益西拉姆 羅珍 達瓦 靳貴林 馮明科

（西藏藏醫(yī)藥大學(xué)，西藏 拉薩 850000）

石菖蒲為一味開竅醒神的良藥，其藥理的主要有效成分主要是揮發(fā)油提取物，其中含有揮發(fā)性成分α-細辛醚(α-asarone)、β-細辛醚(β-asarone)、甲基丁香酚(methy lequens)等物質(zhì)［1-3］。研究表明石菖蒲揮發(fā)油對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有興奮、抑制的雙向調(diào)節(jié)作用，藥理機制上保護神經(jīng)元、提高血腦屏障通透性的機理。石菖蒲揮發(fā)油除有較好的益智、腦保護作用外，對心血管系統(tǒng)有明顯的保護作用，且還有平喘、增強腸管蠕動、抑制嗎啡戒斷癥狀等作用［4-6］。

本研究旨在通過建立一種熒光探針進行特異性分析與檢測的分析模型，對石菖蒲的中的細辛醚進行分析鑒定與含量檢測。日漸成熟的熒光分析法由于操作簡單、特異性好、靈敏度高的特點，在推動民族醫(yī)藥的研究中越發(fā)重要。通過建立一種熒光探針分析檢測的方法，可以克服天然藥物成分復(fù)雜、難以分析鑒定的特點，能夠快速對其成分進行分析與含量測定，對于進一步研究該藥物的藥理作用提供了前提基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 所用試劑及儀器

試劑：石菖蒲產(chǎn)地四川，自然陰干后粉碎（過40目篩），β-細辛醚對照品（純度70%），美國Sigma-Al‐drich 公司，CO2為食品級［w（CO299.9%）］，其它試劑均為分析純。

儀器設(shè)備：1L 超臨界萃取裝置，來自中國廣州輕工研究所。所有的熒光光譜分析都是通過日立F-7000熒光分光光度計（日本東京）進行測定，激發(fā)和發(fā)射狹縫為5/5 nm，檢測池為1cm×1cm。紫外/可見吸收光譜由紫外-2450 分光光度計測定（日本東京），pHS-3C 數(shù)字pH 計用于測定溶液的pH 值（中國上海），絕對PL 量子產(chǎn)率光譜儀C11347（日本Hama‐matsu）用于測定量子產(chǎn)率，碳量子點的粉末通過Pi‐loFD8-4.3V（美國Charlotte）中進行凍干后獲得。

1.2 實驗方法

提取方法。超臨界CO2萃取法（SCE）:石菖蒲粉料200.00g,超臨界CO2流速2.5L/h,提取壓力6.0MPa，提取溫度45℃，恒溫恒壓萃取2h，出料得淺黃色透明液體，重復(fù)以上實驗3次，計算揮發(fā)油平均得率。

碳量子點的合成。0.5 g 尿素和1.0 g 二甲雙胍溶解在6 mL 的水中，將混合溶液依次轉(zhuǎn)移到25mL 內(nèi)襯聚四氟乙烯的不銹鋼高壓釜，隨后在180℃下反應(yīng)6h。冷卻至室溫后將粗產(chǎn)物溶解于10mL超純水中。將之前的溶液以3000 rpm離心3 min，將上清液用0.22 mm濾膜過濾以此除去較大的產(chǎn)物。再通過100 MWCO的透析膜透析12 h，最后通過凍干得到灰色的CDs粉末［7-12］。

樣品檢測。隨后將兩個平行的200 μL 的CDs（1 mg/mL）和800 μL 的DMF 依次加入1.5 mL 的樣品管中。將200 μL 的待測品（10-4M）加入到之前的溶液中并進行充分渦旋混合，然后將上述混合物分別孵育5min后進行熒光測定。

2 結(jié)果分析

2.1 表征與線性

首先對所制備的熒光碳量子點進行熒光光譜表征，從熒光光譜來看，所制備的碳量子點激發(fā)首先對所制備的CDs 進行表征，CDs 在400nm 激發(fā)時表現(xiàn)出最大發(fā)射波長455 nm 的藍色熒光（圖1A），此外可以觀察到CDs 在365 nm 的紫外下發(fā)出藍色熒光（圖1A a,b）。此外通過HR-TEM 圖像顯示所制備的CDs 類似于球形，通過DLS 可以測得直徑主要位于4～9 nm范圍內(nèi)，闡述了所合成的CDs 是均勻的且具備良好分散性（圖1B）。通過加入不同的細辛醚后掃描得到不同的熒光曲線（圖1C），可以看到響應(yīng)范圍從4×10-7M到6×10-4M 濃度下具有良好的線性范圍(圖1D)。通過擬合可以得到濃度與熒光強度的線性曲線，基于此建立了采用熒光碳量子點分析細辛醚的方法［13-15］。

2.2 樣品分析

將通過超臨界CO2萃取得到的揮發(fā)油樣品進行處理［16］，首先提取物通過DMF 溶解，經(jīng)過0.22 μm 的濾膜進行過濾，然后將溶液稀釋成不同濃度的樣品，稀釋至原溶液的10-6倍，加入將200 μL 的各種濃度的樣品加入到之前的溶液中并進行充分渦旋混合，然后將上述混合物分別孵育5min后進行熒光測定，將得到的結(jié)果與建立的回歸曲線進行擬合［17-20］，得到細辛醚含量結(jié)果如表1。

表1 細辛醚含量占比

從表1 的結(jié)果來看，通過超臨界萃取200g 的石菖蒲粉體大約能得到揮發(fā)油的量為2.2g，揮發(fā)油含量約為總體質(zhì)量的1%.與先前的文獻相比，超臨界萃取方法的提取率明顯高于蒸餾法以及微波法。通過熒光分析法計算出揮發(fā)油中細辛醚的含量為2.24 g 左右，占揮發(fā)油總量的70.89%.通過該方法對三次超臨界提取后揮發(fā)中的細辛醚進行分析，結(jié)果均具備良好的重現(xiàn)性，結(jié)果闡明了基于熒光量子點應(yīng)用于石菖蒲中揮發(fā)油的檢測的方法被成功建立。

3 結(jié)論

本研究基于所制備的熒光碳量子點對于細辛醚的特異性響應(yīng)，建立了不同濃度的細辛醚與熒光碳量子點的線性曲線，進而得到了細辛醚濃度對熒光強度之間的回歸方程。通過超臨界萃取法從石菖蒲中提取出揮發(fā)油，利用所擬合的回歸方程計算出揮發(fā)油中細辛醚的含量，結(jié)果表明石菖蒲揮發(fā)油中細辛醚含量占比為70%左右。分析結(jié)果體現(xiàn)了實驗中使用的該產(chǎn)地石菖蒲品質(zhì)較好。