孫厚民，李陸梅，祝洪偉，陳玉霞，孫 鵬，楚電峰，范根成

（青島易邦生物工程有限公司，動物基因工程疫苗國家重點實驗室，山東青島 266100）

貓病毒性鼻氣管炎（feline viral rhinotracheitis，F(xiàn)VR）是由貓皰疹病毒Ⅰ型（feline herpesvirus-1，F(xiàn)HV-1）引起貓的一種急性、高度接觸性上呼吸道疾病，以打噴嚏、流淚以及結(jié)膜炎和鼻炎為主要臨床特征[1]，主要侵害幼貓，引起的發(fā)病率達100%，死亡率約為50%，對成年貓的病死率達20%～30%，是目前已知的重要貓呼吸道疾病之一[2]。FHV-1 是皰疹病毒科甲型皰疹病毒亞科水痘病毒屬成員，具有皰疹病毒的一般特性，病毒粒子直徑為126～167 nm，病毒粒子中心致密，外有囊膜，為雙股DNA 病毒，基因組大小為126～134 kb，立體對稱的核衣殼上分布有162 個殼粒[3]。FHV-1 于1958 年首次在美國被分離到[4]，現(xiàn)在世界范圍內(nèi)廣泛流行[5-10]。為了解山東省青島市FVR 的流行情況，開展了FHV-1 感染情況篩查，并對篩查結(jié)果進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本信息 218 份貓拭子樣本編號為1～218號，來源于青島市市區(qū)及所轄的膠州市、平度市和萊西市，其中1～80 號在寵物貓主人家里采集，81～154 號采集于寵物醫(yī)院，155～194 號采集于寵物市場，195～218 號采集于寵物救助站；60 份貓血清樣本編號為1～60 號，其中1～40 號來源于寵物醫(yī)院，41～60 號來源于寵物救助站。

1.1.2 主要試劑及儀器 FHV-1 毒株和貓腎傳代細胞（F81），由動物基因工程疫苗國家重點實驗室提供；DMEM 培養(yǎng)基和胰酶，均購自Hyclone公司；DNA 快速提取試劑盒，購自杭州博日科技股份有限公司；離心機，購自德國Sigma 公司；PremixTaq及2 000 bp DNA Marker，均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；PCR 儀，購自德國Biometra 公司；核酸瓊脂糖凝膠電泳儀，購自北京市六一儀器廠；凝膠成像分析儀，購自美國Bio-RAD 公司；倒置生物顯微鏡，購自徠卡顯微系統(tǒng)（上海）有限公司；CO2培養(yǎng)箱，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集與處理

1.2.1.1 拭子樣本 用無菌棉拭子采集被檢貓眼鼻拭子，將拭子懸浮于無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）中，漩渦振蕩1 min，除菌過濾后，取200 μL 按DNA提取試劑盒說明書提取DNA，將處理后的DNA樣品直接使用或于-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 血清樣本 前肢靜脈采血1～2 mL，37 ℃放置1 h，4 ℃放置30 min 凝固后，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，取上清直接使用或于-40 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 拭子樣本檢測

1.2.2.1 基因擴增 利用針對FHV-1gD基因建立的PCR 方法，對樣本進行基因序列檢測。檢測用上游引物FHV（gD）-F：atgatgacacgtctacattt；下游引物FHV（gD）-R：ttaaggatggtgagttgtat。擴增片段大小為1 125 bp。反應體系組成（25.0 μL）：PremixTaq12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，提取的DNA 樣本2.0 μL，ddH2O 9.5 μL。反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸100 s，35 個循環(huán)；72 ℃最終延伸5 min。

1.2.2.2 PCR 產(chǎn)物檢測 取10 μL 擴增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/mL EB）進行電泳鑒定。電泳緩沖液為1×TAE，130 V 電泳25 min，在凝膠成像分析儀下觀察PCR 產(chǎn)物條帶在凝膠中的位置，以2 000 bp DNA Marker 為參照物，判定結(jié)果。將PCR 陽性擴增片段進行測序，然后與GenBank中FHV-1 序列進行比對[11]。

