彭雯杰　詹伊婧　雷鵬　孫濤　錢家熠　徐虹

摘要： 對(duì)從健康草莓根際中分離出的一株阿斯青霉菌XK-12（Penicilium asturianum），進(jìn)行了產(chǎn)鐵載體的定性和定量分析，鑒定其所產(chǎn)鐵載體為異肟羥酸型鐵載體。并對(duì)XK-12產(chǎn)鐵載體發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，利用其發(fā)酵液測定了鐵載體對(duì)病原菌的抑制效果。結(jié)果表明，阿斯青霉菌XK-12產(chǎn)鐵載體的最佳發(fā)酵條件為：3.0% NH4Cl為氮源，2.0%葡萄糖為碳源，添加0.10% L-鳥氨酸鹽酸鹽，培養(yǎng)基中不含F(xiàn)e3+，初始pH 6.0，溫度28 ℃，250 ml培養(yǎng)瓶裝液量為70 ml，發(fā)酵周期為168 h;在此條件下，XK-12產(chǎn)鐵載體最高能達(dá)到0.173 mg/ml。在添加20% （體積分?jǐn)?shù)）XK-12鐵載體發(fā)酵液條件下，XK-12鐵載體發(fā)酵液對(duì)草莓根腐病病原菌葡萄座腔菌（Neofusicoccum kwambonambiense XKD-1）的抑制率達(dá)到了100%。

關(guān)鍵詞： 阿斯青霉;鐵載體;發(fā)酵優(yōu)化;拮抗作用

中圖分類號(hào)： S482.2+92 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2022）01-0073-08

Abstract： The qualitative and quantitative analyses of siderophores production were carried out on Penicilium asturianum XK-12 isolated from healthy strawberry rhizosphere. The siderophores produced by XK-12 were identified as hydroxamic acid-type siderophores， and the conditions for producing siderophores were optimized. Finally， the fermentation broth of XK-12 was used to determine the inhibitory effect of siderophores on a pathogen. The results showed that the best fermentation conditions for siderophores production by XK-12 were as follows： 3.0% NH4Cl was used as nitrogen source， 2.0% glucose was used as carbon source， 0.10% of L-ornithine hydrochloride was added， there was no Fe3+ in the medium， the initial pH was 6.0， the temperature was 28 ℃， the liquid volume in 250 ml flask was 70 ml， and the fermentation period was 168 h. Under these conditions， 0.173 mg/ml siderophores could be obtained. Under the condition of adding 20% （volume fraction） XK-12 fermentation broth， the inhibition rate of fermentation broth on strawberry root rot pathogen Neofusicoccum kwambonambiense was 100%.

Key words： Penicilium asturianum;siderophore;fermentation optimization;antagonism

鐵（Fe）是一種重要的植物營養(yǎng)元素，大多數(shù)細(xì)胞的代謝過程中都有它的參與，在植物生長過程中發(fā)揮著重要作用，主要參與了植物的呼吸作用、光合作用、氮固定以及DNA合成等[1]。鐵在地殼中的含量豐富，在所有元素中處于第4位，在多數(shù)土壤中鐵的含量非常豐富，但大部分鐵都以水解后形成的Fe（OH）3形式存在，而植物無法直接吸收和利用這些鐵[2-3]。大部分的細(xì)菌和真菌都可以分泌鐵載體，微生物鐵載體對(duì)Fe3+具有極高親和力，能協(xié)助植物從土壤環(huán)境中獲取并利用鐵，為植物的生長提供有力保障 [4]。鐵載體結(jié)構(gòu)多樣，按特征基團(tuán)來分可以大致分為4種類型[5]。細(xì)菌鐵載體的結(jié)構(gòu)多樣，但真菌鐵載體大多為異羥肟酸型，它們大多擁有相似的生物合成途徑，且真菌異羥肟酸型鐵載體是以Nδ-酰基-Nδ-羥基-鳥氨酸為基本單位組成的[6]。這些真菌和細(xì)菌能夠通過分泌鐵載體來螯合土壤中的鐵元素，形成Fe-鐵載體螯合物來供給自身生長，還可以與植物病原菌競爭生存必要的鐵元素來抑制病原菌的生長[7-9]。目前國內(nèi)外對(duì)鐵載體的應(yīng)用研究主要集中在農(nóng)業(yè)、漁業(yè)、重金屬修復(fù)、核燃料后處理、紙漿漂白、生物傳感等方面[10-13]。

