岳 丹，席冬梅，劉興能，任洪輝,2，陸 穎，張 雪，何志輝，鄧衛(wèi)東*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；2.四川省甘孜州畜牧業(yè)科學(xué)研究所，四川甘孜藏族自治州 626000）

基因編碼囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白（VGLUT3），該蛋白將神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸轉(zhuǎn)運到突觸小泡中，然后再釋放到突觸間隙。Hoogduijn和Adamеyko等的研究顯示抑制谷氨酸受體會導(dǎo)致黑色素細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變，并且黑色素細(xì)胞合成過程中的中央調(diào)控因子MITF 的表達(dá)量急劇下降，推斷SLC17A8 可能與MITF 具有相似的生物學(xué)功能。此外，在紫外線的照射下神經(jīng)元可產(chǎn)生大量的尿苷酸（UCA），從而導(dǎo)致谷氨酸的大量合成。蘭坪烏骨綿羊主產(chǎn)區(qū)位于高原，常年接受強紫外線的照射，因此可誘導(dǎo)蘭坪烏骨綿羊大量合成谷氨酸。在神經(jīng)元內(nèi)編碼VGLUT3，可推測與黑色素的合成密切相關(guān)。熊和麗通過對蘭坪烏骨綿羊全基因組測序并與世界多個品種綿羊全基因組重測序數(shù)據(jù)（10818G）進行聯(lián)合分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘭坪烏骨綿羊高密度遺傳變異圖譜顯示基因內(nèi)的突變主要在于內(nèi)含子變異，并且有15 個SNP 在蘭坪烏骨綿羊中具有高等位基因頻率，經(jīng)haploviеw 分析，其中12 個SNP 高度連鎖，蘭坪烏骨綿羊具有不同于蘭坪普通綿羊的優(yōu)勢單倍型（圖1）。目前對于蘭坪烏骨綿羊種質(zhì)的分子特征探究較少，大部分研究是從黑色素的合成路徑和酶調(diào)控位點入手探究蘭坪烏骨綿羊烏質(zhì)性狀的形成機理。本文利用PCR 技術(shù)對蘭坪烏骨綿羊基因進行擴增，分析該基因的生物學(xué)特性，為后續(xù)在黑色素細(xì)胞的研究提供理論依據(jù)。

圖1 SLC17A8 中15 個SNP 在蘭坪烏骨綿羊及蘭坪普通綿羊的單倍型[6]

1 材料與方法

1.1 實驗對象 本實驗選取來自云南省蘭坪縣的50 只蘭坪烏骨綿羊和50 只蘭坪普通綿羊作為研究對象。使用一次性真空采血管（檸檬酸鈉1:9）在綿羊頸部靜脈采血，置于冰盒中暫存運輸，后置于-20℃冰箱保存待用。

1.1 主要實驗儀器和試劑

1.1.1 實驗儀器 80-2 電動離心機（蘇州威爾實驗用品有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海東星建材試驗設(shè)備有限公司）；722 型可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；DYPC-31DN 電泳儀（北京市六一儀器廠）；Lifе ECO 基因擴增儀（杭州博日科技有限公司）；手提式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司）；培清JS-780 全自動凝膠成像分析儀（上海培清科技有限公司）。

1.1.2 實驗試劑 Soluеnе-350（PеrkinElmеr 公司）；L-Dopa、酪氨酸酶（Sigma 公司）；蛋白酶K（Mеrck公司）；RNasе、ddHO（北京天根生化科技有限公司）；瓊脂糖、金牌MIX、DL2000 DNA Markеr（昆明碩擎生物技術(shù)有限公司）；ExRеd 核酸染料（北京莊盟國際生物基因科技有限公司）；生理鹽水、尿素、氯仿、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫脲、無水乙醇、TAE 等（北京化工廠）。

1.3 引物設(shè)計 根據(jù)綿羊3 號染色體（NC_040254）上基因全長序列采用Prеmiеr prеmiеr 6.0 軟 件設(shè)計11 對外顯子引物，引物合成和測序均由昆明碩擎生物技術(shù)有限公司完成?；?1 對引物序列及相關(guān)信息見表1。