1.2.2.3 陽性樣本復測 將所有PCR 檢測為陽性的樣本進行復測，復測仍為陽性的樣本判為陽性。

1.2.3 TCID50測定 將FHV-1 病毒液用含2%FBS 的DMEM 進行10 倍倍比稀釋，共稀釋12 個梯度，取長滿單層F81 細胞的96 孔細胞培養(yǎng)板，倒出生長液，將稀釋好的病毒液加入到96 孔板中，每孔100 μL，每個稀釋度重復5 個孔；輕微搖動混勻后于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日顯微鏡下進行細胞病變（CPE）觀察，連續(xù)觀察5 d；出現(xiàn)CPE 的孔記為“+”，未出現(xiàn)的記為“-”，按照Reed-Muench 法[12]計算該病毒懸液的TCID50。

1.2.4 血清樣品中和抗體效價測定 根據(jù)測定的TCID50值，將FHV-1 病毒液稀釋成2 00 個TCID50/0.1 mL；將待測血清樣品56 ℃滅活30 min，然后用含2% FBS 的DMEM 作2 倍倍比稀釋至1:1 024；吸取各稀釋度血清500 μL 加入到1.5 mL 離心管中，同時加入500 μL 已稀釋好的FHV-1 病毒液，輕輕搖晃混合后于37 ℃孵育1 h；取長滿單層F81 細胞的96 孔細胞培養(yǎng)板，倒出生長液，將血清病毒混合液加入到96 孔板中，每孔100 μL，每個稀釋度重復5 個孔，同時設置陰性血清對照、病毒對照和正常細胞對照；于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，顯微鏡下觀察CPE。按照Reed-Muench法，計算待測血清樣品的中和抗體效價。

1.2.5 檢測結(jié)果分析 統(tǒng)計所有被調(diào)查貓的病毒攜帶率，對不同來源、年齡和性別貓的檢測結(jié)果，采用SPSS 26.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，比較組間差異，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義；以中和抗體效價大于1:8 為陽性，等于1:8為可疑，小于1:8 為陰性[13]，統(tǒng)計不同來源血清樣本的抗體陽性率。

2 結(jié)果

2.1 PCR 檢測 電泳結(jié)果（圖1）顯示，218 份貓樣本中有22 份樣本擴增到約1 125 bp 的陽性目的條帶，對該22 份樣品進行復檢，仍均為FHV-1陽性，陽性率為10.1%（22/218）。

2.2 不同來源貓樣品檢測結(jié)果統(tǒng)計

22 份FHV-1 陽性樣品中，來自寵物救助站的4 份，陽性率為16.7%，檢出率最高，來自寵物貓主人家的6 份，檢出率為7.5%，但各組間均無顯著性差異（P＞0.05）。具體結(jié)果見表1。

表1 不同來源樣品的FHV-1 檢測結(jié)果

2.3 不同年齡和性別貓樣品檢測結(jié)果統(tǒng)計

從年齡來看，2～6 月齡幼貓的FHV-1 陽性率為13.6%，略高于成年貓（7.0%），但兩組間無顯著性差異（P＞0.05）；從性別來看，成年公貓陽性率（7.3%）稍高于成年母貓（6.7%），兩者亦無顯著性差異（P＞0.05）。詳見表2。

表2 不同性別和年齡貓的FHV-1 檢測結(jié)果

2.4 血清樣品抗體檢測結(jié)果統(tǒng)計 按照1.2.3 的方法計算出病毒懸液的TCID50為10-6.5/0.1 mL。在40份寵物醫(yī)院提供的血清樣本中，檢出陽性26 份，檢出率為65.0%（26/40）。20 份寵物救助站提供的血清樣本中，檢出陽性14 份，檢出率為70.0%（14/20）。血清中和抗體效價檢測詳見表3～4。