本試驗(yàn)以前期從健康草莓根際中篩選得到的一株產(chǎn)鐵載體的植物生防真菌阿斯青霉菌XK-12為試驗(yàn)菌株，對(duì)所產(chǎn)鐵載體類型進(jìn)行鑒定，對(duì)其產(chǎn)鐵載體的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最后用優(yōu)化后的除菌發(fā)酵液考察對(duì)病原菌的拮抗效果，為植物病害防治產(chǎn)品的研發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 分離自草莓健康植株根際的阿斯青霉菌（Penicilium asturianum）XK-12以及草莓根腐病病原菌葡萄座腔菌（Neofusicoccum kwambonambiense XKD-1）均保存于南京工業(yè)大學(xué)材料化工國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基的配制 發(fā)酵培養(yǎng)基：NH4Cl 0.250 0 g，蔗糖25.000 0 g，檸檬酸 1.000 0 g，Na2HPO4·H2O 0.125 0 g，KH2PO4 0.075 0 g，MgSO4 0.080 0 g，CaCl2 0.002 0 g，NaH2PO4·H2O 0.590 5 g，pH 6.8，1 000 ml水，115 ℃滅菌20 min。配制鉻天青（CAS）檢測液[14]。將配好的CAS檢測液轉(zhuǎn)入試劑瓶并用錫紙包裹，121 ℃滅菌15 min，避光保存。配制產(chǎn)鐵載體瓊脂培養(yǎng)基，滅菌后待培養(yǎng)基溫度降至60 ℃以下，吸取已滅菌的CAS檢測液以5%的比例緩慢加入到產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基中，輕輕晃勻，避免產(chǎn)生氣泡，再倒平板，待冷卻凝固后使用。

1.1.3 主要試劑 L-鳥氨酸鹽酸鹽，Acros公司產(chǎn)品;L-天冬氨酸，上海源葉生物公司產(chǎn)品;L-谷氨酸，上海源葉生物公司產(chǎn)品;氯化鐵，上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)品;高氯酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品;甲磺酸去鐵胺，上海源葉生物公司產(chǎn)品;鉻天青S，Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 紫外可見分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司產(chǎn)品;立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品;精密pH計(jì)，上海雷磁儀器廠產(chǎn)品;隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海善治儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品;標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備廠產(chǎn)品;回轉(zhuǎn)恒溫?fù)u床，上海第一自動(dòng)化設(shè)備公司產(chǎn)品。