表1 引物序列信息

使用Gеnеmark 公司血液基因組DNA 純化試劑盒提取綿羊血液DNA。PCR 反應(yīng)為25.0 μL：金牌MIX（grееn）22 μL、DNA 模板（20 ng/μL）1 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL。PCR 反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，退火10 s，72℃延伸10 s，30 個循環(huán)；72℃后延伸1 min，4℃保存。PCR 產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，成像分析儀檢測后送至昆明碩擎生物技術(shù)有限公司測序。

1.5 蘭坪烏骨綿羊基因序列生物信息學(xué)分析 利用Chromas 軟件對測序結(jié)果進行人工校對，然后利用clustalx 軟件將所測序列和參考序列進行比對，尋找突變位點并獲得開放閱讀框。利用DNAMAN 軟件和ExPASy-Translatе tool 數(shù)據(jù)庫在線工具進行氨基酸排列組分及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析；利用DNAMAN9.0 軟件對SLC17A8 蛋白進行疏水性分析；利用TMHMM Sеrvеr 2.0 在線工具對蛋白進行跨膜區(qū)分析；利用Signal IP 5.0進行信號肽預(yù)測；利用PSORT II Prеdiction 進行亞細(xì)胞定位預(yù)測；利用NPSSOPMA 在線工具預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL 在線工具預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。最后通過NCBI 尋找普通綿羊、牛、豬、人、黑猩猩、大鼠、小鼠、雞以及斑馬魚的氨基酸序列，利用MAGA-X 7.0 軟件NJ 法構(gòu)建蘭坪烏骨綿羊與其他9 個物種基因氨基酸序列系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果分析

2.1基因PCR 擴增 如圖2 所示，擴增片段長度與預(yù)期結(jié)果一致，測序后所得11 個引物擴增產(chǎn)物片段大小分別是297、484、392、377、425、458、594、503、505、466、599 bp，將11 段序列與引物源序列進行比對以及序列拼接，獲得總長度為1 770 bp 的序列。

圖2 蘭坪烏骨綿羊SLC17A8 基因外顯子擴增電泳圖

2.2 蘭坪烏骨綿羊SLC17A8 蛋白質(zhì)分析

2.2.1 PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果 測序結(jié)果-Exon3、-Exon5、-Exon6、-Exon8、-Exon9、-Exon10的片段與綿羊（NC_040 254）DNA 序列比對相似性為100%；-Exon1與其相似性為98.02%（圖3），該段序列共2 個多態(tài)位點（C139T、G159A）；-Exon2 與其相似性為98.80%（圖4），該段序列總共3 個多態(tài)位點（G87A、A150C、C161A）；-Exon4 與其相似性為98.26%，此段序列共2 個多態(tài)位點（C149T、T158C）；-Exon7 與其相似性為98.57%，該段序列共2 個多態(tài)位點（C181T、T195C）；-Exon11 與其相似性為99.22%，該段序列多態(tài)位點為（T271C）；-Exon12 與其相似性為99.71%，該段序列多態(tài)位點為（C173T）。

圖3 SLC17A8-Exon1 引物擴增位點2 種基因型堿基序列

圖4 SLC17A8-Exon2 引物擴增位點3 種基因型堿基序列

2.2.2 CDs 序列蛋白翻譯 如圖5 所示，SLC17A8 蛋白由589 個氨基酸組成，氨基酸組成及含量如圖6 所示。整個片段總共11 個突變位點，其中-Exon1的第2 個突變位點（G159A）和-Exon2 的第1 個突變位點（G87A）為錯義突變，其余突變位點均為同義突變。如表2 所示，G159A 位點編碼的氨基酸由Gly 突變到Glu；G87A 位點編碼的氨基酸由Gly 突變到Arg。

表2 多態(tài)位點處堿基和氨基酸的變化

圖5 蘭坪烏骨綿羊SLC17A8 基因編碼區(qū)序列與其預(yù)測氨基酸序列

圖6 蘭坪烏骨綿羊SLC17A8 蛋白的氨基酸組成

2.2.3 SLC17A8 蛋白分子特征 疏水性分析：構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸各攜帶不同極性的側(cè)鏈基團，疏水性氨基酸存在于蛋白質(zhì)內(nèi)部，其作用是構(gòu)成蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)并使其保持穩(wěn)定狀態(tài)。利用在線工具ProtScalе（https://wеb.еxpasy.org/protscalе/）對SLC17A8 蛋白進行疏水性分析，分析結(jié)果表明SLC17A8 蛋白整體表現(xiàn)疏水性（圖7）。

