP13、BbraCSP8、LeryCSP8和LeryCSP9外，其余序列的N端均有信號(hào)肽。3種菜蚜的OBP1-3、OBP7-12和 OBP14-17屬于Classic OBPs，具有Classic OBPs的半胱氨酸模式識(shí)別序列：C1-X22-34-C2-X3-C3-X41-46-C4-X7-13-C5-X8-C6。OBP4也屬于Classic OBPs，但是在C1和C2之間有49個(gè)氨基酸；OBP5和OBP6屬于Plus-C OBPs，除Classic OBPs的6個(gè)保守半胱氨酸，C6下游還有額外的1～2個(gè)半胱氨酸和C6下游相鄰的保守位點(diǎn)脯氨酸(圖1)。OBP13中的半胱氨酸特征缺少Classic OBPs的C1，但是C端多了一個(gè)C7(圖1)。而3種菜蚜CSP基因的保守半胱氨酸模式識(shí)別序列較一致：C1-X6-C2-X18-19-C3-X2-C4。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)(圖2)，CSP基因除了4個(gè)保守半胱氨酸位點(diǎn)之外，還有9個(gè)保守氨基酸位點(diǎn)。

圖3 甘藍(lán)蚜、蘿卜蚜、桃蚜和豌豆蚜OBP基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹和Motif分析Fig.3 Phylogenetic tree and Motif analysis of OBP genes of B.brassicae, L.erysimi, M.persicae and A.pisum

保守基序(motif)是功能性結(jié)構(gòu)域的主要元件。采用MEME預(yù)測(cè)出的蚜蟲OBPs的8個(gè)motifs中，僅3個(gè)motifs(Motif 1、Motif 2和Motif 4)出現(xiàn)在所有OBP基因中(圖3)。Motif 1和Motif 2中都含有2個(gè)半胱氨酸，分別為Classic OBPs的C2-C3和C5-C6，Motif 4和Motif 6中含有1個(gè)半胱氨酸。這些motif特征表明蚜蟲OBPs不同基因間序列差異較大。3種菜蚜CSP基因的8個(gè)預(yù)測(cè)motifs中，有5個(gè)motifs(Motif 1～5)出現(xiàn)在所有CSP基因中(圖4)，其中CSP1、CSP2、CSP4、CSP5、CSP6的motif排序完全相同(6-4-1-5-2-8-3-7)。在系統(tǒng)進(jìn)化樹上也發(fā)現(xiàn)此5個(gè)CSP基因和CSP10聚在一起。表明，相對(duì)OBP基因，蚜蟲CSP不同基因間序列分化程度較低。

圖4 甘藍(lán)蚜、蘿卜蚜、桃蚜和豌豆蚜CSP基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹和motif分析Fig.4 Phylogenetic tree and motif analysis of CSP genes of B.brassicae,L.erysimi,M.persicae and A.pisum

2.4 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過PSI-BLAST對(duì)每個(gè)蚜蟲OBP和CSP序列的同源三維結(jié)構(gòu)模板進(jìn)行查找發(fā)現(xiàn)，僅蚜蟲OBP3有較高相似度的三維結(jié)構(gòu)模板，即文獻(xiàn)報(bào)道的萵苣蚜(Nasonoviaribisnigri)和巢菜修尾蚜(Megouraviciae)的OBP3晶體結(jié)構(gòu)[14]?；贛.viciaeOBP3晶體結(jié)構(gòu)模板(PDB數(shù)據(jù)庫編號(hào)：4z39)，同源構(gòu)建了3種菜蚜的OBP3蛋白三維結(jié)構(gòu)(圖5)，發(fā)現(xiàn)其三維結(jié)構(gòu)相似度極高，推測(cè)OBP3在3種菜蚜中與氣味小分子結(jié)合的功能可能相似。

表2 甘藍(lán)蚜、蘿卜蚜和桃蚜OBP基因之間的相似度

表3 甘藍(lán)蚜、蘿卜蚜和桃蚜CSP基因之間的相似度

圖5 豌豆蚜、甘藍(lán)蚜、蘿卜蚜和桃蚜OBP3蛋白的三維結(jié)構(gòu)重疊Fig.5 Superposition of 3D structures of OBP3 protein of A.pisum,B.brassicae,L.erysimi and M.persicae