1.2 菌株產(chǎn)鐵載體的定性分析

CAS法[15]確定XK-12是否能產(chǎn)鐵載體。

1.3 菌株產(chǎn)鐵載體的定量分析

通過Arnow’s法[16]、高氯酸鐵分光光度法[17]、分光光度法[18]對(duì)鐵載體的類型進(jìn)行初步判斷并定量分析。

1.3.1 甲磺酸去鐵胺標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 配制5 mmol/L FeCl3-0.1 mol/L HClO4（pH 2）溶液：稱取0.811 g FeCl3于1 L去離子水中溶解，加入8.58 ml HClO4，調(diào)pH為2，避光保存。取0.5 ml阿斯青霉菌XK-12除菌發(fā)酵液（過0.22 μm膜）與2.5 ml 5 mmol/L FeCl3-0.1 mol/L HClO4（pH 2）溶液混合，靜置顯色30 min，以發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對(duì)照，進(jìn)行全波長掃描，確定最大吸收波長（ODmax）。稱取1.0 mg 甲磺酸去鐵胺（Deferoxamine）標(biāo)準(zhǔn)品，溶于1.0 ml去離子水中，將其稀釋成7個(gè)質(zhì)量濃度梯度（0 mg/ml，0.05 mg/ml，0.10 mg/ml，0.25 mg/ml，0.50 mg/ml，0.75 mg/ml，1.00 mg/ml）。取各質(zhì)量濃度甲磺酸去鐵胺標(biāo)準(zhǔn)品0.5 ml，加入2.5 ml 5 mmol/L FeCl3-0.1 mol/L HClO4（pH 2）溶液，測定其ODmax下的OD值，以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，繪制鐵載體標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 鐵載體含量測定 取0.5 ml阿斯青霉菌XK-12除菌發(fā)酵液與2.5 ml 5 mmol/L FeCl3-0.1 mol/L HClO4（pH 2）溶液混合，測定其ODmax下的OD值，根據(jù)方法1.3.1中的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算阿斯青霉XK-12鐵載體產(chǎn)量。

1.4 孢子懸液的制備

將PDA液體培養(yǎng)的阿斯青霉菌XK-12涂布到PDA平板，并在28 ℃下培養(yǎng)5 d，待阿斯青霉菌菌絲鋪滿整個(gè)平板并生出大量綠色孢子，吸取適量無菌水加入平板，用接種環(huán)刮下孢子，使其充分混勻。將平板上的孢子液轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中，稀釋至1×107CFU/ml。

1.5 培養(yǎng)基成分對(duì)鐵載體產(chǎn)量的影響

在產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基中，接種2%的孢子懸液，將氯化銨、磷酸二氫銨、硫酸銨、乙酸銨、草酸銨分別作為氮源，以D-果糖、葡萄糖、D-麥芽糖、蔗糖、乳糖分別作為碳源，在培養(yǎng)溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min的條件下培養(yǎng)5 d后，用方法1.3.2計(jì)算鐵載體產(chǎn)量，分析比較采用不同碳、氮源對(duì)阿斯青霉菌XK-12產(chǎn)鐵載體的影響，并在確定最佳碳、氮源后設(shè)置9組質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度（1%～9%），在培養(yǎng)溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min的條件下培養(yǎng)5 d后確定最佳碳、氮源質(zhì)量分?jǐn)?shù)。向產(chǎn)鐵載體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入Fe3+，使培養(yǎng)基中Fe3+終濃度分別為0 μmol/L、0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、1.5 μmol/L、2.0 μmol/L，培養(yǎng)5 d后，測定鐵載體產(chǎn)量，確定培養(yǎng)基中Fe3+濃度對(duì)XK-12鐵載體產(chǎn)量的影響。將產(chǎn)鐵載體發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后，加入經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后的不同氨基酸， T1組培養(yǎng)基中不添加氨基酸（對(duì)照），T2組培養(yǎng)基中加入0.10% L-鳥氨酸鹽酸鹽，T3組培養(yǎng)基中加入0.10% L-天冬氨酸，T4組培養(yǎng)基中加入0.10% L-谷氨酸，T5組培養(yǎng)基中加入0.05% L-鳥氨酸鹽酸鹽與0.05% L-谷氨酸，T6組培養(yǎng)基中加入0.05% L-天冬氨酸與0.05% L-谷氨酸混合物，在培養(yǎng)溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min的條件下培養(yǎng)5 d后，確定不同氨基酸對(duì)鐵載體產(chǎn)量的影響。