表3 寵物醫(yī)院40 份血清中和抗體檢測結(jié)果

表4 寵物救助站20 份血清中和抗體檢測結(jié)果

3 討論

Gourkow 等[14]在2013 年對加拿大西部一家動物收容所的250 只患有上呼吸道感染的流浪貓進行了FHV-1 qPCR 檢測，發(fā)現(xiàn)不高于3%的貓感染了FHV-1。2017 年Fernandez 等[15]對從西班牙多家動物醫(yī)院收集的358 只出現(xiàn)結(jié)膜炎和上呼吸道疾病的家養(yǎng)貓眼鼻口拭子進行了qPCR 檢測，結(jié)果FHV-1 陽性檢出率為15.1%。Nguyen 等[16]2019 年對從澳大利亞多家動物醫(yī)院收集的3 142 只出現(xiàn)上呼吸道疾病的家貓進行了PCR 檢測，結(jié)果FHV-1陽性檢出率為7%。FHV-1 呈間歇性排毒，多數(shù)情況下潛伏在三叉神經(jīng)節(jié)，因此PCR 檢測結(jié)果與感染時間及排毒情況有關(guān)，呈一過性。本調(diào)查結(jié)果顯示，青島市FHV-1 的PCR 檢測陽性率為10.1%，寵物救助站貓的陽性率（16.7%）略高于其他來源貓，可能與來源復雜有關(guān)。2～6 月齡幼貓的FHV-1陽性檢出率較高，可能因其斷奶后失去母源抗體保護，而自身免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育健全，所以應加強對斷奶后幼貓的相關(guān)免疫。

2012 年Digangi 等[17]對進入佛羅里達動物收容所的貓，針對FHV-1 的血清抗體滴度進行了流行率調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)347 只貓的血清陽性率為11.0%。2019 年P(guān)aola 等[18]對意大利米蘭流浪貓中抗皰疹病毒的血清抗體滴度進行了流行率調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該地區(qū)流浪貓中抗皰疹病毒的血清陽性率為37.1%。本研究采用的中和抗體檢測方法，是抗體檢測的經(jīng)典方法，也是“金標準”方法，既能定性也能準確定量。檢測結(jié)果顯示，寵物醫(yī)院接診貓的FHV-1 中和抗體陽性率為65.0%，雖然部分貓的抗體效價達到1:512，但抗體整齊度很差，且有35.0%貓的抗體滴度達不到最低保護標準，存在感染發(fā)病風險。跟蹤調(diào)查這40 份寵物醫(yī)院接診貓的免疫背景，有32 只貓免疫過FHV-1 疫苗，但有12只抗體呈陰性，表明抗體保護水平不高，因此應加強對寵物貓的免疫。寵物貓免疫FHV-1 疫苗后，有必要進行中和抗體效價測定，中和抗體效價不合格的需要補免。救助站收容貓的FHV-1 中和抗體陽性率高達70%，但抗體效價均較低，僅能達到1:16，有些可能是臨床發(fā)病康復后產(chǎn)生的抗體，然而救助站收容貓的抗原、抗體陽性率均較高，說明救助站收容貓的FHV-1 感染率很高，所以應加強對救助站收容貓的相關(guān)免疫。

本研究的采樣范圍和樣本數(shù)量有限，調(diào)查樣本基本來自寵物醫(yī)院、寵物救助站、寵物貓主人家和寵物市場，缺乏城市流浪貓、郊區(qū)野貓和林區(qū)山貓等不同背景的數(shù)據(jù)，這些問題有待于在更長時間段、更大范圍的數(shù)據(jù)收集基礎上進行探討，以便得出更加客觀真實的結(jié)果。FVR 作為貓的常見病，嚴重影響貓科動物生活質(zhì)量，甚至有致死風險，然而目前尚無特效療法，僅以預防為主。國內(nèi)現(xiàn)有疫苗數(shù)量很少，應盡快研制國產(chǎn)FHV-1 相關(guān)疫苗，以解決疫苗短缺及免疫失敗問題，更好地防控FHV-1 相關(guān)疾病。