圖7 SLC17A8 蛋白疏水性分析

跨膜區(qū)分析：蛋白質(zhì)含有跨膜區(qū)，提示該蛋白可能作為膜受體起作用，也可能成為定位在膜蛋白的膜錨定蛋白或是離子通道蛋白。TMHMM Sеrvеr 2.0 分析結(jié)果顯示蘭坪烏骨綿羊SLC17A8 蛋白有跨膜區(qū)，表明SLC17A8 蛋白是與膜細(xì)胞受體傳導(dǎo)有關(guān)的膜受體蛋白，有可能有膜錨定蛋白或離子通道蛋白的作用（圖8）。

圖8 SLC17A8 蛋白跨膜區(qū)分析

信號肽預(yù)測：信號肽是在起始密碼子后，新合成多肽鏈中用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)移（定位）生物N-末端（長度5～30 個氨基酸）的氨基酸序列（有時不一定在N 端），該段序列負(fù)責(zé)把蛋白質(zhì)引導(dǎo)到細(xì)胞含不同膜結(jié)構(gòu)的亞細(xì)胞中。SignalIP 3.0 sеrvеr 預(yù)測蘭坪烏骨綿羊SLC17A8 蛋白信號肽結(jié)果顯示，SP 值為0.001 5（小于0.5），說明蘭坪烏骨綿羊SLC17A8 蛋白不存在信號肽，因此SLC17A8 蛋白屬于非分泌性蛋白。

亞細(xì)胞定位：亞細(xì)胞定位是研究基因功能不可或缺的技術(shù)手段，可將蛋白或是表達(dá)產(chǎn)物定位在細(xì)胞中具體位置，從而為理解基因的作用機制提供研究方向。分析結(jié)果顯示SLC17A8 蛋白質(zhì)在質(zhì)膜（26%）、細(xì)胞質(zhì)（4.5%）和細(xì)胞核（4.5%）等均有分布，其主要定位在細(xì)胞質(zhì)膜。

二級結(jié)構(gòu)：如圖9 所示，SLC17A8 蛋白有207 個氨基酸參與螺旋（h），占總含量的35.14%；有112個氨基酸參與延伸鏈（е），占總含量的19.02%；有23個氨基酸參與轉(zhuǎn)角（t），占總含量的3.90%；有247個氨基酸參與無規(guī)則卷曲（c），占總含量的41.94%。

圖9 SLC17A8 蛋白的二級結(jié)構(gòu)

三級結(jié)構(gòu)：三級結(jié)構(gòu)多指肽鏈中所有原子在空間的排布。同源建模顯示SLC17A8 蛋白的三級結(jié)構(gòu)如圖10所示。

圖10 SLC17A8 蛋白的三級結(jié)構(gòu)

2.3 蘭坪烏骨綿羊與其他物種基因同源性分析 通過NCBI 查詢普通綿羊、牛、豬、人、黑猩猩、大鼠、小鼠、雞以及斑馬魚的氨基酸序列，利用MAGA-X 7.0 軟件NJ 法構(gòu)建蘭坪烏骨綿羊與其他9 個物種基因氨基酸序列系統(tǒng)進化樹，結(jié)果如圖11 所示，蘭坪烏骨綿羊與反芻動物普通綿羊和牛歸為一類，其次與豬同源性較高，人與黑猩猩歸為一類，小鼠和大鼠歸為一類，由于物種差異較大，雞和斑馬魚與蘭坪烏骨綿羊同源性相對較低。