1.6 培養(yǎng)條件對(duì)鐵載體產(chǎn)量的影響

使用方法1.5中確定碳、氮源后的培養(yǎng)基，在20 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、35 ℃溫度下培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)速為200 r/min的條件下培養(yǎng)5 d后，通過方法1.3.2測定鐵載體產(chǎn)量，并確定最佳培養(yǎng)溫度。使用碳、氮源優(yōu)化后的培養(yǎng)基，分別調(diào)節(jié)初始pH為5、6、7、8、9，在培養(yǎng)溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min的條件下培養(yǎng)5 d后，通過方法1.3.2測定鐵載體產(chǎn)量來確定培養(yǎng)基最佳初始pH。使用碳、氮源優(yōu)化后的培養(yǎng)基，分別以不同裝液量（30 ml、50 ml、70 ml、90 ml、110 ml）在250 ml的三角瓶中培養(yǎng)，在培養(yǎng)溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min的條件下以方法1.3.2測定鐵載體產(chǎn)量。

1.7 不同條件下鐵載體產(chǎn)量的時(shí)間曲線測定

使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件，設(shè)置3組試驗(yàn)，第1組加入為0.10%的鳥氨酸鹽酸鹽，第2組加入Fe3+使其終濃度為2.0 μmol/L，第3組兩者都不加（對(duì)照）。使用方法1.3.2，每24 h測定一次各組鐵載體產(chǎn)量，并繪制其在不同條件下鐵載體產(chǎn)量的時(shí)間曲線，確定阿斯青霉菌XK-12產(chǎn)鐵載體的最佳時(shí)間。

1.8 阿斯青霉菌XK-12鐵載體發(fā)酵液對(duì)病原菌生長的影響

將以上試驗(yàn)中得出的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件綜合起來進(jìn)行阿斯青霉菌發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)0.22 μm濾膜除菌，將發(fā)酵液分別按終濃度0、5%、10%、15%、20%（體積分?jǐn)?shù)）的比例添加到滅菌后的PDA培養(yǎng)基中混勻并倒平板。培養(yǎng)基凝固后，用直徑8 mm的打孔器將病原菌平板打孔并倒置接種到含鐵載體的PDA平板中央，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d后，采用十字交叉法測量病原菌菌落直徑，并計(jì)算各平板病原菌的抑制率[7]。

1.9 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS Statistics軟件進(jìn)行方差分析（P<0.05），計(jì)算所有均值的標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿斯青霉菌XK-12產(chǎn)鐵載體種類

取阿斯青霉菌XK-12發(fā)酵液，過膜除菌后吸取50 μl加入到打孔器打孔的CAS檢測平板上，置于暗處反應(yīng)30 min后平板出現(xiàn)橙紅色反應(yīng)圈（圖1），說明XK-12菌株能產(chǎn)鐵載體。

在高氯酸鐵試驗(yàn)中，由XK-12制備的鐵載體溶液顏色能夠立即發(fā)生變化呈紅色，并在495 nm處出現(xiàn)吸收峰，說明該菌能夠產(chǎn)生異羥肟酸型鐵載體，因此阿斯青霉XK-12所產(chǎn)的鐵載體為異羥肟酸型鐵載體。

2.2 阿斯青霉菌XK-12鐵載體標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過全波長掃描，確定XK-12菌株所產(chǎn)鐵載體的最大光吸收值在495 nm處，因此，我們?cè)谧畲笪庵堤幹谱飨鄳?yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），依照此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算出菌株產(chǎn)鐵載體的量。

2.3 培養(yǎng)基成分對(duì)阿斯青霉菌XK-12產(chǎn)鐵載體的影響

2.3.1 不同氮源及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)鐵載體產(chǎn)量的影響 由圖3可知，XK-12鐵載體產(chǎn)量在不同氮源下有顯著差異，磷酸二氫銨和草酸銨作為氮源時(shí)，鐵載體產(chǎn)量最低，而氯化銨作為氮源時(shí)，鐵載體產(chǎn)量最高。進(jìn)一步對(duì)氯化銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)鐵載體產(chǎn)量的影響進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，隨著氯化銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，鐵載體產(chǎn)量先上升后下降，當(dāng)氯化銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0%時(shí)，阿斯青霉菌XK-12的鐵載體產(chǎn)量最高，為0.145 mg/ml。