3 討 論

隨著組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的昆蟲OBP和CSP基因被鑒定出來。Zhou[7]鑒定了15個(gè)豌豆蚜OBP基因序列和13個(gè)CSP基因序列。其中豌豆蚜OBP1-11和CSP1-10基因序列為全長(zhǎng)序列。將剩余OBP片段序列進(jìn)行NCBI在線BLAST查找，新增全長(zhǎng)序列OBP12和OBP13；Filipe[11]文章附件中的豌豆蚜OBP14、OBP15和OBP19基因序列與已鑒定的全長(zhǎng)序列完全重復(fù)，且附件中豌豆蚜OBP16和OBP17為完全重復(fù)序列[11]，本研究將其重新命名為ApisOBP14。通過BLAST查找，在NCBI數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)1個(gè)與ApisOBP14相似度比較高的基因序列(登錄號(hào)：XP 003245156)，將其命名為ApisOBP15。Filipe[11]文章附件中OBP18序列是不完整的拼接序列，本研究在NCBI找到其全長(zhǎng)序列(XP_016659328)，將其命名為ApisOBP17。本研究命名的ApisOBP16(XP_016656015)是從NCBI找到的1個(gè)桃蚜新OBP基因的同源基因(XP_022178221)。Wang[10]共鑒定出9個(gè)桃蚜OBP基因和9個(gè)桃蚜CSP基因。本研究基于豌豆蚜ApisOBP1-17基因序列和NCBI注釋為OBP的桃蚜基因序列，進(jìn)行序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析新鑒定出的4個(gè)桃蚜OBP基因(MperOBP14-17)在豌豆蚜中都有直系同源基因存在；同樣，鑒定得到的甘藍(lán)蚜12個(gè)OBP基因和8個(gè)CSP基因序列以及蘿卜蚜12個(gè)OBP基因和12個(gè)CSP基因序列，在豌豆蚜和桃蚜中都有其直系同源基因。以上表明，蚜蟲同類型的OBP和CSP基因種間相當(dāng)保守。

本研究并未找到桃蚜、甘藍(lán)蚜和蘿卜蚜中CSP3、OBP1、OBP11、OBP12和OBP17的同源基因。在桃蚜中有豌豆蚜OBP16的同源基因，但在甘藍(lán)蚜和蘿卜蚜中并未發(fā)現(xiàn)。CSP3和OBP1同源基因在棉蚜A.gossypii中也未發(fā)現(xiàn)[8]，推測(cè)這些基因很可能在蚜蟲進(jìn)化過程中丟失[10]。

序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析表明，蚜蟲不同OBP和CSP之間相似度很低，提示其與配體結(jié)合的多樣性。迄今為止，在蚜蟲中僅少數(shù)OBP(如OBP3和OBP7)的功能和與氣味分子結(jié)合活性被研究報(bào)道[15-19]。豌豆蚜OBP3和OBP7可以與報(bào)警信息素主要成分E-β-法尼烯(E-β-famesene，Eβf)有較高的結(jié)合活性。多數(shù)蚜蟲可分泌和釋放Eβf，當(dāng)受到寄生物或捕食者的攻擊等外在壓力時(shí)，警告相近的同類蚜蟲逃離。報(bào)警信息素可以與化學(xué)殺蟲劑聯(lián)合使用以有效控制蚜蟲危害，減少殺蟲劑的使用量及抗性的產(chǎn)生，有利于生態(tài)環(huán)境保護(hù)。Sun[20]將Eβf與OBP3結(jié)合區(qū)域的基團(tuán)與噻蟲啉的殺蟲基團(tuán)融合，成功合成了對(duì)蚜蟲具驅(qū)避和殺蟲的雙重作用的化合物。

目前，蚜蟲中除了OBP3和OBP7等少數(shù)OBP，蚜蟲其它的OBP和所有CSP的基因功能未見報(bào)道。本研究通過生物信息學(xué)方法鑒定得到甘藍(lán)蚜和蘿卜蚜的OBP和CSP基因序列，為未來開展菜蚜氣味識(shí)別和化學(xué)感受相關(guān)實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用提供參考。

4 結(jié) 論

研究基于甘藍(lán)蚜和蘿卜蚜的公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用BLAST查找和序列比對(duì)鑒定出12個(gè)甘藍(lán)蚜OBP基因、8個(gè)甘藍(lán)蚜CSP基因、12個(gè)蘿卜蚜OBP基因和12個(gè)蘿卜蚜CSP基因序列；通過與桃蚜和豌豆蚜進(jìn)行序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)四種蚜蟲OBP和CSP直系同源基因的同源性高，但相同物種的不同OBP和CSP基因間相似度較低；基于保守半胱氨酸序列分析和Motif特征分析發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)蚜、蘿卜蚜和桃蚜CSP基因比OBP基因更保守；利用同源建模方法發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)蚜、蘿卜蚜、桃蚜和豌豆蚜OBP3蛋白三維結(jié)構(gòu)極其相似。