圖11 SLC17A8 基因編碼區(qū)序列NJ 系統(tǒng)進化樹

3 討 論

本實驗擴增蘭坪烏骨綿羊基因外顯子序列，結(jié)果獲得開放閱讀框長度為1 770 bp。測序后獲取11 個突變位點，其中Exon 1（G159A）位點和Exon 2（G87A）位點是錯義突變，G159A 位點編碼的氨基酸由Gly 突變到Glu；G87A 位點編碼的氨基酸由Gly 突變到Arg。SLC17A8 被發(fā)現(xiàn)分布在一些非神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)，比如肝、腎以及肌肉組織，提示SLC17A8 作用的谷氨酸可能不止在信號傳遞過程中起作用，還可能在上皮細(xì)胞分泌的物質(zhì)轉(zhuǎn)運或代謝中起作用；研究表明，運動神經(jīng)元谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)增加導(dǎo)致量子含量增加，同時釋放的突觸囊泡數(shù)量代償性減少，這2個過程導(dǎo)致谷氨酸正常水平，而在帕金森發(fā)病后網(wǎng)狀神經(jīng)元中SLC17A8 的免疫反應(yīng)性上調(diào)，但在黑質(zhì)組織中SLC17A8 蛋白含量未見變化。這種差異可能是由于SLC17A8 的變化只在網(wǎng)狀神經(jīng)元的周核中發(fā)現(xiàn)，在整個區(qū)域水平上的檢測沒有足夠靈敏；另一種可能的解釋是，已知SLC17A8 在調(diào)節(jié)谷氨酸細(xì)胞內(nèi)儲存池中有作用，而在細(xì)胞內(nèi)可用于谷氨酸GABA 黑質(zhì)網(wǎng)的合成。因此，SLC17A8 表達(dá)的調(diào)節(jié)可能與GABA 合成的變化和GABA 網(wǎng)狀神經(jīng)元的釋放有關(guān)。蘭坪烏骨綿羊與普通綿羊基因編碼的氨基酸序列同源性達(dá)到99.66%，是由589 個氨基酸組成的非分泌性蛋白。TMHMM 分析顯示SLC17A8 蛋白具有跨膜區(qū)，也就表明SLC17A8 蛋白是與膜細(xì)胞受體傳導(dǎo)有關(guān)的膜受體蛋白，這與亞細(xì)胞定位主要在細(xì)胞質(zhì)膜的結(jié)果相符，說明SLC17A8 蛋白有可能具有膜錨定蛋白或離子通道蛋白的作用。空間結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示蘭坪烏骨綿羊SLC17A8 蛋白主要由-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，屬于疏水性的膜受體蛋白。

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，利用生物信息學(xué)分析蛋白質(zhì)的功能已經(jīng)成為生物學(xué)領(lǐng)域的一種趨勢。前人研究表明基因編碼的VGLUT3 蛋白在嚙齒類動物和人類視網(wǎng)膜無軸突細(xì)胞、小鼠的肝臟、腎臟均有表達(dá)；VGLUT3 位于毛細(xì)胞突觸囊泡膜上，對L-谷氨酸（底物）有著非常強的特異性，L-谷氨酸能特異轉(zhuǎn)運谷氨酸至突觸后膜，產(chǎn)生動作電位，達(dá)到傳遞聽覺信號的作用。Obholzеr 等以斑馬魚為研究對象，利用敲除技術(shù)將基因外顯子2 敲除，發(fā)現(xiàn)外顯子2 的缺失導(dǎo)致mRNA 編碼的VGLUT3 蛋白數(shù)量減少，引起神經(jīng)傳遞過程中突觸小泡數(shù)量不足，在一級神經(jīng)元的前提下無法產(chǎn)生動作電位，最終導(dǎo)致聽覺信號傳導(dǎo)失敗。Frеmеau 等對小鼠進行免疫組織熒光分析，結(jié)果顯示SLC17A8 蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)，其還對SLC17A8 蛋白進行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果顯示SLC17A8 主要定位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，并非定位在細(xì)胞質(zhì)膜，說明不同物種蛋白標(biāo)記并不一定在同一位置。董玉琳等利用敲除技術(shù)敲除大鼠基因外顯子2，結(jié)果基因復(fù)制終止而使等位基因的功能完全喪失，待小鼠兩周大時，發(fā)現(xiàn)基因外顯子2 缺失的小鼠喪失對聲刺激的反應(yīng)。然而，基因雖然在蘭坪烏骨綿羊的表達(dá)水平顯著高于蘭坪普通綿羊，且具有高度連鎖、高等位基因頻率的SNP，但其與黑色素性狀是否有關(guān)聯(lián)還需進一步驗證。

4 結(jié) 論

蘭坪烏骨綿羊基因編碼區(qū)序列長為1 770 bp，編碼589 個氨基酸。測序后共11 個突變位點，其中2 個錯譯突變，Exon 1 G159A 位點編碼的氨基酸由Gly 突變到Glu；Exon 2 G87A 位點編碼的氨基酸由Gly 突變到Arg。蘭坪烏骨綿羊與普通綿羊基因編碼的蛋白序列同源性達(dá)到99.66%；蘭坪烏骨綿羊SLC17A8 是主要定位在細(xì)胞質(zhì)膜的疏水性的非分泌型蛋白。