2.3.2 不同碳源及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)鐵載體產(chǎn)量的影響 由圖4可知，XK-12鐵載體產(chǎn)量在不同碳源下有顯著差異，D-麥芽糖作為碳源時(shí)鐵載體產(chǎn)量最低，葡萄糖作為碳源時(shí)鐵載體產(chǎn)量最高。通過研究葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)鐵載體產(chǎn)量的影響發(fā)現(xiàn)，隨著葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，鐵載體產(chǎn)量先上升后下降，當(dāng)葡萄糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%時(shí)，阿斯青霉菌XK-12的鐵載體產(chǎn)量最高，達(dá)到0.134 mg/ml。

2.3.3 不同氨基酸對(duì)鐵載體產(chǎn)量的影響 由圖5可知，與對(duì)照相比，當(dāng)培養(yǎng)基中添加0.10%的L-鳥氨酸鹽酸鹽時(shí)，阿斯青霉菌XK-12菌株的鐵載體產(chǎn)量明顯提高，產(chǎn)物質(zhì)量濃度最高達(dá)到0.106 mg/ml;當(dāng)培養(yǎng)基中加入0.10%的L-天冬氨酸時(shí)，XK-12菌株的鐵載體產(chǎn)量也有明顯提高，產(chǎn)物質(zhì)量濃度達(dá)到0.097 mg/ml;培養(yǎng)基中單獨(dú)添加L-谷氨酸時(shí)XK-12鐵載體產(chǎn)量最低;加L-鳥氨酸鹽酸鹽和L-谷氨酸的混合物時(shí)，鐵載體產(chǎn)量與對(duì)照相比無顯著差異;添加L-天冬氨酸和L-谷氨酸的混合物時(shí)，鐵載體產(chǎn)量與對(duì)照相比也無顯著差異。

2.3.4 不同鐵離子濃度對(duì)鐵載體產(chǎn)量的影響 由圖6可知，F(xiàn)e3+濃度能對(duì)XK-12鐵載體的產(chǎn)量產(chǎn)生顯著影響，在完全不添加Fe3+的培養(yǎng)基中，XK-12產(chǎn)鐵載體產(chǎn)量最高，能達(dá)到0.122 mg/ml。隨著鐵濃度的增加，XK-12菌株產(chǎn)鐵載體產(chǎn)量逐漸減少，這也反映了XK-12在低鐵條件下產(chǎn)鐵載體的特性。

2.4 裝液量對(duì)阿斯青霉菌XK-12產(chǎn)鐵載體的影響

由圖7可知，裝液量與XK-12菌株液態(tài)發(fā)酵鐵載體產(chǎn)量關(guān)系密切。隨著裝液量的逐漸增加，鐵載體產(chǎn)量先升高，在裝液量為70 ml時(shí)達(dá)到最高后下降。XK-12鐵載體產(chǎn)量最高為0.145 mg/ml。

2.5 初始pH對(duì)阿斯青霉菌XK-12產(chǎn)鐵載體的影響

由圖8可知，XK-12鐵載體的分泌隨著培養(yǎng)基初始pH的增大呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。XK-12菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為5時(shí)鐵載體產(chǎn)量較低，pH為6時(shí)，XK-12菌株產(chǎn)鐵載體量最大，達(dá)到0.147 mg/ml，之后阿斯青霉菌XK-12產(chǎn)鐵載體能力隨著pH的增大逐漸降低，當(dāng)初始pH為9時(shí)，鐵載體的產(chǎn)量最低。

2.6 培養(yǎng)溫度對(duì)阿斯青霉菌XK-12產(chǎn)鐵載體的影響

由圖9可知，阿斯青霉菌XK-12在20～35 ℃培養(yǎng)均可產(chǎn)鐵載體;在20～28 ℃，隨著培養(yǎng)溫度的升高，鐵載體產(chǎn)量逐漸提高，當(dāng)培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí)，XK-12鐵載體產(chǎn)量最高，為0.156 mg/ml;28～35 ℃，隨著溫度升高鐵載體產(chǎn)量顯著下降。說明溫度在XK-12鐵載體分泌中有重要影響，在真菌的最適生長溫度范圍（25～30 ℃）內(nèi)，鐵載體產(chǎn)量較高，培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí)最利于XK-12產(chǎn)鐵載體。

2.7 不同條件下阿斯青霉菌XK-12鐵載體產(chǎn)量的時(shí)間曲線

由圖10可知，在3種不同條件下，在培養(yǎng)168 h時(shí)阿斯青霉菌XK-12鐵載體產(chǎn)量最高。添加L-鳥氨酸鹽酸鹽能大大提高XK-12產(chǎn)鐵載體產(chǎn)量，能達(dá)到0.173 mg/ml;而添加Fe3+則明顯降低了鐵載體的產(chǎn)量，僅為0.063 mg/ml。與對(duì)照相比，添加L-鳥氨酸鹽酸鹽能使XK-12鐵載體產(chǎn)量提高49.2%，而添加Fe3+使鐵載體產(chǎn)量下降了45.2%，進(jìn)一步證明了培養(yǎng)基成分中Fe3+和L-鳥氨酸鹽酸鹽是影響XK-12產(chǎn)鐵載體的重要因素，與文獻(xiàn)[23]的結(jié)論相同。

2.8 阿斯青霉菌XK-12鐵載體發(fā)酵液對(duì)致病菌生長的影響

由圖11可以看出，阿斯青霉菌XK-12鐵載體發(fā)酵濾液對(duì)草莓根腐病病原菌Neofusicoccum kwambonambiense XKD-1具有較強(qiáng)的抑制作用，添加5%、10%、15%、20%鐵載體發(fā)酵液的PDA平板對(duì)XKD-1病原菌的抑制率分別為36.96%±0.01%、99.42%±0.12%、100%、100%，15%、20%鐵載體發(fā)酵液添加量與5%添加量和10%添加量之間差異顯著。隨著發(fā)酵液添加量的增加，XK-12鐵載體發(fā)酵液對(duì)病原菌XKD-1抑制率增大。在添加10%加Fe3+ XL-12鐵載體發(fā)酵液時(shí)，病原菌生長不受抑制，說明對(duì)病原菌XKD-1的抑制效果是XK-12鐵載體在起作用。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)對(duì)阿斯青霉菌XK-12產(chǎn)鐵載體進(jìn)行了研究，鑒定XK-12所產(chǎn)鐵載體為異肟羥酸型鐵載體。對(duì)影響XK-12鐵載體分泌的幾個(gè)影響因子進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)碳、氮源種類及質(zhì)量分?jǐn)?shù)、初始pH、溫度、裝液量、發(fā)酵時(shí)間對(duì)其鐵載體產(chǎn)量有顯著影響，且在低鐵脅迫下XK-12能產(chǎn)生更多的鐵載體，這種現(xiàn)象可能是微生物為了獲得足夠的鐵營養(yǎng)來為自身的生長營造有利環(huán)境，被迫啟動(dòng)鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，產(chǎn)生更多的鐵載體來競爭自然界中的鐵元素[19-20]。在本試驗(yàn)中，添加0.10%的L-鳥氨酸鹽酸鹽能顯著提高XK-12鐵載體的產(chǎn)量，L-鳥氨酸鹽酸鹽是真菌合成異羥肟酸型鐵載體第1步的原料[21]，因此，L-鳥氨酸鹽酸鹽對(duì)XK-12菌株的鐵載體生產(chǎn)可能有重要的作用。Wang等[22]對(duì)海洋酵母HN6.2產(chǎn)鐵載體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加Fe3+抑制了編碼鳥氨酸N5-加氧酶的羥化酶基因的表達(dá)，而在添加鳥氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的酵母細(xì)胞中羥化酶基因的表達(dá)增強(qiáng)。汪少林在對(duì)真菌鐵載體發(fā)酵條件的研究中發(fā)現(xiàn)固體發(fā)酵培養(yǎng)相較于液體發(fā)酵培養(yǎng)，粗提物的產(chǎn)出更高，幾種真菌中FECH-031產(chǎn)量最高，為32 mg/g，F(xiàn)ECH-050產(chǎn)量最低，為12 mg/g[23]。Wang等[22]在對(duì)海洋普魯蘭類酵母（Aureobasidium pullulans）HN6.2產(chǎn)鐵載體的培養(yǎng)基優(yōu)化中，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加鳥氨酸能顯著提高鐵載體的產(chǎn)量，同時(shí)添加Fe3+后明顯抑制了鐵載體的產(chǎn)量，在優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)條件下，菌株最大鐵載體產(chǎn)量能達(dá)到1.1 mg/ml。

從抑菌試驗(yàn)的結(jié)果可以看出，對(duì)照平板和10%加Fe3+ XK-12鐵載體發(fā)酵液平板上病原菌XKD-1生長情況幾乎一致，說明螯合足量鐵后的鐵載體失去了螯合平板中鐵離子的能力，病原菌生長所需的鐵元素未被奪去，可以正常生長。添加不同含量XK-12鐵載體發(fā)酵液的PDA平板對(duì)草莓根腐病病原菌Neofusicoccum kwambonambiense XKD-1有較強(qiáng)的抑制作用，且隨著發(fā)酵液用量的增大，抑制作用更明顯。由于微生物之間存在營養(yǎng)競爭[24-25]，生防微生物可以通過分泌具有螯合能力大于病原菌鐵載體的鐵載體來競爭土壤中微生物生長必需的的鐵元素，從而達(dá)到抑制病原菌生長的目的。張科立[26]從香蕉根際分離出內(nèi)生菌勞爾氏菌（Ralstonia sp.），發(fā)現(xiàn)該菌株產(chǎn)鐵載體能力強(qiáng)，通過平板對(duì)峙試驗(yàn)對(duì)其抗病活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，測得該菌對(duì)病原鐮刀菌的抑制率為73.2%。沈冰冰[27]在小麥和玉米種植地土壤中篩選出一株產(chǎn)鐵載體真菌YZ9，在平板拮抗試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)對(duì)玉米大斑病病原菌（Exserohilum tarcicum）和玉米莖腐病病原菌（Fusarium graminearum）的抑制率分別為64%和79%。趙榮艷等[8]從根際分離出一株產(chǎn)鐵載體真菌黃藍(lán)狀菌z-15（Talaromyces flavu），在體外試驗(yàn)中，對(duì)蒜薹炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、水稻惡苗病菌（Fusarium moniliforme）、小麥根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）3種病原菌均有一定拮抗效果，抑制率均超過20%，其發(fā)酵液對(duì)小麥根腐病菌的生長抑制效果較為顯著，最高抑制率達(dá)50.9%，并能有效抑制3種病原菌孢子萌發(fā)率，分別為100.0%、98.3%和81.2%。從根際分離到一株銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）FP6，其鐵載體對(duì)立枯絲核菌（Rhizoctonia Solani）和膠孢炭疽菌（Colletotrichum Gloeosporioides）作用明顯，但對(duì)膠孢子菌（C. gloeosporioides）無明顯抑制[8，28]。由此可見，鐵載體可以用于病原菌的防治，阿斯青霉菌XK-12在抗病促生長方面有著較大的應(yīng)用潛力。

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（責(zé)任編輯：張震林）

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